đồ án tốt nghiệp tình hình nhiễm vi khuẩn listeria monocytogenes trên dưa muối chua

Ngoài ra, acid lactic còn có tác dụng làm giảm pH của sản phẩm, ức chế hoạt động của nhiều loại vi sinh vật gây hư hỏng sản phẩm và có tính chất sát trùng vừa nhằm mục đích bảo quản rau

của thầy cô và bạn bè Nhân đây tôi xin chân thành cảm ơn:

Quý thầy cô trường Đại học Nha Trang đã xây dựng những kiến thức cần thiết để tôi có thể thực hiện tốt nghiên cứu đồ án tốt nghiệp

Quý thầy cô Khoa Công nghệ thực phẩm đã hỗ trợ, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình nghiên cứu

Thạc sĩ Nguyễn Thị Thanh Hải người trực tiếp chỉ dẫn, truyền đạt kiến thức cung cấp những tài liệu, đóng góp ý kiến cho tôi trong suốt quá trình hoàn thành nghiên cứu đồ án và báo cáo đồ án

Quý thầy cô thuộc các Phòng thí nghiệm Trung tâm thí nghiệm thực hành đã tạo điều kiện giúp đỡ về tinh thần cũng như vật chất trong thời gian nghiên cứu đồ án

Gia đình đã ủng hộ, khích lệ trong thời gian qua

Cùng các bạn trong Khoa Công Nghệ Thực Phẩm đã hỗ trợ, giúp đỡ trong quá trình nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những người đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua để quá trình nghiên cứu và bài báo cáo nghiên cứu đồ án tốt nghiệp được hoàn thành tốt đẹp

Tuy nhiên, do kiến thức, kinh nghiệm và thời gian có hạn nên khó tránh khỏi những thiếu sót Kính mong sự thông cảm và góp ý của quý thầy cô cùng các bạn để

có thể củng cố kiến thức và rút ra những kinh nghiệm cho bản thân Tôi xin chân thành cảm ơn

Nha Trang, ngày… tháng… năm 2012

Sinh viên

Nguyễn Quỳnh Nhi

MỤC LỤC

TRANG LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC i

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I : TỔNG QUAN 4

1.1 TỔNG QUAN VỀ CẢI BẸ XANH: 4

1.1.1 Giới thiệu về họ rau cải: 4

1.1.2 Cải bẹ xanh: 4

1.1.1.1 Nguồn gốc: 5

1.1.1.2 Thành phần hóa học của cải bẹ xanh: 5

1.1.1.3 Công dụng của cải bẹ xanh: 5

1.2 TỔNG QUAN VỀ RAU QUẢ MUỐI CHUA: 6

1.2.1 Giới thiệu về rau quả muối chua: 6

1.2.2 Quá trình lên men lactic trong rau cải muối chua: 7

1.3 TỔNG QUAN VỀ QUÁ TRÌNH LÊN MEN LACTIC: 8

1.3.1 Tác nhân vi sinh sử dụng trong quá trình lên men lactic: 8

1.3.1.1 Giới thiệu tổng quan về vi khuẩn lactic: 8

1.3.1.2 Đặc điểm hình thái: 9

1.3.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa: 9

1.3.1.4 Phân loại chủng vi khuẩn lactic: 11

1.3.2 Bản chất hóa sinh, cơ chế quá trình lên men lactic: 13

1.3.2.1 Bản chất của quá trình lên men lactic: 13

1.3.2.2 Quá trình lên men: 14

1.3.3 Khả năng ức chế của quá trình lên men lactic với vi sinh vật gây bệnh: 17

1.3.4 Ứng dụng của quá trình lên men lactic: 19

1.3.4.1 Ứng dụng trong công nghệ bảo quản và chế biến thực phẩm: 19

1.3.4.2 Trong chăn nuôi thú y: 20

1.3.4.3 Trong y học: 20

1.3.4.4 Trong công nghiệp: 21

1.3.4.5 Trong nông nghiệp và môi trường: 21

1.3.4.6 Một số ứng dụng khác của acid lactic: 21

1.4 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN Listeria monocytogenes: 21

1.4.1 Lịch sử phát hiện: 21

1.4.2 Phân loại: 22

1.4.3 Đặc điểm hình thái: 23

1.4.4 Khả năng chịu đựng: 23

1.4.5 Phân bố và nguồn lây nhiễm: 23

1.4.6 Con đường xâm nhiễm: 24

1.4.7 Khả năng gây bệnh: 25

1.4.8 Điều trị và cách phòng ngừa: 26

1.5 TÌNH HÌNH NHIỄM VI KHUẨN Listeria monocytogenes TRONG THỰC PHẨM TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM HIỆN NAY 27

1.5.1 Tình hình thế giới: 27

1.5.2 Tình hình ở Việt Nam: 27

1.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG Listeria monocytogenes TRONG THỰC PHẨM: 29

1.6.1 Phương pháp truyền thống : 29

1.6.2 Một số phương pháp hiện đại khác: 30

CHƯƠNG II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU: 31

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Listeria monocytogenes NHIỄM TRÊN NGUYÊN LIỆU CẢI BẸ XANH VÀ DƯA CẢI MUỐI CHUA: 31

2.2.1 Mẫu nghiên cứu: 31

2.2.2 Các loại hóa chất và dụng cụ thí nghiệm: 31

2.2.2.1 Hóa chất và môi trường: 31

2.2.2.2 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm: 32

2.2.3 Quy trình muối chua cải bẹ xanh: 33

2.2.4 Bố trí thí nghiệm: 36

2.2.4.1 Nghiên cứu mức độ nhiễm Listeria monocytogenes trên nguyên liệu cải bẹ xanh: 36

2.2.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch lên men chua tới sự sinh trưởng và phát triển của Listeria monocytogenes theo thời gian lên men 37

2.2.4.3 Sơ đồ quy trình kiểm tra Listeria monocytogenes : 38

2.2.4.4 Tra Bảng Mac Crandy 44

2.2.5 Khảo sát khả năng kháng của dịch lên men chua tới sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Listeria monocytogenes: 44

2.3 Phương pháp xử lý số liệu: 46

CHƯƠNG III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47

3.1 Mức độ nhiễm Listeria monocytogenes trên nguyên liệu cải bẹ xanh: 47

3.2 Mức độ nhiễm Listeria monocytogenes trên nguyên liệu sau khi rửa và làm héo: 48

3.3 Ảnh hưởng của dịch lên men chua 7 % muối tới sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Listeria monocytogenes theo thời gian lên men 49

3.4 Ảnh hưởng của dịch lên men chua 7 % muối bổ sung 10 % nước chua cũ tới sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Listeria monocytogenes theo thời gian lên men .51

3.5 Khả năng kháng của dịch lên men chua tới sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Listeria monocytogenes qua các ngày lên men .53

