Nghiên cứu nguồn gốc thực vật thành phần hóa học của vị thuốc hoàng lực thu hái tại bắc giang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ THỊ THÚY HÒA NGHIÊN CỨU NGUỒN GỐC THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA VỊ THUỐC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2013...

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THỊ THÚY HÒA

NGHIÊN CỨU NGUỒN GỐC THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA VỊ THUỐC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐỖ THỊ THÚY HÒA

NGHIÊN CỨU NGUỒN GỐC THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA VỊ THUỐC HOÀNG LỰC THU HÁI TẠI BẮC GIANG

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

MÃ SỐ: 60 72 04 06

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Viết Thân

HÀ NỘI 2013

Xin trân trọng cảm ơn các thày cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược liệu Trường Đại học Dược Hà Nội và Trường Đại học Y – Dược Thái Nguyên đã tạo điều kiện cho tôi trong quá trình làm nghiên cứu thực nghiệm

Tôi xin bày tỏ sự kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Viết Thân, Ths Phạm Thị Tuyết Nhung, hai người thày đã tận tình hướng dẫn cho tôi từ những bước đi đầu tiên trên con đường nghiên cứu khoa học đến khi hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Tôi trân trọng gửi lời cảm ơn tới ông Nguyễn Thế Chung, người đã nhiệt tình giúp đỡ trong quá trình tìm kiếm, thu hái mẫu tại Sơn Động – Bắc Giang

Xin chân thành cám ơn các bạn trong tập thể chuyên ngành Dược liệu – Dược học cổ truyền lớp CH16 đã động viên, giúp đỡ tôi trong khi hoàn thiện khoá luận Cuối cùng, với tấm lòng hiếu kính, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, những người đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 8 năm 2013

Đỗ Thị Thuý Hoà

1.1.2 Sơ lược lịch sử nghiên cứu chi Zanthoxylum L 3

1.1.3 Đặc điểm thực vật và phân bố chi Zanthoxylum L 4

1.4 Một số loài thuộc chi Zanthoxylum L phổ biển ở miền Bắc nước ta 17

1.4.2 Zanthoxylum avicennae (Lamk.) DC – Muồng truổng 18

1.4.3 Zanthoxylum nitidum (Roxb.) DC – Xuyên tiêu 18

1.4.4 Zanthoxylum myriacanthum Wall Ex Hook f – Sẻn lá to 19

1.4.5 Zanthoxylum scandens Blume – Đắng cay 20

2.3.2 Nghiên cứu về hóa học 22

3.2.1.1 Định tính tinh dầu và các nhóm chất bằng phản ứng hóa học 29

3.2.3 Chiết xuất, phân lập các chất trong dược liệu Hoàng lực 43

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

1

H-NMR : Proton nuclear magnetic resonance

13

C-NMR : Carbon (13) nuclear magnetic resonance

DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Transfer HMBC : Heteronuclear multiple bonded coherence

HSQC : Heteronuclear single quantum coherence

Bảng 3.3 Hàm lượng tinh dầu trong quả Xuyên tiêu 39

Bảng 3.5 Kết quả phân tích tinh dầu quả Xuyên tiêu 41

Bảng 3.7 Số liệu phổ cộng hưởng từ nhân và DEPT của HL2 và nitidin 50 Bảng 3.8 Số liệu phổ cộng hưởng từ nhân, DEPT của HL1 và

dihydrochelerythrin

53

Hình 3.8 Sắc ký đồ dịch chiết dược liệu trong methanol với hệ 1 37 Hình 3.9 Quy trình chiết xuất alcaloid thô từ dược liệu Hoàng lực 43 Hình 3.10 Sơ đồ phân lập từ cắn alcaloid thô 45 Hình 3.11 Sắc ký đồ của HL1 và dịch chiết ethanol, alcaloid thô 46 Hình 3.12 Sắc ký đồ của HL2 và dịch chiết ethanol, alcaloid thô 46

Hình 3.14 Sắc ký đồ chất HL1 với 3 hệ dung môi lần lượt là 2, 3, 5 48 Hình 3.15 Sắc ký đồ chất HL2 với 3 hệ dung môi lần lượt là 4, 5, 6 48

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam nằm trong đới khí hậu nhiệt đới với hệ động thực vật rất phong phú và đa dạng Trong đó có rất nhiều cây thuốc từ xưa cha ông ta đã sử dụng để phòng, chữa bệnh và chống dịch Trải qua bao thế kỷ, nguồn dược liệu thiên nhiên

đó đã là nguồn thuốc chủ yếu để bảo vệ và nâng cao sức khỏe cho nhân dân ta

Phần lớn cây được sử dụng làm thuốc của nước ta được phân bố ở vùng rừng núi, nơi mà đang dần mất cân bằng môi trường sinh thái và đứng trước nguy cơ suy giảm nghiêm trọng về số lượng và tính đa dạng sinh học do bị khai thác quá mức hay bị xói mòn…

Bắc Giang là một tỉnh có diện tích khá lớn nằm ở khu vực Đông Bắc nước ta Với địa hình trung du và là vùng chuyển tiếp giữa vùng núi phía bắc với châu thổ sông Hồng ở phía nam, đồng thời cũng có nhiều đồi núi, đây chính là địa phương có tiềm năng cho nhiều cây thuốc sinh trưởng và phát triển Theo thống kê tại huyện Sơn Động – Bắc Giang, tổng số loài cây thuốc điều tra được là 295 loài, trong đó có 10 loài đang có nguy cơ đe dọa và có tên trong sách đỏ Việt Nam như: Cốt toái bổ, Sừng dê, Thổ phục linh, Lá khôi… [26]

Vài năm trở lại đây, nhân dân các vùng miền núi tỉnh Bắc Giang đã khai thác với lượng lớn và bán cho thương nhân Trung Quốc một loại dược liệu mang tên Hoàng lực làm nguồn dược liệu này suy giảm nghiêm trọng về số lượng Qua tìm hiểu thực

tế, dược liệu này được người dân địa phương sử dụng phổ biến theo kinh nghiệm cổ truyền làm thuốc chữa bệnh viêm thấp khớp, đau lưng nhức mỏi, đau răng, lá tươi của cây này dùng giã nát để đắp những chỗ sưng đau Dựa vào một số đặc điểm hình thái của cây thuốc trong quá trình thu mẫu, dược liệu Hoàng lực được sơ bộ

nhận định là rễ của cây thuốc thuộc chi Zanthoxylum L họ Cam (Rutaceae)

Với mục đích tìm hiểu nguồn gốc dược liệu, góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu tiêu chuẩn hóa dược liệu, đưa ra cách sử dụng và bảo tồn hợp lý nguồn tài

nguyên, bổ sung vào bản đồ cây thuốc nước ta, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên

cứu nguồn gốc thực vật, thành phần hóa học của vị thuốc Hoàng lực thu hái tại Bắc Giang” với mục tiêu: Tìm hiểu nguồn gốc thực vật của vị thuốc Hoàng lực và

nghiên cứu xây dựng cơ sở dữ liệu để sử dụng hợp lý, có hiệu quả cây thuốc này

Để thực hiện mục tiêu nêu trên, đề tài gồm một số nội dung chính sau:

1 Về nguồn gốc thực vật:

- Lấy mẫu, phân tích đặc điểm hình thái, giải phẫu, giám định tên khoa học của các mẫu nghiên cứu

2 Về thành phần hóa học:

- Định tính các nhóm chất trong dược liệu

- Xác định hàm lượng, phân tích thành phần của tinh dầu trong cây

- Chiết xuất, phân lập và nhận dạng chất phân lập được từ dược liệu

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Đặc điểm thực vật

Qua khảo sát thực tế quá trình thu mẫu dược liệu, vị thuốc Hoàng lực được

sơ bộ nhận định là rễ lấy từ loài thuộc chi Xuyên tiêu (Zanthoxylum L.), họ Cam

(Rutaceae)

1.1.1 Vị trí phân loại chi Zanthoxylum L

Zanthoxylum L tên Việt Nam là chi Xuyên tiêu, có vị trí phân loại [55], [60]:

Phân họ Cửu lý hương (Rutoideae)

Chi Xuyên tiêu (Zanthoxylum)

1.1.2 Sơ lược lịch sử nghiên cứu chi Zanthoxylum L

Người đầu tiên nghiên cứu và đặt tên Zanthoxylum L cho chi Xuyên tiêu là

Linnaeus năm 1753 [48]

Qua nhiều nghiên cứu của các tác giả khác, chi này có một số tên đồng nghĩa

như Tipalia (Dennist, 1818), Fagara (Baker & Baikhuizen Van der Brinkjr, 1965) [31]

