- Phản ứng Cyanidin:
3.2.3.Chiết xuất, phân lập các chất trong dược liệu Hoàng lực
3.2.3.1. Chiết xuất
Trong quá trình định tính nhận thấy nhóm chất alcaloid có phản ứng dương tính rõ nhất. Vì vậy trong khuôn khổ luận văn, quy trình chiết xuất định hướng theo nhóm chất chính là alcaloid với nguyên liệu là dược liệu đã cất loại tinh dầu.
Bột dược liệu (đã cất loại tinh dầu, 2,5 kg) được chiết bằng phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng (25-300C) với 5 lít ethanol 90% trong 24 giờ, thỉnh thoảng khuấy trộn, lặp lại 3 lần. Gộp dịch chiết và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao 1:10 (màu nâu vàng). Phân tán cao này trong 1 lít dung dịch acid sulfuric 2%, khuấy kỹ, lọc, lặp lại 2 lần thu lấy pha nước có chứa alcaloid dạng muối. Kiềm hóa dịch lọc acid bằng dung dịch amoniac đậm đặc đến pH 11-12, rồi lắc kỹ với CHCl3 đến khi dung môi hữu cơ nhạt màu (2l x 5 lần), thu lấy dịch chiết CHCl3 chứa alcaloid ở dạng base. Cất thu hồi dung môi hữu cơthu lấy cắn alcaloid thô (25g).
Quy trình chiết xuất được trình bày ở hình 3.9.
+ H2SO42%, khuấy kỹ, lọc, lặp lại 2 lần.
+ dd NH3 đặcđến pH 11-12. + CHCl3, lắc, gạn
Cất thu hồi dung môi
Cao 1:10
+ Ethanol 90%, 24h x 3 lần. Cất thu hồi dung môi.
Dược liệu (đã cất loại tinh dầu)
Alcaloid (muối)/H2SO4
Alcaloid base/CHCl3
Cắn alcaloid thô
44
3.2.3.2. Phân lập
* Tách các phân đoạn từ cắn alcaloid thô
Chuẩn bị cột: cột sắc ký khô, sạch, kích thước 7x50 cm, được lắp thẳng đứng trên giá cố định. Lót một lớp bông (loại thấm nước) vào đoạn từ vòi lên đáy cột.
Tiến hành: silicagel pha thường (Merck, 0,040-0,063mm, hoạt hóa ở 1100
C trong 1 giờ) được phân tán vào dung môi n-hexan thành hỗn dịch đồng đều. Mở khóa cột, rót hỗn dịch thành dòng từ từ vào cột, vừa rót vừa gõ nhẹ. Dùng dung môi hứng được rót lại lên cột và cho chảy liên tục đến khi chiều cao của silicagel không thay đổi trên cột. Khi cột đã ổn định, cho dung môi chảy đến khi cách bề mặt khoảng 1cm, khóa cột và tiến hành nhồi cắn.
Đưa cắn lên cột: cắn alcaloid thô được hòa tan trong lượng tối thiểu dung môi chloroform rồi tẩm với lượng vừa đủ silicagel, sau đó cất thu hồi dung môi cho đến khi thu được bột khô tơi. Đưa cắn lên cột sao cho bột tạo thành lớp bằng phẳng, lót một lớp bông lên trên bề mặt cắn để tránh xáo trộn.
Rửa giải với hệ dung môi n-hexan:ethylacetat lần lượt là: 100% n-hexan, 40:1, 20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 1:1, 100% EtOAc và 100% MeOH (v:v), mỗi tỷ lệ khoảng 1000ml.
Hứng dịch rửa giải vào các bình nón dung tích 100ml, đồng thời tiến hành kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi n-hexan:ethylacetat (6:4), gộp các bình có vết giống nhau trên sắc ký đồ, thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 12 phân đoạn (ký hiệu từ A1 đến A12).
* Phân lập chất HL1 từ phân đoạn A7
Phân đoạn A7 (200 mg) được tiếp tục phân tách bằng sắc ký cột silicagel pha thường tương tự như trên với cột có kích thước 3x70 cm. Rửa giải với hệ dung môi n-hexan:ethylacetat (15:1; v:v). Hứng dịch rửa giải vào các ống nghiệm khô, sạch, mỗi ống 10ml. Kiểm tra bằng SKLM, gộp các ống có SKĐ giống nhau thu được 5 phân đoạn nhỏ (ký hiệu từ A7-1 đến A7-5).
Trong đó SKĐ phân đoạn A7-3 có 2 vết, trong đó có 1 vết rất mờ. Sau khi để bay hơi bớt dung môi thấy xuất hiện tinh thể hình kim. Tiến hành kết tinh lại trong
45
hệ dung môi CHCl3:MeOH (2:1) thu được hợp chất 1 (tinh thể hình kim, màu hơi ngà vàng, ký hiệu HL1, 25 mg).
* Phân lập chất HL2 từ phân đoạn A9
Phân đoạn A9 (100 mg) được tiến hành sắc ký cột với cột có kích thước 3x70cm, silicagel pha thường (Merck, 0,040-0,063mm) và rửa giải với hệ dung môi n-hexan:ethylacetat (12:1) tương tự như trên thu được 6 phân đoạn (ký hiệu từ A9-1 đến A9-6).