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC 1

PHỤ LỤC 2

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1: Vitamin và các chất sinh trưởng cần thiết cho sinh trưởng của các vi

khuẩn lactic (theo K Buchta, 1983) 11

Bảng 1.2: Số vụ ngộ độc thực phẩm tháng 1/2012 - tháng 5/2012 28

Bảng 2.1: Tính chất sinh hóa của Listeria monocytogenes 44

Bảng 3.1: Mức độ nhiễm Listeria monocytogenes (MPN/g) trên nguyên liệu 47

Bảng 3.2: Mức độ nhiễm Listeria monocytogenes (MPN/g) trên nguyên liệu sau khi rửa và làm héo 48

Bảng 3.3: Mức độ nhiễm Listeria monocytogenes (MPN/g) trên dưa muối chua với dịch lên men chua 7 % muối 50

Bảng 3.4: Mức độ nhiễm Listeria monocytogenes (MPN/g) trên dưa muối chua với dịch lên men chua 7 % muối bổ sung 10 % nước chua cũ 52

Bảng 3.5: Khả năng kháng của dịch lên men chua 7 % muối qua các ngày lên men tới sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Listeria monocytogenes 54

Bảng 3.6: Khả năng kháng của dịch lên men chua 7 % muối bổ sung 10 % nước chua cũ qua các ngày lên men tới sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Listeria monocytogenes 56

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1: Cây cải bẹ xanh và lá cây cải bẹ được cắt ra 4

Hình 1.2: Vi khuẩn Streptococcus cremoris 12

Hình 1.3: Sơ đồ tổng quát tạo acid lactic 14

Hình 1.4: Sơ đồ quá trình lên men lactic đồng hình 15

Hình 1.5: Sơ đồ quá trình lên men lactic dị hình 16

Hình 1.6: Cơ chế kháng vi sinh vật của bacteriocin (Cotter et al., 2005) 19

Hình 1.7: Vi khuẩn Listeria monocytogenes 23

Hình 1.8: Quá trình xâm nhiễm và tác hại của Listeria monocytogenes 24

Hình 2.1: Sơ đồ quy trình muối chua cải bẹ 33

Hình 2.2: Sản phẩm dưa cải muối chua 35

Hình 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu mức độ nhiễm Listeria monocytogenes trên nguyên liệu cải bẹ xanh 36

Hình 2.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu mức độ nhiễm Listeria monocytogenes trên dưa muối chua 37

Hình 2.5: Sơ đồ quy trình kiểm tra Listeria monocytogenes 38

Hình 2.6: Ống canh thang chứa môi trường BLEB 39

Hình 2.7: Phương pháp pha loãng 39

Hình 2.8: Các ống canh thang đã tăng sinh đem ủ 40

Hình 2.9: Esculin dương tính 40

Hình 2.10: Esculin âm tính 40

Hình 2.11: Các ống nghiệm kiểm tra khả năng lên men đường Rhamnose 41

Hình 2.12: Catalase âm tính 42

Hình 2.13: Catalase dương tính 42

Hình 2.14: Vi khuẩn Listeria monocytogenes trên thạch máu cừu 43

Hình 2.15: Mô tả cách tra bảng Mac Crandy 44

Hình 2.16: Vòng kháng khuẩn (+) của dịch lên men chua tới vi khuẩn Listeria monocytogenes 45

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề:

Thực phẩm không chỉ là nguồn cung cấp năng lượng và chất dinh dưỡng cho con người duy trì sự sống, phát triển và lao động Bên cạnh đó, thực phẩm còn là nguồn gây ra ngộ độc thực phẩm cho con người nếu chúng ta không tuân thủ các biện pháp vệ sinh an toàn thực phẩm Hiện tượng ngộ độc thực phẩm đã xảy ra ở nhiều địa phương trong cả nước, không chỉ xảy ra ở các bếp ăn tập thể (như nhà máy, xí nghiệp, trường học…) mà còn xảy ra ở rất nhiều gia đình từ thành thị đến nông thôn

Theo thống kê của Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, tính đến 15/12/2011, toàn quốc ghi nhận 142 vụ ngộ độc thực phẩm với 4533 người mắc, 3562 người đi viện và 25 trường hợp tử vong Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm chính là vi sinh vật gồm 40 vụ (28.1%), độc tố tự nhiên gồm 38 vụ (26.8%) Ngộ độc thực phẩm ghi nhận xảy ra tại 45/63 tỉnh/thành phố.[31]

So với cùng kỳ năm 2010, tình trạng ngộ độc thực phẩm có chiều hướng giảm, cụ thể số vụ ngộ độc giảm 31 vụ (17.9%), số mắc giảm 864 người (16%), số trường hợp phải nhập viện giảm 194 người (4%) và số tử vong giảm 24 người (48.9%) Trong đó, số vụ trên 30 người mắc giảm 17 vụ (36.1%).[31]

Khoa học công nghệ luôn phát triển nhằm để đáp ứng lại nhu cầu ngày càng cao của con người Trên quá trình thăng tiến này, con người đòi hỏi khắt khe hơn về chất lượng của mọi sản phẩm Đặc biệt là sự an toàn về sức khỏe của chính bản thân

họ nên vấn đề an toàn thực phẩm là mối quan tâm hàng đầu trong xã hội hiện nay Nguyên nhân chính của những vụ ngộ độc thực phẩm là do vi sinh vật gây ra Nhưng lâu nay trong vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm, chúng ta chỉ lưu ý đến một

số loại vi khuẩn chủ yếu như E.coli, Staphylococcus aureus, Clostridium

perfringgens, mà chưa lưu ý đến một loại cũng không kém phần quan trọng khác

là loài Listeria monocytogenes Theo công bố của Trung tâm Kiểm soát và phòng

chống dịch bệnh Mỹ (CDC), đến ngày 29/9/2011 đã phát hiện 72 trường hợp bệnh

nhân nhiễm Listeria tại 18 bang của nước Mỹ trong đó có 13 người bị chết

(18.05%).[29, 30]

Tại Việt Nam, những vụ ngộ độc thực phẩm bởi thực phẩm bị nhiễm Listeria

monocytogenes, một tác nhân gây bệnh nguy hiểm, không phải là chưa từng xảy ra

nhưng vấn đề là công tác điều tra dịch tễ, sàng lọc và thống kê tác nhân gây bệnh chưa đạt yêu cầu mà bỏ sót loại vi khuẩn này; cũng như nhận thức của cộng đồng về

an toàn vệ sinh thực phẩm chưa đầy đủ và không cập nhật đầy đủ kênh thông tin về những vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm Nguyên nhân không phải là vì chúng ta

không biết về những nguy hiểm do Listeria monocytogenes gây ra mà vì với các

phương pháp xét nghiệm lâu nay chúng ta áp dụng dễ dàng phát hiện các nhóm vi

khuẩn thông thường, đối với việc tìm cụ thể một vi khuẩn như Listeria

monocytogenes thì phải cần nhiều đến kỹ thuật chuyên môn vi sinh

Ngoài ra, để bảo vệ chính mình tránh được tác nhân gây bệnh nguy hiểm như

vi khuẩn Listeria monocytogenes thì người tiêu dùng cần có sự lựa chọn loại thực

phẩm thông minh Bên cạnh đó Bộ Y tế cần phải có những nghiên cứu nhằm làm

giảm và hạn chế khả năng phát triển của vi khuẩn Listeria monocytogenes trong

thực phẩm, nhằm đảm bảo chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm cho người tiêu dùng, cũng như góp phần thực hiện chiến lược mục tiêu của quốc gia về an toàn vệ sinh thực phẩm giai đoạn 2012-2015 và tầm nhìn 2030

Xuất phát từ tình hình thực tế trên, cùng sự định hướng và giúp đỡ nhiệt tình của quý thầy cô, sau gần 3 tháng nghiên cứu đến nay em đã cơ bản hoàn thành đề tài: “Tình hình nhiễm vi khuẩn Listeria monocytogenes trên dưa muối chua.”