Thực vật chí Đông Dương [65] đã xây dựng khóa định loại, liệt kê 10 loài,

đồng thời mô tả chi tiết đặc điểm thực vật, phân bố của 8 loài gồm có: Zanthoxylum

avicenniae DC., Z rhetsa DC., Z rhetsoides Drake., Z cuspidatum Champ., Z laetum Drake., Z nitidum DC., Z acanthopodium DC và Z usitatum Pierre ex

Lannessan

Thực vật chí Trung Quốc xuất bản bằng tiếng Anh (2008) [60] đã xây dựng

khóa định loại chi tiết và mô tả 41 loài thuộc chi Zanthoxylum L ở Trung Quốc,

trong số đó gặp hầu hết các loài có phân bố ở Việt Nam

Công bố mới nhất về phân loại chi Zanthoxylum L là của Takhtajan (2009)

[55] đã sắp xếp các taxon họ Cam (Rutaceae) trong 6 phân họ: Rutoideae, Spanthelioidea, Dictyolomatoidea, Toddalioideae, Flindersioideae, Aurantioideae

(Citroideae) Trong đó chi Zanthoxylum L được xếp vào phân họ Rutoideae

Theo kết quả công bố tháng 12/2010 của dự án “The Plant List” giai đoạn 1 lấy dữ liệu chủ yếu từ Kew và Missouri Botanical Garden về thực vật có mạch, chi

Zanthoxylum L có 573 tên loài được thu thập từ các cơ sở dữ liệu, trong đó có 134

tên khoa học được chấp nhận (23,4%), 241 tên được xác định là tên đồng nghĩa (42,1%), 198 tên chưa xác định được chính xác thông tin (34,6%) [57]

Ở Việt Nam, mặc dù chưa được xuất bản trong “Thực vật chí Việt Nam” (2008) nhưng theo tài liệu công bố mới nhất về họ Cam là “Nghiên cứu phân loại họ

Cam (Rutaceae Juss.) ở Việt Nam” (2010) [11] chi Zanthoxylum L gồm có 10 loài Đồng thời tác giả đã xây dựng khóa định loại cho chi Zanthoxylum L ở Việt Nam,

chủ yếu dựa trên cơ sở các đặc điểm hình thái lá (trục lá chét, số lượng lá chét, cách sắp xếp), dạng sống, trục cụm hoa và màu sắc bao phấn

1.1.3 Đặc điểm thực vật và phân bố chi Zanthoxylum L

Cây bụi đôi khi bụi trườn, cây gỗ lớn hoặc cây gỗ leo, thường xanh hoặc rụng lá, đơn tính khác gốc, ít khi là đơn tính cùng gốc Thân và cành thường có gai Lá mọc so le, lá kép lông chim lẻ, số lượng lá chét rất thay đổi từ 3 - nhiều lá chét mọc so le hay đối; mép lá nguyên hay có răng cưa nhỏ, giữa khe các răng cưa thường có tuyến tinh dầu tương đối to Cụm hoa hình chùy hay chùm, chùm kép mọc ở đầu cành hay ở nách lá Bao hoa gồm hai lớp, có thể phân biệt đài tràng, 4-5

lá đài và 4-5 cánh tràng; hoặc không phân biệt đài tràng với 5-9 bộ phận Đài hoa

có thể rời hoặc hợp Tiền khai hoa van hay vặn Bộ nhị gồm 4-5 nhị rời ở hoa phân biệt đài tràng, hoa không phân biệt đài tràng có 3-8 (-10) nhị, bị tiêu giảm hoặc không có ở hoa cái Bộ nhụy gồm 1-5 lá noãn rời, mỗi lá noãn có 1-2 noãn, tiêu giảm hoặc không có ở hoa đực, noãn đính bên, có cuống bầu; bầu nhẵn, vòi nhụy hợp hoặc rời nhau, hơi cong; núm nhụy dạng đầu Quả nang, vỏ ngoài có điểm dầu; khi chín vỏ quả trong rời nhau, mỗi mảnh quả có 1-2 hạt, đính trên cuống

noãn phình to; rốn hạt dạng sợi ngắn, phẳng, vỏ hạt giòn, màu nâu đen, bóng; nội nhũ nạc Lá mầm dẹp, phôi rất ngắn, thẳng [14], [21], [60]

Chi Xuyên tiêu (Zanthoxylum L.) gồm khoảng 200 loài, phân bố chủ yếu ở

vùng nhiệt đới Hầu hết các loài đều phân bố ở Nam Mỹ, sau đến Đông Nam Á (khoảng trên 20 loài), một số ít loài ở vùng ôn đới ấm Đông Á, Bắc Mỹ, các quần đảo Thái Bình Dương và Australia [3], [21]

Ở Trung Quốc, 41 loài đã được thống kê và mô tả chi tiết [60] Đồng thời J Fang và cộng sự (2011) cũng đã xây dựng được bản đồ chi tiết phân bố của 50 loài và thứ [39]

Hình 1.1 Bản đồ phân bố của loài Z nitidum (Roxb.) DC ở Trung Quốc [39]

Trong hệ thực vật Việt Nam, theo tài liệu “Cây cỏ Việt Nam” (2002) [1] đã

mô tả tóm tắt và phân bố của 11 loài thuộc chi Zanthoxylum L là:

Z acanthopodium DC - Sẻn, Sẻn gai

Z armatum DC – Sẻn gai, Đắng cay

Z avicennae (Lamk.) DC – Muồng truổng, Sẻn, Màn tàn, Sẻn lai, Buồn

chuồn, Hoàng mộc dài

Z cucullipetalum Guillaum – Hoàng mộc cánh bầu

Z evodiaefolium Guillaum – Hoàng mộc phi, Đắng cay ba lá

Z laetum Drake – Hoàng mộc sai

Z myriacanthum Wall Ex Hook.f – Hoàng mộc nhiều gai, Sẻn lá to

Z nitidum (Roxb.) DC – Xuyên tiêu, Sưng, Hoàng lực, Trưng, Sang, Sang

láng, Hoàng liệt, Lưỡng diện châm, Lưỡng phù châm, Hạt sẻn, Hoa tiêu, Hoa tiêu thích, Ba tiêu [14],[21]

Z rhetsa (Roxb.) DC – Sẻn hôi, Hoàng mộc hôi, Cóc hôi, Vàng me, Muống tử

Z scabrum Guillaum – Dây khắc dung

Z scandens Blume – Hoàng mộc leo, Đắng cay, Hoa tiêu, Thục tiêu

Theo tài liệu “Danh lục các loài thực vật Việt Nam” (2003) [1] ngoài 11 loài nêu trên còn đưa thêm thông tin về 2 loài là:

Z anthyllidifolium Guillaum - Sẻn Đà Nẵng Dạng cây bụi, mới thấy phân

bố ở Đà Nẵng

Z usitatum Pierre ex Laness – Xuong, Mong tu Chưa biết rõ về dạng sống,

mới thấy ở Đồng Nai

Tại hội nghị hóa học toàn quốc lần thứ IV, báo cáo [15] đã công bố về loài

Zanthoxylum thu hái tại Mai Châu – Hòa Bình được giám định tên khoa học là Z dimorphophyllum Hemsl Đây là loài chưa được đưa vào tài liệu nào về phân loại

thực vật tại Việt Nam Vì vậy cần thiết phải có những nghiên cứu đầy đủ hơn để có thể bổ sung vào danh mục

1.2 Thành phần hóa học của chi Zanthoxylum L

1.2.1 Những nghiên cứu trên thế giới

Số lượng loài thuộc chi Zanthoxylum L trên thế giới là rất lớn với khoảng

200 loài [21], vì vậy các nghiên cứu về hóa học của các loài này khá phổ biến Căn

cứ vào các tài liệu thu thập, chi Zanthoxylum L chủ yếu được nghiên cứu về tinh

dầu, alcaloid, ngoài ra còn có coumarin, flavonoid, lignan, saponin, sterol, amid và các chất khác

1.2.1.1 Tinh dầu

Là một chi lớn thuộc họ Cam, với đặc điểm đặc giải phẫu đặc trưng là túi tiết

tinh dầu, các loài Zanthoxylum L được quan tâm nghiên cứu về hóa học tinh dầu

Bộ phận chứa tinh dầu rất đa dạng, chủ yếu tập trung ở quả, còn có ở lá và rễ với

hàm lượng nhỏ hơn Một điều đặc biệt gây nên sự chú ý cho các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu đó là do tinh dầu của các loài này có mùi thơm đặc trưng theo từng loài Thành phần hóa học của tinh dầu cũng rất đa dạng, có chứa hầu hết các nhóm cấu trúc hợp chất thường gặp trong tinh dầu Về phương pháp nghiên cứu chủ yếu là chưng cất lôi cuốn bằng hơi nước, sau đó phân tích tinh dầu bằng sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC/MS)

Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào tinh dầu ở quả do theo kinh nghiệm dân

gian, quả có mùi thơm và thường được dùng làm gia vị Tinh dầu quả loài Z rhetsa

(Roxb.) DC được nghiên cứu khá kỹ, so sánh hiệu suất chiết theo phương pháp cất kéo hơi nước truyền thống và chiết bằng CO2 lỏng siêu tới hạn cho kết quả tỷ lệ tinh dầu lần lượt là 1,8 và 5,1% Trong đó thành phần chính của tinh dầu chiết bằng CO2

lỏng siêu tới hạn là các monoterpen: sabinen 42,5%, α-pinen 4,6%, β-pinen 5,5%; monoterpen oxy hóa: terpinen-4-ol 3,5%, linalool 2,6%; các hợp chất sesquiterpen: β-cubeben 4,8%, α-copaen 1,3%; các hợp chất cấu trúc khác như sesquiterpen oxy hóa (8,1%), acid béo và methyl ester (4,2%), hydrocarbon (1,7%) [54]

Kết quả của nghiên cứu [51] về quả của loài Z rhetsoides Drake có chứa 5%

tinh dầu Thành phần chính của tinh dầu là các hợp chất monoterpen (78%): limonen (27,2%), ρ-cymen (15,3%) và β-phellandren (11,9%) Ngoài ra các hợp chất monoterpen có chứa oxy chiếm 19%, 1% alcol mạch thằng và 1% sesquiterpen

Ngoài ra, một số nghiên cứu còn phân tích khá rõ thành phần hóa học tinh

dầu của các bộ phận trên mặt đất Phần trên mặt đất của loài Z armatum DC thu

hái ở cùng Đông Bắc Ấn Độ có chứa 0,4% tinh dầu tính theo dược liệu tươi Tinh dầu có chứa tới 33% hợp chất monoterpen gồm: α-pinen (4,5%), sabinen (4,6%), limonen (5,6%) và β-phellandren (12,7%) Các thành phần có hàm lượng lớn khác

là 1,8-cineol (15,7%), linalol (18,8%) và undecan-2-on (17,0%) [51]

Lá của loài Z piperitum (L.) DC được nghiên cứu thấy có chứa 0,5% tinh

dầu tính theo nguyên liệu khô tuyệt đối, thành phần chính của tinh dầu là d-limonen (18%), geranyl acetat (15,3%), crypton (8,5%), citronellal (7,1%), cuminal (6,2%), phellandral (5,2%) [35]

Các nghiên cứu trên khá đầy đủ về tinh dầu của một số loài, đánh dấu bước đầu những nghiên cứu chuyên sâu về thành phần hóa học các loài thuộc chi

Zanthoxylum L trên thế giới Đây chính là cơ sở dữ liệu để tổng hợp thành hệ thống

các nghiên cứu về chi Zanthoxylum L., đồng thời cũng là cơ sở tham khảo cho các

nghiên cứu về các loài cùng chi ở Việt Nam sau này

1.2.1.2 Alcaloid

Alcaloid là nhóm chất được tìm thấy ở hầu hết các loài Zanthoxylum L đã

được nghiên cứu Cấu trúc các alcaloid tương đối đa dạng, nhiều cấu trúc ít gặp trong tự nhiên Đặc biệt, đây là nhóm hợp chất có tiềm năng trở thành các chất dẫn đường trong nghiên cứu phát triển thuốc mới Dựa vào cấu trúc của các alcaloid đã phân lập, có thể chia thành các nhóm như sau:

* Benzo[c]phenanthridin

Cấu trúc điển hình của alcaloid thường gặp trong rễ và thân các loài

Zanthoxylum L là benzo[c]phenanthridin, có cấu tạo như sau:

Các benzo[c]phenanthridin alcaloid được phân lập gồm có:

6,7,8-trimethoxy-2,3-methylendioxybenzophenantridin: Z nitidum (Roxb.)

DC (rễ) [61]

7,9 dimethoxy – 2,3 methylen dioxybenzophenantridin: Z myriacanthum Wall (rễ) [49]

8-hydroxydihydrochelerythrin: Z nitidum (Roxb.) DC (rễ) [42]

8-methoxydihydrochelerythrin: Z nitidum (Roxb.) DC (rễ) [42]

Avicin: Z avicennae (Lamk.) DC (vỏ thân) [37]

Decarin: Z nitidum (Roxb.) DC (rễ) [42], [46]

Dihydroavicin: Z avicennae (Lamk.) DC (vỏ thân) [37]

Dihydrochelerythrin: Z nitidum (Roxb.) DC (rễ) [42], [46], [61]

Dihydrochelerythrinyl-8-acetaldehyd: Z nitidum (Roxb.) DC (rễ) [46]

Dihydronitidin: Z myriacanthum Wall (rễ) [58]

Chelerythrin: Z avicennae (Lamk.) DC (vỏ thân) [37], (rễ) [61], Z

dimorphophyllum Hemsl (vỏ thân) [15]

Nitidin: Z avicennae (Lamk.) DC (vỏ thân) [37], Z myriacanthum Wall (rễ) [58], Z nitidum (Roxb.) DC (rễ) [42], [46], [61]

N-nortidin: Z myriacanthum Wall (rễ) [49], Z limonella Alston (vỏ thân) [40] Norchelerythrin: Z nitidum (Roxb.) DC (rễ) [42], [46]

Oxyavicin: Z nitidum (Roxb.) DC (rễ) [42]

Rhoifoline A: Z nitidum (Roxb.) DC (rễ) [42]

Sanguinarin: Z nitidum (Roxb.) DC (rễ) [42]

* Quinolon

Alcaloid nhóm quinolon thường gặp nhất là skimmianin được phân lập từ loài

Z rhesta DC và Z avicennae (Lamk.) DC [27], [38], [45] Ngoài ra còn có dictamin

từ thân Z nitidum (Roxb.) DC [42], γ-fagarin từ lá Z avicennae (Lamk.) DC [45]

Thường gặp các alcaloid cấu trúc aporphine, gồm magnoflorin trong Z

avicennae (Lamk.) DC., Z myriacanthum Wall [27], [37], [58]; liriodenin

(oxoaporphin) trong Z nitidum (Roxb.) DC [61], [62]

1.2.1.3 Coumarin

Các hợp chất coumarin thường gặp ở rễ và thân, là yếu tố tạo nên màu vàng

ngà và mùi thơm đặc trưng của rễ các loài Zanthoxylum L

Các coumarin đã được phân lập gồm xanthyletin, suberosin phân lập từ vỏ

thân loài Z rhetsa DC [29], [38] Theo tài liệu [45], lá của loài Z avicennae

(Lamk.) DC phân bố ở Đài Loan có chứa thành phần coumarin rất đa dạng Đã có tới 9 flavonoid được phân lập là:

5’-methoxyaurapten;

6,5’-dimethoxyaurapten;

5’-methoxycollinin;

7-((2’E,5’E)-7’-methoxy-3’,7’-dimethylocta-2’,5’-dienyloxy) coumarin; 6-methoxy-7-((2’E,5’E)-7’-methoxy-3’,7’-dimethylocta-2’,5’-dienyloxy) coumarin; 5’-hydroxyaurapten;

7-((2’E,5’E)-7’-hydroxy-3’,7’-dimethylocta-2’,5’-dienyloxy) coumarin; Schinilenol;

Ngoài ra trong chi Zanthoxylum L còn có các nhóm hợp chất khác là: sterol,

lignan, triterpen, sapogenin, amid…

1.2.2 Những nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, những nghiên cứu về hóa học chi Zanthoxylum L mới được

công bố nhiều khoảng 10 năm trở lại đây Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào hai thành phần hóa học chính là alcaloid và tinh dầu

Mở đầu là những kết quả nghiên cứu được công bố vào năm 2002 [25] về

loài Hoàng mộc dài (Z avicenae (Lamk.) DC.) thu hái tại vườn quốc gia Cúc

Phương Từ lá của loài này đã phân lập được 7 hợp chất bishordeninyl terpenancaloid, lớp chất rất ít gặp trong tự nhiên Trong đó có (-)-culantraramin (0,01%) và (-)-culantraraminol (0,005%) và 5 chất mới được phân lập là (-)-culantraramin N-oxid a, b; (-)-culantraraminol N-oxyd a, b; avicennamin Trong

đó hai chất (-)-culantraramin và (-)-culantraraminol là alcaloid chỉ mới được biết dưới dạng hỗn hợp racemic, đây là lần đầu tiên tác giả đã phân lập được dạng đồng phân quang học của chúng từ thiên nhiên