Phân đoạn A9-6 (35 mg) được tiếp tục sắc ký cột với silicagel pha thường, hệ dung môi rửa giải CHCl3:MeOH (10:1), theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng và gộp các ống có 1 vết trên sắc ký đồ. Để bay hơi dung môi ở nhiệt độ thường, thu được hợp chất 2 (chất rắn màu vàng, ký hiệu HL2, 10 mg).
SKC, silicagel thường, n-hexan:EtOAc (12:1, v:v) SKC, silicagel thường,
n-hexan:EtOAc (15:1, v:v).
Kết tinh lại trong CHCl3:MeOH (2:1) SKC, silicagel thường, CHCl3:MeOH (10:1, v:v) SKC, silicagel thường. n-hexan:EtOAc (100% n-hexan, 40:1, 20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 1:1, 100% EtOAc và 100% MeOH; v:v). Cắn alcaloid thô PĐ A9 PĐ A1, A2 PĐ A7-3 Hợp chất 1 (ký hiệu HL1, 25 mg) Hợp chất 2 (ký hiệu HL2, 10 mg) PĐ A10, A11, A12 PĐ A3, A4 PĐ A5, A6 PĐ A7 PĐ A7- 1, 2 PĐ A7- 4, 5, 6 PĐ A8 PĐ A9- 1, 2, 3 PĐ A9- 4, 5 PĐ A9-6
46
3.2.3.3. Kiểm tra sự có mặt của HL1, HL2 trong dịch chiết ethanol và alcaloid thô
Để kiểm tra sự có mặt của HL1, HL2 trong cắn ethanol và alcaloid thô, tiến hành SKLM với dịch chấm sắc ký là HL1 và HL2 hòa tan trong methanol, chấm đối chứng trên cùng một bản mỏng với dịch chiết ethanol và alcaloid thô.
Hệ dung môi khai triển: Hệ 2: n-hexan:ethylacetat (4:1) Hệ 4: chloroform:methanol (6:1)
Sau khi triển khai lấy bản mỏng ra, sấy nhẹ cho bay hết dung môi. Bản mỏng sắc ký được quan sát dưới ánh sáng thường, đèn tử ngoại 2 bước sóng 254nm và 366nm. Sau đó hiện màu bằng thuốc thử dragendorff.
Hình 3.11. Sắc ký đồ của HL1 và dịch chiết ethanol,
alcaloid thô (hệ 2) (*)
1. dịch chiết ethanol; 2. dịch chiết alc thô; 3. HL1
Hình 3.12. Sắc ký đồ của HL2 và dịch chiết ethanol,
alcaloid thô (hệ 4) (*)
1. cắn ethanol; 2. cắn alc toàn phần; 3. HL2
Ghi chú: (*) a. SKĐ quan sát dưới UV 254nm; b. SKĐ quan sát dưới UV 366nm c. SKĐ sau khi phun thuốc thử dragendorff quan sát ở ánh sáng thường.
Như vậy qua SKĐ trên ta có thể thấy chất HL1, HL2 có trong dịch chiết ethanol và alcaloid thô từ dược liệu Hoàng lực.
47
3.2.3.4. Tính chất và thử độ tinh khiết của chất phân lập được
* HL1:
Tinh thể hình kim màu hơi ngà vàng.
Tan trong dung môi chloroform, aceton; ít tan trong methanol và n-hexan. Có phản ứng dương tính với thuốc thử Dragendorff (màu vàng cam). Nhiệt độ nóng chảy: 163-1640
C
* HL2:
Chất rắn màu vàng.
Tan trong methanol, ít tan trong chloroform, n-hexan.
Có phản ứng dương tính với thuốc thử Dragendorff (màu vàng cam). Nhiệt độ nóng chảy: 281-2830
C
* Thử độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng:
Chuẩn bị dịch chấm sắc ký: hòa tan HL1, HL2 trong dung môi methanol làm dịch chấm sắc ký.
Bản mỏng silicagel GF254 (Merck) tráng sẵn được hoạt hóa ở 1100C trong 1 giờ. Hệ dung môi khai triển: Hệ 2: n-hexan:ethylacetat (4:1);
Hệ 3: n-hexan:ethylacetat (15:1); Hệ 4: chloroform:methanol (6:1) Hệ 5: chloroform:methanol (10:1). Hệ 6: dichloromethan:methanol (7:1)
Sau khi triển khai lấy bản mỏng ra, sấy nhẹ cho bay hết dung môi. Bản mỏng sắc ký được quan sát dưới ánh sáng thường, đèn tử ngoại 2 bước sóng 254nm và 366nm. Sau đó hiện màu bằng thuốc thử dragendorff.
Kết quả: trên sắc ký đồ của chất HL1 triển khai với hệ dung môi 2, 3, 5 chỉ có 1 vết có Rf lần lượt là 0,39; 0,12; 0,84. Sắc ký đồ của chất HL2 triển khai với hệ dung môi 4, 5, 6 chỉ có 1 vết có Rf lần lượt là 0,19; 0,08; 0,75.
48
Hình 3.13. Chất HL1 và HL2
Hình 3.14. Sắc ký đồ chất HL1 với 3 hệ dung môi lần lượt là 2, 3, 5 (**)
Hình 3.15. Sắc ký đồ chất HL2 với 3 hệ dung môi lần lượt là 4, 5, 6 (**)
Ghi chú: (**) 1. SKĐ quan sát dưới UV 254nm; 2. SKĐ quan sát dưới UV 366nm; 3. SKĐ sau khi phun thuốc thử dragendorff quan sát ở ánh sáng thường.
49