3 Nội dung đề tài:

­ Tìm hiểu về Listeria monocytogenes và ảnh hưởng của quá trình lên men lactic đến sự sinh trưởng và phát triển của các vi khuẩn gây bệnh

­ Xác định lượng số lượng vi khuẩn Listeria monocytogenes trên nguyên liệu rau muối chua

­ Xác định sự phát triển của vi khuẩn Listeria monocytogenes trong quá trình lên men dưa chua

­ Đánh giá mức độ nhiễm Listeria monocytogenes trên dưa muối chua

4 Ý nghĩa của đề tài:

­ Sử dụng kết quả nghiên cứu để đánh giá tình hình nhiễm vi khuẩn Listeria

monocytogenes trên nguyên liệu cải bẹ xanh hiện nay

­ Xác định khả năng ức chế của dịch lên men chua đến sự sinh trưởng và

phát triển của vi khuẩn Listeria monocytogenes

­ Tạo hướng nghiên cứu về vi khuẩn Listeria monocytogenes trong lĩnh vực

an toàn thực phẩm

5 Thời gian thực hiện đề tài:

Từ ngày 15/2/2012 đến ngày 12/6/2012

CHƯƠNG I : TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ CẢI BẸ XANH:

1.1.1 Giới thiệu về họ rau cải:

Họ Cải (danh pháp khoa học: Brassicaceae), còn gọi là họ Thập tự (Cruciferae), là một họ thực vật có hoa Các loại cây trồng trong họ này gần như

đều có chứa chữ “cải” trong tên gọi Họ này chứa một số loài có tầm quan trọng kinh tế lớn, cung cấp nhiều loại rau về mùa đông trên khắp thế giới Các loại rau họ cải bao gồm: cải bẹ xanh, rau diếp, xà lách, cải bắp, súp lơ và cải xoăn.[14]

1.1.2 Cải bẹ xanh:

Hình 1.1: Cây cải bẹ xanh và lá cây cải bẹ được cắt ra

Cải bẹ xanh là một trong những cây rau dễ trồng, nhanh cho thu hoạch thời gian sinh trưởng từ 50÷60 ngày, thích hợp với nhiều mùa vụ trong năm nên sản lượng thu hoạch trên một diện tích rất lớn; với chi phí đầu tư thấp mà lợi nhuận lại rất cao, việc tiêu thụ dễ dàng nên đây là loại rau được trồng khá nhiều.[32]

Cải bẹ xanh loại cây thân thảo, ngắn ngày, có bẹ lá to, lá rất lớn, một cây cân nặng 1.5÷2 kg.[15]

Nó được truyền từ đời này sang đời khác.[14]

1.1.1.2 Thành phần hóa học của cải bẹ xanh:

­ Nước: Hàm lượng nước trong cải bẹ xanh chiếm 82 % Nước là dung môi hoà tan của nhiều chất hữu cơ, chất khoáng và đồng thời cũng là chất tham gia vào các quá trình xảy ra ở rau Trong quá trình sống nếu hàm lượng nước trong rau bị mất đi từ 5÷7 % thì rau sẽ bị héo, ảnh hưởng đến quá trình trương, co nguyên sinh phá vỡ sự trao đổi chất bình thường trong tế bào, mặt khác nước còn làm kích thích

sự hoạt động của các men ở trong rau quả

­ Glucid: Là một trong những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng của sản phẩm rau Glucid bao gồm: đường, tinh bột, chất xơ như: inulin, cellulose, hemicellulose, và các chất khác Trong cải bẹ xanh hàm lượng của glucid chiếm 4.5 %

­ Đường: Trong rau cải thường gặp nhất là glucose, fructose và cả saccharose Hàm lượng đường quyết định chất lượng của rau, đường càng nhiều thì chất lượng rau càng tăng, rất tốt cho quá trình lên men sau này Hàm lượng đường trong cải bẹ xanh thường chiếm khoảng 4÷4.5 %

­ Tinh bột: Hầu hết các loại rau có hàm lượng tinh bột rất ít chỉ khoảng gần

1 % hoặc chỉ có vết

­ Cellulose: Hàm lượng cellulose trong cải bẹ xanh khoảng 1.4 %, cellulose

có ảnh hưởng đến mùi vị, trạng thái và độ tiêu hoá của rau cải Ở rau càng non hàm lượng cellulose thấp và dễ tiêu hoá có mùi vị thơm ngon.[5,14]

1.1.1.3 Công dụng của cải bẹ xanh:

Cải bẹ xanh là loại rau dùng để chế biến dưa muối chua, một loại sản phẩm truyền thống mang đậm bản sắc dân tộc Việt Nam Ngoài ra, cải bẹ xanh còn được

sử dụng để chữa trị một số bệnh trong dân gian nhờ vào vị cay, tính nhiệt, không độc, trị được các chứng phong hàn, ho đờm, hen, đau họng, tê dại, mụn nhọt,….hay dùng để chữa bỏng nhẹ nếu không sơ cứu kịp thời dễ bị tróc da, nhiễm trùng

Theo kinh nghiệm dân gian, có thể dùng hạt cải để chữa một số bệnh:

+ Chữa đau đầu: bị đau đầu như búa bổ dù không bị cao huyết áp hay các bệnh về não, cảm thấy đau buốt khi đụng tới một khoảng da đầu (do cảm mạo) Lấy một nắm hạt cải bẹ xanh, tán bột hòa với giấm, bôi vào thái dương, đỉnh đầu, gáy và vùng da đầu bị đau buốt thì cơn đau sẽ dứt

+ Chữa tiêu chảy: Lấy ít hạt cải tán mịn, thêm nước cho sền sệt rồi đắp lên

rốn; bệnh nhân sẽ ngừng nôn và đi ngoài.[14,32]

1.2 TỔNG QUAN VỀ RAU QUẢ MUỐI CHUA:

1.2.1 Giới thiệu về rau quả muối chua:

Từ cổ xưa, dù chưa nhận thức được sự tồn tại của vi sinh vật, nhưng loài người đã biết khá nhiều về tác dụng của chúng Trong sản xuất và đời sống, họ đã tích lũy được nhiều kinh nghiệm và các biện pháp lợi dụng các vi sinh vật có ích và phòng tránh các vi sinh vật có hại Việc lên men lactic (muối chua) để bảo quản thực phẩm trong đó có rau quả muối chua được thực hiện vào khoảng 3500 năm trước Công Nguyên.[5,12]