R R

(-)-culantraramin

R R

OH

(-)-culantraraminol

OCH3

N(CH3)2R=

Trong nghiên cứu về thành phần hóa học của lá loài Z nitidum DC thu hái ở

Thanh Hóa cho thấy lá có 0,2% tinh dầu (so với mẫu tươi) với 50 hợp chất trong đó

có 40 hợp chất đã được định danh Thành phần chính của tinh dầu là β-caryophylen (24,6%); γ-elemen (14,7%) và bicyclogermacren (12,9%) Ngoài ra, có 2 hợp chất được phân lập cũng từ lá là stigmasterol và dihydrokaempferit [8]

Năm 2008, công trình nghiên cứu 2 loài Z alatum Roxb và Z avicennae

(Lamk.) DC đã công bố các nghiên cứu hóa học khá đầy đủ về thành phần tinh dầu

đồng thời phân lập được một số các hợp chất khác nhau Lá của loài Z alatum

Roxb chứa 0,16% tinh dầu với 50 hợp chất đã biết Các monoterpen chiếm ưu thế với 1,8-cineol (41,0%), sabinen (8,4%), linalool (4,5%), α-terpineol (4,1%), β-terpineol (2,1%), β-cymen (1,3%), ngoài ra còn có các sesquiterpen với hàm lượng thấp Trong khi đó, quả có chứa 0,19% tinh dầu với thành phần chính là 1,8-cineol (29,8%), sabinen (18,8%), limonen (12,8%)

Lá cây Muồng truổng (Z avicennae (Lamk.) DC.) có hàm lượng tinh dầu là

0,1% so với mẫu tươi, có màu vàng nhạt, mùi thơm đặc trưng Từ tinh dầu này, 80

hợp chất được tách bằng phương pháp GC/MS, trong đó 53 hợp chất đã được xác định Các hợp chất monoterpen chiếm 44,3%, gồm có α-pinen (10,07%), sabinen (2,53%) và γ-terpinen (4,53%); 15 hợp chất sesquiterpen và alcohol là: β-caryophyllen (17,01%), α-humulen (10,38%), α-pinen (10,07%), β-phellandren (9,42%), γ-terpinen (4,53%), α-(E)-β-ocimen (3,87%), germacren D (3,28%), terpinen (3,09%), β-selinen (3,09%), myrcen (2,68%), sabinen (2,53%), α-selinen (2,29%), ∆-cadinen (1,90%), linalool (1,14%), (E,E)-α-farnesen (1,14%) [18]

Từ lá của loài Z alatum Roxb tác giả cũng đã phân lập được 3 hợp chất

steroid là β-sitosterol, stigmasterol, β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid và 2 hợp chất flavonoid là vitexin và isovitexin [18]

O O OH

HO OH

Isovitexin

Từ rễ cây Muồng truổng (Z avicennae (Lamk.) DC.), các hợp chất steroid

phổ biến trong tự nhiên là β-sitosterol, β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid cũng được phân lập Ngoài ra tác giả cũng đã phân lập được 6 hợp chất coumarin là scoparon, scopoletin, luvangetin, braylin, avicennin, avicennol; 1 hợp chất flavonoid là hesperidin; 2 alcaloid là nitidin và terihanin; 1 lignan là sesamin [18]

N+

O O

H3CO CH3

H3CO

Nitidin

N+

O O

H3CO

Terihanin

Cũng trong năm 2008, loài Z nitidum DC ở Thanh Hóa cũng được nghiên

cứu về thành phần hóa học của vỏ thân Theo đó, với phương pháp chiết xuất bằng

dung môi ethanol 96%, phân lập bằng sắc ký cột, tác giả đã phân lập được 1 alcaloid là nitidin và 1 lignan là epi-sesamin [19]

Trong nghiên cứu khác, lá cây Rau sâng (Z scarbrum Guil L.) ở Thanh Hóa

được nghiên cứu khá đầy đủ về thành phần hóa học tinh dầu và phân lập chất tinh khiết Trong lá của loài này có chứa 0,2% tinh dầu (so với mẫu tươi), gồm có 48 hợp chất đã được xác định Thành phần chính là sabinenhydrat (26,46%), β-caryophylen (9,91%), α-pinen (8,26%) Cũng từ lá, có 1 alcaloid là nitidin và 1 sterol thường gặp trong tự nhiên được phân lập là β-sitosterol [12]

Từ rễ cây Muồng truổng (Z avicennae Lamk DC.) thu hái ở Hà Tĩnh, phân

lập được hai chất là avicennin và một sterol lần đầu được phân lập từ loài này là sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid [13]

β-Từ vỏ thân loài Z dimorphophyllum Hemsl đã phân lập được 2 coumarin và

6 alcaloid Trong số 2 coumarin có một chất mới là dimoxylin và chất còn lại là scoparon Sáu alcaloid là: chelerythrin, norchelerythrin, oxyavicin, canthine-6-on, 4-5-dihydrocanthin-6-one và γ-fararin [15]

O O

OH

H3CO

OH OH

O O

OCH3

γ-fararin

Tinh dầu của quả loài Sẻn lá to Z rhetsoides Drake có màu vàng nhạt, được

chưng cất lôi cuốn hơi nước với hiệu suất là 14% Thành phần hóa học của tinh dầu gồm có 69 hợp chất, gồm chủ yếu là các monoterpenoid (98,1% hàm lượng), trong

đó các monoterpen dihydrocarbon ρ-cymen (15,3%, limonen (27,1%), phellandren (11,9%) là các hợp chất chính Một số monoterpenoid có chứa oxi là terpinen-4ol (6%), geranyl acetat (1,8%) Các sesquiterpenoid chiếm 0,3%, chủ yếu

β-là sesquiterpen hydrocarbon và phần lớn ở dạng vết (<0,005%) Ngoài ra còn có các alcol mạch thẳng (1,3%) Trong số các chất được nhận dạng, đáng chú ý là trans-ρ-mentha-1(7),5-dien-2-ol (1,2%) và ρ-menth-1-en-7-al (1%) lần đầu được tìm thấy

trong chi Zanthoxylum, trước đây chỉ được nhắc đến như các sản phẩm sinh ra trong

quá trình bán tổng hợp [10]

Trans-ρ-mentha-1(7),5-dien-2-ol

CHO

ρ-menth-1-en-7-al

Loài Z scandens thu hái ở Mai Châu – Hòa Bình cũng được chọn là đối

tượng trong nghiên cứu [30] Từ vỏ thân của loài này, các tác giả đã phân lập được

2 alcaloid là norchelerythrin và chelerythrin Cùng với đó là (E)-O-geranylconiferyl alcohol, là chất mới lần đầu được phân lập

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về chi Zanthoxylum L còn khá nhỏ lẻ, chủ yếu là

về thành phần hóa học nên chưa hệ thống được đầy đủ về các loài có phân bố ở Việt Nam Vì vậy cần thiết phải có những nghiên cứu đầy về cả đặc điểm thực vật và

thành phần hóa học của các loài Zanthoxylum L phân bố ở Việt Nam

1.3 Tác dụng sinh học của chi Zanthoxylum L

Trên thế giới, các loài thuộc chi Zanthoxylum L được nghiên cứu khá nhiều

nhóm tác dụng sinh học khác nhau Chủ yếu các nghiên cứu tập trung vào tác dụng chống viêm, giảm đau, kháng khuẩn và gần đây nhất là tác dụng chống khối u và ung thư

Phân đoạn ethyl acetat từ dịch chiết ethanol của loài Z armatum DC (phân

bố ở vùng đông nam và tây nam Trung Quốc) có tác dụng giảm số cơn đau quặn trên mô hình thực nghiệm gây đau trên chuột bằng acid acetic, có tác dụng giảm đau

do formalin ở giai đoạn đầu tiên với liều cao và trong giai đoạn sau ở mọi liều

nghiên cứu Kết quả này cho thấy tác dụng giảm đau khá mạnh của loài Z armatum

DC Cơ chế tác dụng có thể là do liên quan đến tác dụng chống viêm ngoại vi Ngoài

ra, tùy thuộc vào liều dùng phân đoạn ethyl acetat cũng ứng chế tác nhân gây ra sưng tai chuột Tám lignan (eudesmin, horsfieldin, fargesin, kobusin, sesamin, asarinin, planispin A và pinoresinol-di-3,3-dimethylallyl) được xác định thành phần chính của phân đoạn ethyl acetat Đối chiếu với các nghiên cứu khác, có thể nói các lignan đóng

vai trò chính trong tác dụng chống viêm Kết quả này làm sáng tỏ thêm kinh nghiệm

sử dụng truyền thống của Z armatum DC trong điều trị viêm và đau [56]

