2.1. Đối tượng nghiên cứu
Nguyên liệu nghiên cứu là rễ và phần trên mặt đất cây thuốc cung cấp dược liệu Hoàng lực được thu hái trực tiếp tại xã Yên Định - huyện Sơn Động – Bắc Giang vào tháng 11/2012 đến tháng 5 năm 2013. Gồm có:
- Cành mang lá và hoa tươi để nghiên cứu đặc điểm thực vật.
- Rễ, thân, lá tươi được bảo quản trong hỗn hợp glycerin:cồn:nước (1:1:1) để cắt vi phẫu.
- Rễ (tách lấy phẩn vỏ) và quả thu về cất tinh dầu lúc đang tươi.
- Rễ thái lát mỏng, sấy ở nhiệt độ 50-600C đến khô, cất loại tinh dầu trước khi làm định tính và chiết xuất.
Mẫu để nghiên cứu đặc điểm thực vật được xử lý và lưu trữ tiêu bản tại phòng tiêu bản Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội (HNIP) với mã số là HNIP/17854/13.
2.2. Phương tiện nghiên cứu
2.2.1. Hóa chất
- Các dung môi: methanol, ethanol, cloroform, ethylacetat, n-hexan… - Các thuốc thử: các thuốc thử dùng trong định tính hóa học thường quy. - Sắc ký lớp mỏng: bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254 (Merck).
- Sắc ký cột: chất nhồi cột là silicagel pha thường, cỡ hạt 0,04 – 0,06 mm (Merck).
2.2.2. Thiết bị
- Tủ sấy Memmert, cân kỹ thuật, cân phân tích Precisa. - Máy xác định độ ẩm Sartorius MA45.
- Bộ dụng cụ xác định hàm lượng nước theo phụ lục 12.13, Dược điển Việt Nam IV.
- Dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay.
- Kính hiển vi có gắn máy ảnh, kính lúp soi nổi. - Bộ dụng cụ cất tinh dầu cải tiến.
22
- Bình chạy sắc ký, cột sắc ký đường kính 7cm và 3cm.
- Máy chấm sắc ký Linomat 5 để đưa dịch chiết lên bản mỏng. - Đèn tử ngoại hai bước sóng 254 và 366nm Vilber Lourmat.
- Hệ thống sắc ký khí kết hợp khối phổ GC system Agilent Technologies 7890A (Bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội).
- Máy đo điểm nóng chảy (Mp): Kofler micro-hotstage của Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Máy đo phổ hồng ngoại: FT-IR spectrophotometer 1650-Perkin Elmer (Viện Hóa học,VAST).
- Máy đo phổ khối lượng (EI-MS): Agilent 1100 LC-MSD Trap (Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên).
- Máy đo phổ cộng hưởng từ nhân 1H-NMR: Bruker 500 MHz. Máy đo phổ DEPT và 13C-NMR: Bruker 125 MHz (Viện Hóa học,VAST). Dung môi: CDCl3
hoặc DMSO (dimethyl sulfoxyde).
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Nghiên cứu về thực vật
- Hình thái thực vật: đo đạc và mô tả tại thực địa, kết hợp với chụp ảnh. - Thu hái, làm tiêu bản mẫu cây và lưu giữ tiêu bản.
- Giám định tên khoa học của cây dựa trên cơ sở phân tích đặc điểm thực vật, so sánh với các khóa phân loại thực vật: Flore Générale de l’Indochine (1912) [65], Flora of China (2008) [60].
- Nghiên cứu giải phẫu thực vật: đặc điểm vi phẫu, vi học các bộ phận của cây được tiến hành theo phụ lục 12 – Dược điển Việt Nam IV [4], thực tập hình thái giải phẫu thực vật [16], kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi [23].
2.3.2. Nghiên cứu về hóa học
- Định tính các nhóm chất trong dược liệu theo phương pháp nghiên cứu hóa thực vật và hóa học cây thuốc [5], [6].
- Định tính bằng SKLM theo tài liệu [7]: SKLM được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silicagel GF254 (Merck). Phát hiện vết chất bằng đèn tử ngoại hai bước sóng 254 và 366 nm, hoặc dùng thuốc thử Dragendorff.
23
- Định lượng tinh dầu bằng phương pháp cất kéo hơi nước [4], nhận dạng các thành phần trong tinh dầu bằng sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC/MS).
- Xác định độ ẩm bằng máy xác định độ ẩm tự động Sartorius MA45.
- Phân lập các hợp chất trong dược liệu bằng sắc ký cột, theo dõi các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng.
+ SKLM được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silicagel GF254 (Merck). Phát hiện vết chất bằng đèn tử ngoại hai bước sóng 254 và 366 nm, hoặc dùng thuốc thử Dragendorff.
+ SKC được tiến hành với chất hấp phụ là silicagel pha thường (0,040-0,063 mm, Merck). Dung môi khai triển là các dung môi hữu cơ có thành phần và các tỷ lệ khác nhau theo khảo sát từ SKLM. Dịch rửa giải thu được được kiểm tra bằng SKLM để gộp thành các phân đoạn có chứa cùng thành phần. Kết tinh các chất trong dung môi hay hệ dung môi phù hợp.
- Xác định cấu trúc các chất phân lập được dựa trên các thông số vật lý (thể chất, nhiệt độ nóng chảy) và các dữ liệu phổ bao gồm: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (EI-MS), phổ cộng hưởng từ nhân một và hai chiều, phổ DEPT, đồng thời đối chiếu với các dữ liệu phổ chuẩn (đã được đăng trên các tạp chí khoa học hoặc sách).
24
Chương 3