Rau quả muối chua là các sản phẩm chế biến từ rau thuộc nhóm sản phẩm lên men lactic, bằng cách làm cho chất đường có sẵn trong nguyên liệu chuyển hóa thành acid lactic bởi các vi sinh vật lactic Acid lactic và các sản phẩm khác, do quá trình lên men tạo thành, làm cho sản phẩm có hương vị đặc trưng, có thể sử dụng ăn ngay mà không cần phải qua chế biến Ngoài ra, acid lactic còn có tác dụng làm giảm pH của sản phẩm, ức chế hoạt động của nhiều loại vi sinh vật gây hư hỏng sản phẩm và có tính chất sát trùng vừa nhằm mục đích bảo quản rau quả, vừa làm tăng giá trị cảm quan của sản phẩm.[8]

Ở nước ngoài, rau muối chua được sản xuất nhiều từ dưa chuột, bắp cải, cà chua và một số rau quả khác Ở nước ta, các loại rau được muối chua nhiều là cải

bẹ, bắp cải, cà pháo, hành củ,…

1.2.2 Quá trình lên men lactic trong rau cải muối chua:

Quá trình lên men lactic làm chua rau quả chủ yếu là do loài Bacterium

cucumeris fermentati Trong sản phẩm rau quả muối chua quá trình lên men lactic

xảy ra hàng loạt các quá trình:

+ Quá trình trích ly hay thẩm thấu các chất từ mô tế bào thực vật

+ Quá trình tăng sinh khối của vi sinh vật (chủ yếu là vi khuẩn lactic) + Quá trình tạo acid lactic

+ Quá trình ức chế sự phát triển vi khuẩn gây thối bởi acid lactic và muối + Quá trình tạo hương của sản phẩm

Các quá trình lên men này hoàn toàn là quá trình lên men tự nhiên, gây ra bởi nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau, chủ yếu là những vi sinh vật có trên bề mặt nguyên liệu Bởi vậy quá trình này xảy ra qua ba giai đoạn cơ bản:

­ Giai đoạn đầu: thành phần muối trong dung dịch lên men gây áp suất thẩm thấu lớn nhất nên đường và các chất bổ dưỡng khác có trong nguyên liệu khuếch tán vào nước và bắt đầu có sự hoạt động của vi sinh vật lactic và một số vi sinh vật khác

+ Trên bề mặt nước muối có thể xuất hiện một số bọt khí, đó là hoạt động của các vi khuẩn và một số vi sinh vật có khả năng sinh khí khác

+ Chủng vi khuẩn lactic phát triển chủ yếu trong thời kì này là Leuconostoc

mesenteroides Đây là loại cầu khuẩn có khả năng sinh acid lactic và sinh khí, khả

năng tích tụ acid lactic của chủng này rất yếu (nhỏ hơn 1%)

+ Giai đoạn thứ hai: các vi khuẩn lactic phát triển mạnh nên lượng sinh khối

vi khuẩn lactic đạt mức cao nhất và acid lactic được tích tụ nhiều làm pH dịch lên men giảm nhanh Phần lớn các vi khuẩn gây thối bị ức chế, vì độ pH của môi trường

giảm xuống tới 3÷3,5 Chủng vi khuẩn Lactic phát triển chủ yếu trong thời kỳ này

là Leuconostoc mesenteroides và muối

­ Bacteria bassicae fermentati, Lactobacterium cucumeris và

Lactobacterium plantorum Cuối thời kì này là chủng Lactobacterium pentoaceticus

và Lactobacterium breris phát triển rất mạnh Thời kì này là thời kì vô cùng quan

trọng của quá trình lên men latic, vì sản phẩm tích tụ được lượng acid cao có thể đạt tới 0.8÷1.2 % và có hương vị đặc trưng cho sản phẩm

Giai đoạn thứ ba: khi acid lactic đã tích tụ với lượng khá lớn vào cuối giai đoạn hai thì tác động ngược lại làm các vi khuẩn lactic cũng bị ức chế Khi ấy các loại nấm men, nấm mốc có khả năng phát triển mạnh, làm giảm chất lượng sản phẩm, vì chúng có khả năng phân hủy mạnh acid lactic Kết quả là khối rau lên men bắt đầu bị phá hủy bởi các vi khuẩn gây thối Do vậy, trong thời kì này cần ngăn ngừa các hiện tượng trên bằng cách bảo quản sản phẩm ở nhiệt độ thấp (2÷40C), hoặc bảo quản trong điều kiện yếm khí, bảo quản bằng chất sát trùng (acid sobic, natri benzoate, sorbat kali) [5,6,7,8,12,13]

1.3 TỔNG QUAN VỀ QUÁ TRÌNH LÊN MEN LACTIC:

1.3.1 Tác nhân vi sinh sử dụng trong quá trình lên men lactic:

1.3.1.1 Giới thiệu tổng quan về vi khuẩn lactic:

Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacteriaccae Mặc dù nhóm vi khuẩn này không đồng nhất về hình thái (vi khuẩn dạng que ngắn, que dài lẫn vi khuẩn hình cầu) song về mặt sinh lý chúng tương đối đồng nhất, đều là vi khuẩn Gram (+) Chúng không tạo bào tử (Tuy nhiên, mới đây, một nhóm các nhà khoa học Nhật

Bản đã phát hiện vi khuẩn lactic có tên Sporo Lactobacillus inxulinus trong họ vi

khuẩn lactic có khả năng tạo bào tử [2,11]) và hầu hết không di động.[1,3,6,7]

Vi khuẩn lactic thu nhận năng lượng nhờ phân giải carbonhydrat và sinh ra acid lactic có thể ở dạng D(-), L(+) hay DL Khác với một số vi khuẩn đường ruột thì các vi khuẩn lactic đều là vi khuẩn lên men bắt buộc, vì chúng sống từ kỵ khí đến vi hiếu khí.[11]

Vi khuẩn lactic không chứa cytochrome; không có enzyme catalase, enzyme oxydase và enzyme chuyển hóa nitrat thành nitrit (nitratreductase âm tính)[11] nhưng sống được trong điều kiện có oxy không khí vì chúng có khả năng sinh tổng

C6H12O6

Glucose

2CH3CHOHCOOH + 22.5kcal

Acid lactic

hợp enzyme peroxydase rất nhanh, chúng phân giải H2O2 để tạo ra H2O và oxy để phát triển nên được gọi là vi khuẩn hô hấp tùy tiện Phần lớn chúng phát triển bình thường nếu thiếu O2.[6,7,11]

Các loài vi khuẩn lactic bao gồm bốn giống sau đây: Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus và Lactobacillus Trong số các giống trên thì Lactobacillus là trực khuẩn, các vi khuẩn lactic khác thuộc các giống còn lại là cầu

khuẩn.[11]