Ở Việt Nam, theo tài liệu [25] về hoạt tính kháng vi sinh vật của chất

(-)-culantraramin từ loài Hoàng mộc dài [Z avicennae (Lamk.) DC.] thấy có hoạt tính kháng vi khuẩn Escherichia coli và Bacillus subtillis ngay ở nồng độ 25 µg/ml, không có tác dụng với vi khuẩn Staphylococcus aureus và Aspergillus niger Cũng

từ loài này, hai hợp chất được phân lập là (-)-culantraramin và avicennamin được thử hoạt tính chống ung thư theo phương pháp thử hoạt tính độc tế bào với các dòng

tế bào ung thư sau: ung thư gan (Hep-G2), ung thư màng tử cung (FL) và ung thư màng tim người (RD) Kết quả cho thấy cả hai chất có tác dụng kháng cả ba dòng tế bào ngay ở nồng độ thấp (IC50<5 µg/ml) Đặc biệt chất avicennamin có khả năng tiêu diệt hoàn toàn tế bào ung thư màng tim người Đây là những kết quả đầu tiên về

nghiên cứu hoạt tính sinh học của các chất phân lập từ loài thuộc chi Zanthoxylum ở

Việt Nam Những kết quả nghiên cứu này không những góp phần giải thích cơ sở khoa học về tác dụng chữa bệnh của cây Hoàng mộc dài mà còn giúp sàng lọc chất dẫn đường phục vụ cho quá trình tìm kiếm thuốc mới

Độc tính cấp và tác dụng lợi mật của cao quả mắc khén (Z rhetsa DC.) cũng

đã được nghiên cứu một cách đầy đủ [24] Theo đó, độ an toàn của cao quả sau khi loại bỏ tinh dầu bằng phương pháp cất kéo hơi nước và LD50 của phân đoạn tinh dầu từ quả cây mắc khén được xác định là 3-4mg/kg (tính theo trọng lượng cơ thể chuột nhắt trắng) Cao quả cây mắc khén với mức liều 1,8 g/kg chuột cống, uống trước 3 ngày đã có tác dụng kích thích bài tiết mật của gan, đạt 277,98% so với nhóm chứng Mức tăng này có ý nghĩa thống kê (với p<0,05) Cường độ bài tiết mật của cao quả mắc khén mạnh nhất sau khi uống 3 giờ, đạt tỷ lệ 46,97% Tác dụng của cao quả mắc khén làm thay đổi lượng bilirubin toàn phần trực tiếp theo xu hướng tăng tại giờ thứ 3, nhưng không làm thay đổi tỷ trọng dịch mật Có thể sơ bộ kết luận cơ chế lợi mật là theo hướng kích thích tế bào gan tăng chế sắc tố mật

Những tác dụng sinh học được nghiên cứu đã góp phần chứng minh những

kinh nghiệm sử dụng các loài Zanthoxylum L trong nhân dân

1.4 Một số loài thuộc chi Zanthoxylum L phổ biển ở miền Bắc nước ta

1.4.1 Zanthoxylum armatum DC – Sẻn gai

Tên khác: Đắng cay, Thục tiêu, Hoa tiêu, Trúc diệp tiêu, Hoàng mộc [2] Cây gỗ; thân cao 3-5m, phân nhiều cành; gốc thân có gai rộng và dẹt, màu nâu; gai trên cành nhỏ, thẳng Lá kép lông chim, mọc so le; trục mang lá chét có cánh lõm rộng 2mm; gồm 3-7 (9) lá chét; lá chét mọc đối gần như không có cuống;

lá chét hình mũi mác, gốc thuôn, đầu nhọn, kích thước 3-12 x 1-4,5 cm, vò ra có mùi thơm hắc Cụm hoa chùm ở nách lá, dài 2-5cm; trục cụm hoa có lông Hoa đơn tính, màu trắng hoặc xanh-vàng nhạt, cuống hoa có lông mịn Có 5 lá đài rất ngắn, nhẵn hoặc hơi có lông, 5 cánh hoa Hoa đực có 5 nhị; chỉ nhị hình sợi chỉ; bao phấn hình trái xoan, màu vàng; bộ nhụy thoái hóa, đầu nhụy xẻ 2-3 thùy Hoa cái có bộ nhị thoái hóa thành lưỡi; bộ nhụy gồm 2-3 lá noãn rời, chỉ dính nhau ở gốc bầu Quả nang, khi chín có màu đỏ tím, nứt thành hai mảnh, vỏ quả ngoài sần sùi có những tuyến rõ, rất thơm; mỗi nang chứa một hạt, đường kính 3-4mm màu đen nhánh Mùa hoa tháng 4-6, quả tháng 8-10 [2], [11] Cây thường mọc ven suối, ở độ cao 1300m [1]

Phân bố: Lào Cai, Hòa Bình, Cao Bằng, Hà Giang, Lai Châu Ngoài ra còn

có ở Ấn Độ, Himalaya, Trung Quốc, Đài Loan, Triều Tiên, Nhật Bản, Lào, Thái Lan, Philippin [1], [2], [11]

Bộ phận dùng: rễ, vỏ thân, lá; quả thu hái vào mùa thu

Thành phần hóa học chính: tinh dầu (quả) chủ yếu gồm linalol, limonen, methyl cinamat [32], [51], lignan (eudesmin, horsfieldin, fargesin, kobusin, sesamin, asarinin, planispin A và pinoresinol-di-3,3-dimethylallyl) [56], sapogenin (β-amyrin) [2]

Tác dụng sinh học đã nghiên cứu: chống nấm, chống oxy hóa và chống khuẩn [32], dịch chiết ethanol từ vỏ thân có tác dụng bảo vệ tế bào gan trên mô hình động vật thực nghiệm [47], tinh dầu có tác dụng chống muỗi [50], phân đoạn ethyl acetat từ vỏ thân và rễ có tác dụng chống viêm, giảm đau trên mô hình động vật thực nghiệm [56]

1.4.2 Zanthoxylum avicennae (Lamk.) DC – Muồng truổng

Tên khác: Sẻn, Màn tàn, Sẻn lai, Buồn chuồn, Đơn gai, Tần tiêu, Sẻn đen, Hoàng mộc dài [1], [3], [11]

Cây gỗ, cao đến 8-15m Thân thẳng có gai ngắn, cành nhẵn Lá kép lông chim mọc so le, cuống lá có cánh; gồm 11-21 (31) lá chét mọc đối, lá chét hình trứng, kích thước 2,5-7 x 1-3cm; gốc và đầu thuôn, mặt trên có nhiều tuyến nhỏ, rõ Cụm hoa tán kép ở ngọn cành; hoa không cuống, màu trắng, đơn tính khác gốc Bao hoa phân hóa đài tràng; đài 5 mảnh hình tam giác tù, tràng 5 cánh mỏng Hoa đực

có 5 nhị, chỉ nhị hình sợi, bao phấn hình trái xoan, bộ nhụy thoái hóa Hoa cái bộ nhị thoái hóa thành dạng vảy, bầu 2-3 lá noãn, dính nhau ở gốc và rời nhau ở phía trên; vòi nhụy ngắn, đầu nhụy có 5 thùy nông Quả nang có 3 mảnh vỏ, đường kính 4-5mm, khi chín màu tím nhạt, có tuyến tinh dầu rõ ở vỏ ngoài; mỗi nang chứa 1 hạt màu đen Mùa hoa quả tháng 9-11

Phân bố: Lạng Sơn, Bắc Giang, Sơn La, Hòa Bình, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Huế, Đà Nẵng Ngoài ra còn có ở Trung Quốc, Lào, Campuchia, Malaysia, Indonesia, Philippin [1], [11]

Bộ phận dùng: rễ, vỏ thân, lá, quả [3], [11]

Thành phần hóa học chính: alcaloid (alcaloid bishordeninyl terpen trong lá, benzophenanthridin trong vỏ thân và vỏ rễ), coumarin, flavonoid, sterol [13], [25], [37]

Tác dụng sinh học đã nghiên cứu: lá có tác dụng chống viêm [45]