Vi khuẩn lactic có nhiều trong tự nhiên Chúng tồn tại nhiều ở cỏ, nhất là cỏ khô Chúng tồn tại cả trong cơ thể người và động vật Ở người và động vật chúng có trong đường ruột, trong miệng Ở đường ruột có nhiều vi khuẩn lactic thuộc

Bifidobacteria, Enterococcus và Lactobacillus, trong đó vi khuẩn Lactobacillus

chiếm số lượng nhiều nhất Có một số loài trong họ vi khuẩn lactic như

Streptococcus có khả năng gây bệnh.[1,6,7]

1.3.1.2 Đặc điểm hình thái:

Các vi khuẩn khác nhau có hình dạng và kích thước khác nhau Ngoài ra hình dạng và kích thước của tế bào vi khuẩn lactic còn phụ thuộc vào môi trường, điều kiện nuôi cấy, sự có mặt của oxi và tuổi tế bào.[1,3]

­ Giống Streptococcus có tế bào hình tròn hoặc hình ovan đường kính khoảng 0,5 – 1,0µm, sắp xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc chuỗi dài

­ Giống Leuconostoc có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan, đường kính từ 0 ,5 – 0,8µm, sắp xếp thành chuỗi và không tạo thành đám tập trung

­ Giống Lactobacillus có hình que, đây là loại vi khuẩn phổ biến nhất Hình dạng của chúng thay đổi từ hình que ngắn cho đến hình que dài

1.3.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa:

Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao, trong quá trình lên men để sự sinh trưởng và phát triển của chúng được diễn ra bình thường, ngoài một nguồn carbon thì cần sự có mặt của vitamin, chất sinh trưởng, chất khoáng hay hợp chất hữu cơ chứa nitơ,… Vì acid lactic tự do ở nồng độ tương đối

nhỏ đã kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic cho nên sự có mặt của một chất đệm là cần thiết để duy trì quá trình lên men.[1,6]

­ Nhu cầu dinh dưỡng carbon:

Vi khuẩn lactic có khả năng lên men nhiều loại carbonhydrat từ các monosacharid, disaccharid cho đến các polysaccarid.[3]

Chúng sử dụng nguồn carbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc

tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ.[6]

Tuy nhiên, khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau còn tùy thuộc vào

từng loài, chẳng hạn chỉ có Lactobacterium delbrueckii là có thể đồng hóa được tinh

bột.[11]

­ Nhu cầu dinh dưỡng nitơ:

Hầu hết các vi khuẩn lactic đều không tự tổng hợp được các hợp chất nitơ hữu cơ phức tạp như: pepton, polysaccharid, protein tan hay muối amon,…nhưng

nó lại là nguồn dinh dưỡng rất quan trọng để đảm bảo cho sự phát triển bình thường của các vi khuẩn lactic.[1,7,11]

­ Nhu cầu vitamin:

Khả năng sinh tổng hợp của các vi khuẩn lactic thuộc loại yếu Do vậy hàm lượng vitamin của môi trường giữ một vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất Vitamin B6 – một vitamin rất quan trọng trong sự sinh tổng hợp các acid amin

ở vi khuẩn lactic – cũng có thể được thay thế bởi một số acid amin Tuy nhiên, tùy thuộc vào từng loài vi khuẩn lactic mà nhiều loại acid amin được coi là không thể thay thế, bắt buộc phải có mặt trong môi trường (acid glutamic, arginin, tirozin).[1,2,11]

­ Nhu cầu muối vô cơ:

Quá trình thủy phân protein đặc biệt được thúc đẩy trong môi trường có mặt của một số ion kim loại như: Mg2+, Mn2+ và Co2+ khi có pH từ 5.5-6 Kết quả quá trình thủy phân protein đã tạo ra các acid amin và các sản phẩm được tạo thành từ acid amin góp phần tạo nên hương vị đặc trưng cho sản phẩm lên men Phosphat là một loại muối quan trọng mà vi khuẩn lactic yêu cầu [11]

­ Nhiệt độ:

Là một trong những nhân tố quan trọng nhất ảnh hưởng tới sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Khoảng nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men từ 15÷500C Tuy nhiên, với mỗi loài trong họ có khoảng nhiệt độ thích hợp khác nhau, nếu nhiệt độ lớn hơn 800C vi khuẩn lactic hoàn toàn bị tiêu diệt [1,6,11]

Bảng 1.1: Vitamin và các chất sinh trưởng cần thiết cho sinh trưởng của các vi

khuẩn lactic (theo K Buchta, 1983)

Chất Vi sinh vật điển hình Chất Vi sinh vật điển hình

Acid p – aminobenzoic Lactobacillus plantarum

Lactobacillus arabinosus Acid folic

Lactobacillus casei Streptococcus faecalis

Acid 5 – focmyl - 5,6,7,8 –

tetrahydrofolic

Leuconostoc citrovorum Streptococcus faecalis Lơcovorin Lactobacillus casei

Acid nicotinic

Lactobacillus arabinosus Leuconostoc mesenteroides Streptococcus faecalis

Riboflavin Lactobacillus casei

Streptococcus lactic

Acid pantothenic

Lactobacillus casei Leuconostoc mesenteroides Streptococcus faecalis

Pantetein pantetin

Lactobacillus acidophilus Lactobacillus bulgaricus

Acid lipoic

Lactobacillus casei Streptococcus lactic Streptococcus faecalis

Tiamin Lactobacillus fermenti

Streptococcus lactic

Biotin

Lactobacillus plantarum Leuconostoc mesenteroides Streptococcus faecalis

Bioxitin Lactobacillus arabinosus

Lactobacillus casei

1.3.1.4 Phân loại chủng vi khuẩn lactic:

Dựa vào khả năng lên men lactic từ các nguyên liệu chứa đường, có hai nhóm vi khuẩn lactic chuyển hóa đường hoàn toàn khác nhau nên vi khuẩn lactic được chia thành hai nhóm: vi khuẩn lactic lên men đồng hình và dị hình

 Vi khuẩn lên men lactic đồng hình: sản sinh 85÷95 % acid lactic Bao gồm các cầu khuẩn và trực khuẩn:

+ Streptococcus lactic: đây là trực khuẩn rất ngắn, gây ra sữa chua tự nhiên Yếm khí tùy tiện, lên men tốt glucose, maltose, lactose tạo ra môi trường có 0.8÷1

% acid lactic Ở điều kiện bình thường gây chua sữa trong vòng 10÷12 giờ Nguồn nitơ cho vi khuẩn này là peptone Nhiệt độ tối thiểu cho chúng phát triển là 100C, tối ưu là 350C và tối đa là 450C Chúng thủy phân caseine và gelatin rất yếu

+ Streptococcus cremoris: thường tạo thành chuỗi dài Tế bào có kích thước 0.6÷0.7 µm Phát triển ở nhiệt độ thấp hơn Streptococcus lactic tối ưu từ 25÷300C, tối đa là 35÷380C Có khả năng lên men glucose, galactose

Hình 1.2: Vi khuẩn Streptococcus cremoris

+ Lactobacterium vulgaricum: loại trực khuẩn rất dài Nhiệt độ phát triển

tối ưu là 200C, tối đa 40÷450C Có khả năng lên men glucose, lactose Có khả năng tạo độ acid cao (3.7 % acid lactic)

+ Lactobacterium delbrueckii: thường gặp trên hạt đại mạch, đây là loại trực khuẩn lớn Trong quá trình phát triển của mình chúng có khả năng tạo thành sợi 100÷1000 µm Nhiệt độ tối ưu cho chúng phát triển từ 45÷500C, tối thiểu là 180C và tối đa là 550C Khác với các loài khác chúng không có khả năng lên men đường lactose nên không sử dụng trong chế biến sữa trong môi trường dịch thể chúng có

khả năng tạo 70 % acid lactic so với đường

+ Lactobacterium cucumeris fermentati: thường tìm thấy trong sữa ủ chua

Là trực khuẩn không chuyển động, thường tạo thành tế bào đơn, có khi tạo thành chuỗi trong quá trình lên men Khả năng tạo acid tối đa trong môi trường từ 0.9÷1.2 %

 Vi khuẩn lên men lactic dị hình: sản sinh 50 % acid lactic, 25 % cồn và

25 % acid acetic Nhóm vi khuẩn này gồm các vi khuẩn sinh hương:

+ Streptobacterium hassices fermentati: thường thấy trong dịch lên men chua rau cải Chúng tồn tại từng tế bào riêng biệt và ghép thành từng đôi, hoặc chuỗi ngắn, có khi ghép thành chuỗi dài hình sợi Khi lên men rau cải tạo thành acid lactic, acid acetic, rượu etylic (đến 2.4 %) và CO2 Lên men đường saccharose tốt hơn lên men đường lactose

+ Lactobacterium lycopersici: là trực khuẩn gram dương, sinh hơi, tế bào tạo thành chuỗi hay đơn, có khi ghép thành đôi một Khi lên men chúng tạo thành acid lactic, rượu etylic, acid acetic và CO2 Chúng có khả năng tạo bào tử, tế bào sinh dưỡng thường chết ở nhiệt độ 77÷800C

+ Eubacteriales schericia coli aerogenes: chúng có khả năng lên men

lactose để tạo thành rượu, acid lactic, CO2 và H2 Ngoài ra, chúng còn có khả năng tạo khí metan, acid succinic, acid muraric.[1,2,6]

1.3.2 Bản chất hóa sinh, cơ chế quá trình lên men lactic:

1.3.2.1 Bản chất của quá trình lên men lactic:

Lên men lactic là quá trình chuyển hóa đường thành acid lactic trong điều kiện yếm khí với sự tích lũy acid lactic trong môi trường lên men, điển hình là vi khuẩn lactic Đây là quá trình oxy hóa khử không hoàn toàn Nguyên liệu lên men lactic có thể sử dụng như đường, tinh bột, rỉ đường,… Tùy thuộc vào sản phẩm lên men và vào nòi vi khuẩn mà sản phẩm của quá trình lên men lactic có acid lactic và các sản phẩm phụ khác nên được chia thành hai kiểu là quá trình lên men đồng hình

và quá trình lên men dị hình.[1,6,11]

Sơ đồ tổng quát tạo acid lactic :

Hình 1.3: Sơ đồ tổng quát tạo acid lactic

1.3.2.2 Quá trình lên men:

 Lên men lactic đồng hình: là quá trình lên men mà lượng lactic hình thành chiếm 90÷98 % trong sản phẩm Các vi khuẩn lactic đồng hình phân giải glucose theo quá trình EMP (Embden – Meyerhof – Parnat) thành pyruvat Chủ yếu pyruvat chuyển hóa thành lactate và chỉ một phần rất nhỏ chuyển hóa thành ethanol, CO2,…

Quá trình lên men lactic đồng hình gồm 2 giai đoạn:

+ Giai đoạn 1: thời kì sinh trưởng mạnh của vi khuẩn, từ hexose tạo ra acid phosphoglycerinic nhờ sự oxy hóa phosphoglyceraldehyd kèm theo việc khử NAD

+ Giai đoạn 2: do NADH + H+ tăng, nên thế oxy hóa của môi trường giảm xuống dẫn tới sự nhường hydro từ NADH + H+ cho acid phosphoglycerinic để khử thành acid lactic Chỉ có một phần acid pyruvic tiếp tục khử carboxyl thành acid acetic, ethanol, CO2 và aceton Số lượng sản phẩm tạo thành phụ thuộc vào lượng oxy có mặt trong môi trường Vi khuẩn lên men lactic thường sử dụng những đường đơn khác như: glucose, galactose, levulose và đường kép khác như: lactose, saccharose, maltose.[1,7,12,13]

Quá trình lên men lactic đồng hình theo cơ chế:[7]

Hình 1.4: Sơ đồ quá trình lên men lactic đồng hình

 Lên men lactic dị hình: là quá trình lên men mà ngoài acid lactic tạo thành còn có các sản phẩm khác như: acid acetic, glycerin, ethanol, CO2,…Quá trình lên men lactic dị hình tạo thành nhiều sản phẩm vì vi khuẩn lactic dị hình không có enzyme cơ bản của sơ đồ EMP là enzym aldolase và enzyme triosophosphat isomerase mà chủ yếu theo con đường Pentose - Phosphat Dưới tác dụng của

NAD+

enzym epimerase, riboluse-5-phosphate chuyển hóa thành xylulose-5-phosphate Dưới tác dụng của enzym pentophosphatcetolase, xylulose-5-phosphat biến thành phosphoglyceraldehyd và acetyphosphate Acetylphosphate được khử thành ethanol thông qua acetaldehyde hoặc chuyển một phần hay toàn phần acetylphosphat thành acid acetic, giải phóng ATP Phosphoglyceraldehyd thông qua acid pyruvic biến thành acid lactic.[1,7,12,13]

Quá trình lên men lactic dị hình chuyển hóa như sau:[7]

Hình 1.5: Sơ đồ quá trình lên men lactic dị hình

ATP

NAD+

NAD – H2

NAD+

NAD – H2

ADP

1.3.3 Khả năng ức chế của quá trình lên men lactic với vi sinh vật gây bệnh:

Trong bài thảo luận của Metchnikoff, Pastuer và Joubert, khi quan sát sự đối kháng giữa các chủng vi khuẩn, đã kết luận sự tiêu thụ vi khuẩn không gây bệnh để kiểm soát các vi khuẩn gây bệnh.[20]

Đã có nhiều công trình nghiên cứu khoa học chứng minh rằng vi khuẩn lactic

là nguồn vi sinh vật dồi dào, dễ nuôi cấy và được xếp vào vi khuẩn an toàn không độc với người, gia súc và gia cầm thì việc cho thêm một lượng vi khuẩn lactic vào thực phẩm, có thể gây ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh và gây thối

do quan hệ đối kháng giữa chúng Do đó làm giảm hoặc loại trừ nguy cơ gây hư hỏng của các sản phẩm.[19]