1.4.3 Zanthoxylum nitidum (Roxb.) DC – Xuyên tiêu

Tên khác: Sưng, Hoàng liệt, Hạt sẻn, Hoa tiêu, Ba tiêu, Mac khen (Tày) [3] Cây bụi trườn, dài hàng mét Cành non có lông, khi già nhẵn; gai thưa, ngắn, dẹt Lá kép lông chim lẻ, mọc so le, gồm 5-9 lá chét mọc đối; lá chét hình trứng, gốc tròn, đầu nhọn, mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới nhạt hơn, có gai ở gân chính; cuống lá hình trụ, dài, có gai Cụm hoa mọc ở kẽ lá thành chùm; trục cụm hoa có lông ngắn Hoa đơn tính màu trắng, thơm; đài gồm 4-5 thùy nhọn, tràng 4-5 hình trái xoan Hoa đực có nhị dài hơn cánh hóa, chỉ nhị hình sợi, bộ nhụy thoái hóa Hoa cái có bộ nhụy tiêu giảm, bầu hình cầu gồm 4-5 lá noãn rời nhau; vòi nhụy dính liền hoàn toàn hay một phần; đầu nhụy phồng 4-5 thùy Quả nang, 1-5 nang,

vỏ quả ngoài có tuyến rõ, vỏ quả trong màu vàng, mỏng; mỗi phân quả chứa 1 hạt màu đen bóng [3], [11] Mùa hoa tháng 3-4, quả tháng 5-6 [1]

Phân bố: Lào Cai, Sơn La, Cao Bằng, Lạng Sơn, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Phú Thọ, Ninh Bình, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Trị, Đắc Lắc, Lâm Đồng, Khánh Hòa,

Tp Hồ Chí Minh Còn có ở Lào, Campuchia, Thái Lan, Trung Quốc (Hải Nam, Quảng Đông, Vân Nam), Đài Loan, Triều Tiên, Malaysia, Australia, New Zealand [1], [3]

Thành phần hóa học chính: alcaloid cấu trúc benzo[c]phenanthridin, quinolon, isoquinolon, berberin; tinh dầu (lá, quả), sterol, lignan [8], [19], [42], [46], [61]

Tác dụng sinh học đã nghiên cứu: lá có tác dụng bảo vệ tế bào não và chống oxy hóa [33], vỏ thân có tác dụng chống viêm [43], nitidin chiết xuất từ vỏ thân hoặc rễ có tác dụng chống ung thư [59], [63]

1.4.4 Zanthoxylum myriacanthum Wall Ex Hook f – Sẻn lá to

Tên khác: Hoàng mộc nhiều gai [1]

Cây gỗ nhỏ, thân cao tới 10m; thân và cành có nhiều gai màu đỏ, dẹt, thẳng hay hơi cong về phía trên Lá kép, mọc so le, gồm 11-15 lá chét; lá chét hình trứng- bầu dục, kích thước 15-20 x 4-10 cm, đỉnh tròn, gốc đối xứng; mép có răng nhỏ; gân chính có lông thưa, cuống lá có lông ngắn Cụm hoa ngù ở đầu cành, dài đến 1-cm; trục cụm hoa có lông ngắn Hoa không cuống, màu trắng Đài 4-5 thùy hình tam giác nhọn, nhẵn Tràng 4-5, hình trứng Hoa đực có 4 nhị; chỉ nhị hình sợi dài gấp 4 lần bao phấn, bầu thoái hóa hình vảy Hoa cái có bộ nhị tiêu giảm; bộ nhụy gồm có bầu hình trứng, gồm 2-5 lá noãn rời nhau, vòi nhụy liền nhau, rất ngắn Quả khô tự mở, 2-5 nang, mỗi nang chứa 2 hạt [11]

Phân bố: Cao Bằng, Lào Cai, Phú Thọ, Hà Nội, Lâm Đồng, Đồng Nai Còn

có ở Ấn Độ, Trung Quốc (Vân Nam, Quý Châu, Quảng Tây) [1]

Thành phần hóa học chính: tinh dầu (quả) [10], alcaloid trong vỏ thân [49], [58] Tác dụng sinh học: chưa có nghiên cứu

1.4.5 Zanthoxylum scandens Blume – Đắng cay

Tên khác: Thục tiêu, Hoàng mộc leo, Hoa tiêu [1], [11]

Cây bụi trườn; cành dài, mảnh, rủ xuống; có gai nhỏ, ngắn, cong Lá kép lông chim, gồm 7-13 (17) lá chét, mọc cách hay gần đối; hình trứng, kích thước 4-

10 x 1,5-4 cm; gốc hơi tròn, đỉnh nhọn, mép hơi có khía, mặt trên bóng; mặt dưới có 7-8 đôi gân bên nhỏ và rõ Cụm hoa ở nách lá đôi khi ở ngọn cành; trục cụm hoa có lông ngắn thưa; cuống hoa rất ngắn, có nhiều lá bắc hình vảy nhỏ Đài 4 thùy hình tam giác, dài 0,5 mm Tràng 4, hình trứng, dài 2-3mm, màu xanh vàng hay vàng nhạt Hoa đực có 4 nhị, chỉ nhị dài hơn cánh hoa; bầu thoái hóa hình bán nguyệt; vòi nhụy xẻ 4 thùy Hoa cái có bộ nhị thoái hóa dạng vảy; bộ nhụy gồm 3-4 lá noãn rời; vòi nhụy rời cong ra phía ngoài; đầu nhụy hơi phồng Quả nang, khi chín màu

đỏ tím; lớp vỏ ngoài nhăn nheo, vỏ quả trong mỏng; mỗi nang chứa 1 hạt hình cầu màu đen bóng [1], [11]

Phân bố: Lào Cai, Lạng Sơn, Cao Bằng, Hà Nội, Ninh Bình, Quảng Trị, Gia Lai, Lâm Đồng Ngoài ra còn có ở Ấn Độ, Trung Quốc, Lào, Đài Loan, Indonesia [1]

Thành phần hóa học chính: alcaloid (norchelerythrin, chelerythrin từ vỏ thân), 1

phenylpropanoid ester [(E)-O-geranylconiferyl alcohol (9Z, 12Z)-linoleate] [30]

Tác dụng sinh học: chưa có nghiên cứu

Chương 2ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Nguyên liệu nghiên cứu là rễ và phần trên mặt đất cây thuốc cung cấp dược liệu Hoàng lực được thu hái trực tiếp tại xã Yên Định - huyện Sơn Động – Bắc Giang vào tháng 11/2012 đến tháng 5 năm 2013 Gồm có:

- Cành mang lá và hoa tươi để nghiên cứu đặc điểm thực vật

- Rễ, thân, lá tươi được bảo quản trong hỗn hợp glycerin:cồn:nước (1:1:1) để cắt vi phẫu

- Rễ (tách lấy phẩn vỏ) và quả thu về cất tinh dầu lúc đang tươi

- Rễ thái lát mỏng, sấy ở nhiệt độ 50-600C đến khô, cất loại tinh dầu trước khi làm định tính và chiết xuất

Mẫu để nghiên cứu đặc điểm thực vật được xử lý và lưu trữ tiêu bản tại phòng tiêu bản Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội (HNIP) với mã số

là HNIP/17854/13

2.2 Phương tiện nghiên cứu

2.2.1 Hóa chất

- Các dung môi: methanol, ethanol, cloroform, ethylacetat, n-hexan…

- Các thuốc thử: các thuốc thử dùng trong định tính hóa học thường quy

- Sắc ký lớp mỏng: bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254 (Merck)

- Sắc ký cột: chất nhồi cột là silicagel pha thường, cỡ hạt 0,04 – 0,06 mm (Merck)

2.2.2 Thiết bị

- Tủ sấy Memmert, cân kỹ thuật, cân phân tích Precisa

- Máy xác định độ ẩm Sartorius MA45

- Bộ dụng cụ xác định hàm lượng nước theo phụ lục 12.13, Dược điển Việt Nam IV

- Dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay

- Kính hiển vi có gắn máy ảnh, kính lúp soi nổi

- Bộ dụng cụ cất tinh dầu cải tiến

- Máy cất quay Buchi B-480

- Bình chạy sắc ký, cột sắc ký đường kính 7cm và 3cm

- Máy chấm sắc ký Linomat 5 để đưa dịch chiết lên bản mỏng

- Đèn tử ngoại hai bước sóng 254 và 366nm Vilber Lourmat

- Hệ thống sắc ký khí kết hợp khối phổ GC system Agilent Technologies 7890A (Bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội)

- Máy đo điểm nóng chảy (Mp): Kofler micro-hotstage của Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Máy đo phổ hồng ngoại: FT-IR spectrophotometer 1650-Perkin Elmer (Viện Hóa học,VAST)

- Máy đo phổ khối lượng (EI-MS): Agilent 1100 LC-MSD Trap (Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên)

- Máy đo phổ cộng hưởng từ nhân 1H-NMR: Bruker 500 MHz Máy đo phổ DEPT và 13C-NMR: Bruker 125 MHz (Viện Hóa học,VAST) Dung môi: CDCl3

hoặc DMSO (dimethyl sulfoxyde)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu về thực vật