Quá trình lên men của vi khuẩn lactic có hoạt tính đối kháng chống lại các vi

sinh vật gây bệnh như: Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Helicobacter pylori… Nó làm giảm số lượng vi khuẩn để ngăn chặn các mầm bệnh

bằng cách cạnh tranh với các nguồn bệnh để ngăn chặn sự bám dính vào đường ruột

và cạnh tranh dinh dưỡng cần thiết cho sự sống sót của mầm bệnh, đồng thời tiết ra các chất kháng khuẩn để ức chế và tiêu diệt những vi khuẩn cạnh tranh.[19,20]

Cụ thể như Lacticin 3147 do Lactococcus lactic sinh ra có tác dụng diệt

khuẩn trên những tế bào nhạy cảm bởi sự tương tác đầu tiên với thành tế bào Đó là nguyên nhân mà trên màng tế bào tạo ra những kênh cho K+ và phosphat vô cơ đi ra khỏi tế bào Trong sự nỗ lực để tái tích lũy lại những ion này, những hệ thống hấp thu phụ thuộc ATP dẫn tới thủy phân ATP bên trong Khi ATP được yêu cầu cho sự duy trì của những chức năng quan trọng của tế bào, như gradient pH tại màng tế bào, những chức năng tế bào bị phá vỡ và tế bào dần dần mất năng lượng và chết.[20]

Một số chủng vi khuẩn lactic có thể sinh ra nhiều chất có khả năng kháng khuẩn như: acid lactic, H2O2, diacetyl, reuterin, các enzym và đặc biệt nhiều loại bacteriocin (lactacin, brevicin, nisin, pediocin, sakasin…) Những hợp chất này không chỉ làm giảm số lượng sinh vật mang mầm bệnh mà còn ảnh hưởng đến sự trao đổi chất và sự tạo ra các độc tố của vi khuẩn gây bệnh Điều này được thực

hiện bằng cách giảm pH trong quá trình lên men thông qua sự tạo ra các acid chuỗi ngắn dễ bay hơi, chủ yếu là acetate, propionate, và butyrate, nhất là acid lactic.[2,20,21] Nồng độ acid thấp trong thực phẩm thì khả năng làm giảm hay tiêu

diệt vi khuẩn Listeria monocytogenes càng cao.[25]

Trong đó, bacteriocin có bản chất protein hoặc phức protein kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại vi khuẩn khác, có hoạt tính diệt khuẩn đối với nhiều loại vi khuẩn Gram (+), Gram (-), ức chế sự hình thành bào tử ở các vi khuẩn trưởng thành Người ta chứng minh được rằng, sự acid hóa môi trường nhanh chóng

bởi Lactobacillus plantarum cho phép tiêu diệt hoàn toàn Samonella typhimurium,

đồng thời rút ngắn được thời gian sản xuất.[1,2,20,21]

Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó Ngoài ra không gây ra phản ứng dị ứng trong con người và các vấn đề về sức khỏe, bị phân hủy nhanh bởi enzym protease, lipase Chúng có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải ADN, ARN

và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào.[21]

Có những nghiên cứu mới về hiệu quả của chế phẩm bacteriocin của vi khuẩn lactic làm giảm có hiệu quả các vi khuẩn gây hư hỏng và vi khuẩn gây bệnh, nên tác dụng như chất bảo quản hay sử dụng cho điều trị cục bộ Nhưng trước khi

sử dụng cần có những nghiên cứu để chỉ ra hiệu quả và tính an toàn của chúng.[2,12,15]

Bacteriocin của vi khuẩn lactic có thể phân loại dựa trên cấu trúc cơ bản nhưng nó còn dựa trên kiểu hoạt động của chúng Bacteriocin class I (đại diện: nisin

của Lactococcus lactic) gắn vào lớp lipid II, ngăn sự vận chuyển các tiểu đơn vị

peptidoglycan từ tế bào chất đến vách tế bào, do đó ngăn tổng hợp vách tế bào hoặc

do bám đựơc vào lớp lipid II, các phân tử nisin tạo lỗ xuyên màng tế bào dẫn đến

tiêu bào; bacteriocin class II (đại diện sakacin của Lactobacillus sake) là các peptide

lưỡng tính có khả năng xuyên màng tế bào tạo kênh/lỗ trên màng Lớp III (còn gọi

là bacteriolysin như lysostaphin) – protein không bền nhiệt, tác động trực tíêp lên

vách tế bào đích (Hình 1.6) (Riley và Chavan, 2007 ), (Cotter et al., 2005).[19,21]

Hình 1.6: Cơ chế kháng vi sinh vật của bacteriocin (Cotter et al., 2005) 1.3.4 Ứng dụng của quá trình lên men lactic:

Vi khuẩn lactic ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: công nghiệp, nông nghiệp, môi trường, y học và đặc biệt trong công nghệ bảo quản

và chế biến thực phẩm Những hướng ứng dụng cơ bản: [1,2,7,11,12,13]

1.3.4.1 Ứng dụng trong công nghệ bảo quản và chế biến thực phẩm:

Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn có nhiều trong thiên nhiên, vì thế trong bảo quản và chế biến thực phẩm, chúng được sử dụng để làm dưa chua hay các loại rau muối chua cũng như các mặt hàng sản phẩm truyền thống khác (tôm chua, cá chua, nem chua), làm chua quả mà ít làm thay đổi màu tự nhiên của quả và vẫn đảm bảo được chất lượng của quả ngâm chua Dùng sản xuất tương, đậu phụ hay các sản phẩm lên men từ sữa (sữa chua, phomat, bơ,…)

Ngoài ra, nhiều loại đồ uống cũng sử dụng quá trình lên men lactic Có thể sản xuất các loại đồ uống lên men từ một số loại quả giàu đường (chuối, dứa, vải, xoài,…) hay từ các loại quả ít đường ( nho, táo, ổi,…) hoặc từ nguyên liệu chứa tinh bột như lúa mỳ, đại mạch, cao lương, gạo,… Như sản phẩm Keffia được sản xuất

từ hạt cao lương nảy mầm; sản phẩm Buza lên men từ lúa mỳ; Kvass làm từ malt đại mạch Đây là loại nước lên men giàu bổ dưỡng, có hương vị độc đáo, hấp dẫn và nâng cao sức khỏe cho người tiêu dùng

Trong bảo quản thực phẩm: từ một số loài vi khuẩn lactic, người ta thu nhận được bacteriocin, một loại kháng sinh có tác dụng hạn chế hầu hết các vi khuẩn gram (+), gram (-), ức chế sự hình thành bào tử ở các vi khuẩn trưởng thành Khả năng ức chế, tiêu diệt các loại vi khuẩn gây thối rữa của vi khuẩn lactic trong quá trình lên men là cơ sở cho việc duy trì chất lượng và độ an toàn thực phẩm.[5]