- Hình thái thực vật: đo đạc và mô tả tại thực địa, kết hợp với chụp ảnh

- Thu hái, làm tiêu bản mẫu cây và lưu giữ tiêu bản

- Giám định tên khoa học của cây dựa trên cơ sở phân tích đặc điểm thực vật,

so sánh với các khóa phân loại thực vật: Flore Générale de l’Indochine (1912) [65], Flora of China (2008) [60]

- Nghiên cứu giải phẫu thực vật: đặc điểm vi phẫu, vi học các bộ phận của cây được tiến hành theo phụ lục 12 – Dược điển Việt Nam IV [4], thực tập hình thái giải phẫu thực vật [16], kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi [23]

2.3.2 Nghiên cứu về hóa học

- Định tính các nhóm chất trong dược liệu theo phương pháp nghiên cứu hóa thực vật và hóa học cây thuốc [5], [6]

- Định tính bằng SKLM theo tài liệu [7]: SKLM được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silicagel GF254 (Merck) Phát hiện vết chất bằng đèn tử ngoại hai bước sóng 254 và 366 nm, hoặc dùng thuốc thử Dragendorff

- Định lượng tinh dầu bằng phương pháp cất kéo hơi nước [4], nhận dạng các thành phần trong tinh dầu bằng sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC/MS)

- Xác định độ ẩm bằng máy xác định độ ẩm tự động Sartorius MA45

- Phân lập các hợp chất trong dược liệu bằng sắc ký cột, theo dõi các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng

+ SKLM được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silicagel GF254 (Merck) Phát hiện vết chất bằng đèn tử ngoại hai bước sóng 254 và 366 nm, hoặc dùng thuốc thử Dragendorff

+ SKC được tiến hành với chất hấp phụ là silicagel pha thường (0,040-0,063

mm, Merck) Dung môi khai triển là các dung môi hữu cơ có thành phần và các tỷ

lệ khác nhau theo khảo sát từ SKLM Dịch rửa giải thu được được kiểm tra bằng SKLM để gộp thành các phân đoạn có chứa cùng thành phần Kết tinh các chất trong dung môi hay hệ dung môi phù hợp

- Xác định cấu trúc các chất phân lập được dựa trên các thông số vật lý (thể chất, nhiệt độ nóng chảy) và các dữ liệu phổ bao gồm: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (EI-MS), phổ cộng hưởng từ nhân một và hai chiều, phổ DEPT, đồng thời đối chiếu với các dữ liệu phổ chuẩn (đã được đăng trên các tạp chí khoa học hoặc sách)

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Xác định nguồn gốc thực vật

3.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật

Đặc điểm dược liệu Hoàng lực:

Dược liệu là những đoạn rễ hình trụ, thẳng hay cong queo, thường cắt thành những đoạn dài 30 - 40cm, đường kính 0,5 – 3cm, có thể đến 5cm Vỏ ngoài màu vàng nâu, nhiều nếp nhăn Mặt cắt ngang màu vàng sáng Mùi thơm hắc, vị rất đắng

Qua khảo sát tại thực địa, dược liệu Hoàng lực được thu hái từ các cây thuốc

có đặc điểm như sau:

Cây bụi trườn, thân và cành có nhiều gai cứng dài 3-6 mm, hướng xuống, các gai ở phần thân già có ụ gai

Lá mọc so le; lá kép lông chim lẻ, thường gồm từ 5-7 lá chét mọc đối, các lá

ở gần cụm hoa đôi khi có 3 lá chét Cuống lá chét hình trụ, mặt dưới có nhiều gai dài 1-2mm, cứng, hướng về phía gốc lá Mép lá chét nguyên, đôi khi có khía răng cưa nhỏ; phiến lá hình trứng, gốc tròn; ngọn lá nhọn hoặc có khía ở phần nhọn, 3-4,5 x 5,7-11,5 cm; gân hình lông chim; gân chính mặt trên hơi lồi, không có gai và không có túi tiết tinh dầu; mặt dưới lồi rõ, đôi khi không hoặc có 1-5 gai nhỏ hướng

về phía gốc lá chét, 10-16 đôi gân phụ

Cụm hoa mọc từ nách lá, chùm kép, dài 3-7 cm, trục cụm hoa phân nhánh, hoa có cuống 1-2 mm, có nhiều lông nhỏ

Hoa đơn tính khác gốc Hoa cái nhỏ, màu trắng xanh Trên cuống hoa cái có

1 lá bắc nhỏ, hình vẩy Bao hoa hai lớp gồm có 4 lá đài dính liền, 4 cánh tràng xếp xen kẽ với lá đài; bầu trên 4 ô, mỗi ô gồm 2 lá noãn dính liền, đính noãn trung trụ, 4 vòi và núm nhụy rời, hơi cong, núm nhụy dạng đầu

Hoa đực nhỏ, bao hoa màu trắng Lá bắc hình vẩy trên cuống hoa Bao hoa gồm 4 lá đài dính liền, 4 cánh tràng xếp xen kẽ với lá đài; có 4 nhị thò, gốc chỉ nhị

có màu tím hồng nhạt dần về phía đỉnh; bao phấn đính gốc, nứt dọc Đặc biệt, trên

hoa đực còn có bộ phận cái gồm bầu trên 1 ô không chứa lá noãn, có 4 núm nhụy rời, hơi cong

Quả nang, vỏ quả ngoài có nhiều điểm dầu, khi chín vỏ quả ngoài và trong rời nhau, mỗi mảnh quả có 1 hạt màu đen bóng

Ảnh chụp mẫu nghiên cứu được trình bày trong hình 3.2 và 3.3

Hình 3.2 Hình thái thực vật mẫu cây thuốc cung cấp vị thuốc Hoàng lực thu hái tại

Sơn Động – Bắc Giang

1 Cành mang hoa cái; 2 Một phần cụm hoa cái; 3 Hoa cái; 4 Cụm hoa đực; 5 Cành lá cây đực;

6 Hoa đực; 7 Hoa đực cắt dọc; 8 Bầu cắt ngang; 9 Hoa cái cắt dọc; 10 Cụm quả non

Hình 3.3 Dược liệu Hoàng lực

Đối chiếu với đặc điểm mô tả trong các tài liệu phân loại thực vật [1], [14], [60], [65] và được giám định bởi TS Nguyễn Quốc Huy – Bộ môn Thực vật, trường

Đại học Dược Hà Nội, cây thuốc được mô tả trên có tên khoa học là Zanthoxylum

nitidum (Roxb.) DC., tên thường dùng là Xuyên tiêu

Những kết quả của luận văn được trình bày dưới đây thống nhất tên gọi cây thuốc nghiên cứu là Xuyên tiêu, rễ Xuyên tiêu là dược liệu Hoàng lực

3.1.2 Đặc điểm giải phẫu

- Đặc điểm vi phẫu rễ:

Mặt cắt rễ có thiết diện tròn, từ ngoài vào trong có: Lớp bần tương đối dày gồm 5-6 lớp tế bào hình đa giác xếp thành vòng đồng tâm và dãy xuyên tâm, có nhiều chỗ bị nứt, rách (1) Mô mềm vỏ cấu tạo từ những tế bào kích thước không đều nhau, thành mỏng (2) Các đám tế bào cứng nằm trong libe, phía sát mô mềm (3) Libe gồm những tế bào nhỏ, xếp thành từng đám hình nón (5) cùng với các bó gỗ ở phía trong tạo thành từng chồng libe-gỗ riêng lẻ, trong libe có nhiều bó sợi (4) Rải rác trong libe

và mô mềm có các tế bào chứa tinh dầu (6) Gỗ có nhiều mạch gỗ to, nhỏ khác nhau, các bó gỗ xuất phát từ tâm (7) Tầng phát sinh libe-gỗ nằm giữa gỗ và libe, gồm các

tế bào đang biệt hóa tạo ra gỗ ở phía trong và libe ở ngoài (8) Tia ruột cấu tạo từ 3 - 5 hàng tế bào thành mỏng, xếp thành dãy xuyên tâm (9)

- Đặc điểm vi phẫu thân:

Mặt cắt thân có thiết diện tròn, từ ngoài vào trong có: Lớp bần gồm 5-6 lớp tế bào hình đa giác xếp thành vòng đồng tâm và dãy xuyên tâm (1) Mô mềm vỏ cấu tạo

từ những tế bào kích thước không đều nhau, những tế bào ở ngoài gần bần kích thước nhỏ hơn, các tế bào ở giữa mô mềm có kích thước lớn, thành mỏng (2) Libe gồm những tế bào nhỏ, xếp thành từng đám hình nón (5), trong libe có nhiều sợi xếp thành

bó (3) Gỗ có nhiều mạch gỗ to, nhỏ khác nhau (6) Tầng phát sinh libe-gỗ nằm giữa libe và gỗ, gồm các tế bào thành mỏng, dẹt (7) Tia ruột cấu tạo từ 2-3 hàng tế bào thành mỏng, xếp thành dãy xuyên tâm (4) Mô mềm ruột cấu tạo từ các tế bào kích thước lớn, hình đa giác, thành mỏng (8) Đặc biệt, trong cùng là đám tế bào cứng có thành dày, ống trao đổi rõ (9)

- Đặc điểm vi phẫu lá:

Phần gân lá: Biểu bì trên (1) và biểu bì dưới (9) gồm 1 lớp tế bào xếp đều đặn Biểu bì dưới có lông che chở đơn bào (7) Mô dày xếp sát biểu bì trên (2) và cung mô dày xếp sát biểu bì dưới (8) gồm các tế bào nhỏ, hình đa giác, thành dày

Mô mềm gồm các tế bào thành mỏng, kích thước lớn (3) Bó libe – gỗ gồm vòng libe phía ngoài (4) bao quanh vòng gỗ phía trong (5) Phía ngoài libe có các bó sợi libe không liên tục (6) Vòng gỗ gồm các mạch gỗ to nhỏ không đều, xếp thành vòng bao quanh mô mềm

Phần phiến lá: Biểu bì trên (10) và dưới (14) cấu tạo bởi 1 hàng tế bào xếp đều đặn Biểu bì dưới rải rác có lỗ khí gồm hai tế bào hình hạt đậu úp mặt lõm vào nhau để hở khe lỗ khí (15) Mô giậu gồm từ 1-2 hàng tế bào hình chữ nhật xếp đều đặn ở sát biểu bì trên (11) Mô khuyết được cấu tạo bởi những tế bào xếp lộn xộn để

hở những lỗ khuyết nhỏ (13) Bó libe – gỗ gân phụ Tinh thể calci oxalat hình cầu gai (12) nằm ngay sát dưới hàng tế bào mô giậu

Hình 3.4 Vi phẫu rễ

Xuyên tiêu

1 Bần;2 Mô mềm vỏ;

3 Đám tế bào cứng;

4 Sợi; 5 Libe; 6 Tế bào

chứa tinh dầu; 7 Gỗ;

8 Tầng phát sinh libe-gỗ

9 Tia ruột

Hình 3.5 Vi phẫu thân Xuyên tiêu

Ảnh chụp đặc điểm bột dược liệu Hoàng lực được trình bày ở hình 3.7

Hình 3.7 Đặc điểm bột dược liệu Hoàng lực 1,2 Mảnh bần; 3 Mảnh mô mềm; 4 Mảnh mạch; 5 Sợi, bó sợi;

6 Các tế bào có chiết xuất lớn; 7 Tế bào cứng; 8 Tinh bột; 9 Tinh thể calci oxalat

3.2 Thành phần hóa học

3.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ

3.2.1.1 Định tính tinh dầu và các nhóm chất bằng phản ứng hóa học [5], [6]

- Định tính tinh dầu: bằng phương pháp cất kéo hơi nước

Kết quả: có lớp tinh dầu trong ống hứng

Kết luận: Dược liệu có tinh dầu

- Định tính alcaloid

Cho 10g bột dược liệu (đã cất loại tinh dầu) vào bình nón dung tích 100ml, thấm ẩm dược liệu bằng dung dịch amoniac đặc, đậy kín bình trong 30 phút Cho thêm 15ml chloroform, lắc đều, ngâm 24 giờ Lọc lấy dịch chiết cho vào bình gạn Lắc dịch chiết chloroform với dung dịch acid sulfuric 1N 2 lần, mỗi lần 10 ml Để phân lớp, gạn lấy dịch chiết acid, cho vào 3 ống nghiệm mỗi ống 1ml để làm các phản ứng định tính:

Ống 1: 2-3 giọt thuốc thử Mayer, thấy có tủa màu trắng

Ống 2: 2-3 giọt thuốc thử Bouchardat, thấy có tủa màu nâu

Ống 3: 2-3 giọt thuốc thử Dragendorff, thấy có tủa màu cam

Kết luận: Dược liệu có chứa alcaloid

- Định tính Flavonoid

Lấy 10g dược liệu (đã cất loại tinh dầu) bình nón dung tích 100ml có nút mài, thêm 50ml ethanol 90% Đun cách thủy 10 phút Lọc nóng qua giấy lọc gấp nếp Dùng dịch lọc để làm các phản ứng:

+ Phản ứng với hơi amoniac đặc: Nhỏ 2 giọt dịch chiết lên 2 vị trí của tờ giấy

lọc Để khô, quan sát dưới ánh sáng thường, sau đó hơ 1 vết lên miệng lọ amoniac đặc

Kết quả: màu vàng của vết hơ aminiac đậm lên rõ rệt so với vết đối chứng + Phản ứng với NaOH: cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm vào vài giọt dung dịch NaOH 10%

Kết quả: xuất hiện tủa màu vàng

- Phản ứng với FeCl3 5%

Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm 2-3 giọt dung dịch FeCl3 5%

Kết quả: xuất hiện tủa màu xanh đen

- Phản ứng với thuốc thử diazo

Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch kiềm loãng (dung dịch NaOH, KOH, Na2CO3), thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha, lắc đều (có thể đun nóng trên nồi cách thủy trong vài phút)

Kết quả: dịch trong ống nghiệm chuyển sang màu đỏ cam

Kết luận: Dược liệu có chứa flavonoid

Thêm 2 ml nước cất vào cả 2 ống nghiệm Lắc đều, quan sát

Acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, quan sát

Kết quả: ống 1 có tủa vàng khi kiềm hóa, thêm nước thì tủa tan, acid hóa lại

có tủa trở lại; ống 2 có tủa đục khi thêm nước

+ Phản ứng với thuốc thử diazo

Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm 2ml dung dịch NaOH 10% Đun

cách thuỷ sôi 5 phút rồi để nguội Thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha

Kết quả: xuất hiện tủa màu đỏ gạch

Kết luận: Dược liệu có chứa coumarin

- Định tính anthranoid

+ Phản ứng Borntraeger

Cho 5g bột dược liệu (đã cất loại tinh dầu) vào bình nón 100ml, thêm 50ml dung dịch H2SO4 10% Đun sôi cách thủy trong 10 phút Lọc nóng, cho dịch chiết vào bình gạn Để nguội, rồi lắc với 5ml chloroform Gạn lấy lớp chloroform, lấy 1ml cho vào ống nghiệm Thêm 1ml dung dịch NaOH 10%, lắc, quan sát không thấy xuất hiện màu đỏ

Kết luận: Dược liệu không có anthranoid

- Định tính saponin

+ Quan sát hiện tượng tạo bọt

Cho 1g bột dược liệu (đã cất loại tinh dầu) vào ống nghiệm to, thêm 5ml nước, đun sôi nhẹ, lọc nóng Dịch lọc cho vào ống nghiệm to, thêm 5ml nước Lắc mạnh trong 5 phút theo chiều dọc ống nghiệm, để yên Quan sát

Kết quả: cột bọt bền vững sau 15 phút

+ Phản ứng Salkowski: Cho vào ống nghiệm to 2g dược liệu, thêm vào 10ml ethanol 90%, đun sôi cách thủy Lọc lấy dịch lọc, lấy 1ml cho vào ống nghiệm khác Để ống nghiệm nghiêng 450, cho từ từ theo thành ống nghiệm 1ml acid sulfuric đặc Quan sát

Kết quả: quan sát thấy có màu nâu đỏ

Kết luận: Dược liệu có chứa saponin

- Định tính glycosid tim:

Cho 10g bột dược liệu (đã cất loại tinh dầu) vào bình nón dung tích 100ml, thêm 20ml ethanol 90%, lắc đều, ngâm 24h Lọc lấy dịch chiết, pha loãng với khoảng 50ml nước cất để hạ độ cồn Loại tạp bằng chì acetat 30% đến dư Để lắng, lọc Loại chì acetat bằng dung dịch Na2SO4 bão hòa đến khi không còn tủa với

Na2SO4 nữa Lọc lấy dịch lọc vào bình gạn, lắc kỹ 2 lần với chloroform, mỗi lần 20ml, để lắng, gạn và lọc qua bông thu lấy dịch chiết chloroform Chia dịch chiết vào 4 ống nghiệm nhỏ, đem cô cách thủy đến khô Cắn thu được dùng để làm các phản ứng sau:

+ Phản ứng Liebermann:

Hòa tan cắn với 1ml anhydrid acetic, đặt nghiêng ống nghiệm một góc 450

Thêm từ từ 1ml acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm để dịch lỏng trong ống nghiệm chia thành 2 lớp

Kết quả: mặt xúc giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện vòng màu tím đỏ, lắc lên tạo thành dung dịch màu xanh đậm