1.3.4.2 Trong chăn nuôi thú y:

Ứng dụng để ủ các loại cỏ và lá cây làm thực phẩm gia súc cũng như công nghệ sản xuất rau quả muối chua, sử dụng vi khuẩn lactic để cây cỏ trong chăn nuôi được tươi “sinh học”, kéo dài thời gian bảo quan cỏ, lá cây cho gia súc Đồng thời, quá trình lên men lactic xảy ra làm tăng giá trị dinh dưỡng nhờ vào sự bổ sung nhiều loại vitamin, kháng sinh do vi khuẩn tổng hợp nên làm tăng năng suất vật nuôi

Ngoài ra, có thể áp dụng lên men các phụ phẩm tôm, cá (cá tạp, đầu cá,…) nhờ vi khuẩn lactic làm thức ăn ủ chua cho gia súc, gia cầm thu hồi lượng đạm phế phẩm vỏ đầu tôm và lên men thu hồi kitin trong vỏ đầu tôm

Vi khuẩn lactic tiêu biểu là Lactobacillus có hiệu quả trong phục hồi sự cân

bằng hệ vi sinh vật đường ruột và giúp hình thành hệ vi sinh vật dạ cỏ Nhờ vào sự giảm nồng độ NH3 và hạn chế được vi sinh vật gây thối nhiễm vào đường ruột,

Lactobacillus có hiệu quả kích thích tăng trưởng ở thú

1.3.4.3 Trong y học:

­ Về mặt trị liệu:

Ứng dụng vi khuẩn lactic trong phòng ngừa và điều trị bệnh cũng như duy trì

và phục hồi sức khỏe ngày càng phổ biến Chúng được sử dụng để chữa bệnh đường ruột, phòng ngừa và chữa trị viêm nhiễm âm đạo, điều trị làm điều chỉnh miễn dịch, giảm cholesterol, ngăn ngừa ung thư, sử dụng trong phẫu thuật chỉnh hình, trong nha khoa, sản xuất vật liệu sinh học,…[19]

­ Về mặt dinh dưỡng:

Bổ sung lactate – canxi vào thành phần sữa bột dinh dưỡng, bánh ngọt, bánh nướng để tăng lượng canxi cho cơ thể Các sản phẩm probiotic có nguồn gốc từ vi khuẩn lactic xuất hiện nhiều trong cả lĩnh vực thực phẩm bổ dưỡng

1.3.4.4 Trong công nghiệp:

Lượng acid lactic thu được trong quá trình lên men lactic có vi chua dễ chịu

và đặc tính bảo quản dễ dàng nên có thể làm gia vị đối với các loại đồ uống nhẹ, tinh dầu, dịch quả, mứt Chúng được dùng để acid hóa các mặt hàng thực phẩm như rượu vang hay dịch quả từ các loại quả acid thấp thay cho các acid hữu cơ Ngoài ra còn sử dụng trong công nghiệp da, dệt, nhuộm, sơn,…

1.3.4.5 Trong nông nghiệp và môi trường:

Vi khuẩn lactic có khả năng hạn chế sự phát triển của Fusarium – loại nấm gây bệnh quan trọng trong nông nghiệp Nấm Fusarium khi phát triển sẽ làm cây

yếu đi và đây là cơ hội gây bệnh cho cây trồng

Chế phẩm EM (Effective microorganism) hay chế phẩm vi sinh hữu hiệu, nó bao gồm 80 chủng vi sinh trong đó có sự góp phần của vi khuẩn lactic Hiệu quả của chế phẩm này là cải tạo đất, tăng năng suất cây trồng và giải quyết vấn đề môi trường

Mặc khác, việc xử lý các phế phẩm như vỏ, đầu tôm,…có tác dụng bảo vệ môi trường

Chất dẻo mới dễ phân hủy rất có là một loại polymer được gọi là poly acid lactic (PLA) Đó là sản phẩm được tạo ra từ phản ứng trùng hợp acid lactic, hy vọng trong tương lai nó sẽ thay thế cho chất dẻo được sản xuất từ dầu mỏ vì tính chất dễ phân hủy của nó rất có ý nghĩa trong việc bảo vệ môi trường

1.3.4.6 Một số ứng dụng khác của acid lactic:

Ngoài những ứng dụng rộng rãi trên thì vi khuẩn lactic còn được ứng dụng làm chất chỉ thị vi sinh vật để xác định vitamin và acid amin, và trong sản xuất một

số loại mỹ phẩm

1.4 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN Listeria monocytogenes:

1.4.1 Lịch sử phát hiện:

Listeria monocytogenes lần đầu tiên được mô tả bởi E.G.D Murray vào năm

1926 dựa trên sáu trường hợp đột tử ở trẻ Murray giới thiệu Vi khuẩn Listeria monocytogenes trước khi J.H Harvey Pirie thay đổi tên chi là Listeria năm 1940

Mặc dù Listeria monocyotogenes nhiễm ở cả động vật và con người đã được nói

đến vào những năm 1920, nhưng cho đến năm 1952 tại Đông Đức đã công nhận

Listeria monocyotogenes là một nguyên nhân quan trọng gây ra nhiễm trùng và

viêm màng não của trẻ sơ sinh Ở người lớn mắc bệnh do vi khuẩn này nguyên nhân

là do tổn thương hệ thống miễn dịch, chẳng hạn như người lạm dụng thuốc ức chế miển dịch và Corticosteroid cho khối u ác tính hoặc cấy ghép nội tạng, và những người nhiễm HIV

Mãi cho đến năm 1981 Listeria monocytogenes được xác định là một

nguyên nhân gây bệnh từ thực phẩm, liên quan đến 41 trường hợp mắc bệnh và 18

ca tử vong, chủ yếu ở phụ nữ mang thai và trẻ sơ sinh Từ đó một số trường hợp

nhiễm Listeria từ thực phẩm đã được báo cáo, và Listeria monocytogenes đã được

công nhận rộng rãi như là một mối nguy hiểm quan trọng trong ngành công nghiệp thực phẩm.[2]

1.4.2 Phân loại:

Theo George M Garrity, Julia A.Bell và Timothy G.Lilburn, phân loại học

của Listeria spp Trong giới vi sinh vật như sau:

Tuy nhiên, trong đó chỉ có loài Listeria monocytogenes là tác nhân gây bệnh

nội bào cơ hội đã trở thành nguyên nhân quan trọng của nhiễm trùng lây qua thực

phẩm thực sự ở người trên toàn thế giới Trong khi đó Listeria invanovii chỉ gây bệnh cho động vật đặc biệt là thú.[6]

1.4.3 Đặc điểm hình thái:

Hình 1.7: Vi khuẩn Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes là vi khuẩn hình que mảnh chiều ngang khoảng 0.5

µm, chiều dài khoảng 1÷2 µm, thuộc loại trực khuẩn gram dương, ngắn, nhỏ, không sinh bào tử, nhờ có tiên mao mọc ở cực nên chúng có kiểu chuyển động xoay tròn quanh trục thân thành từng đợt rất đặc trưng trong tiêu bản giọt ép.[2]

1.4.4 Khả năng chịu đựng:

Listeria monocytogenes là vi khuẩn dinh dưỡng lạnh và sinh trưởng ở nhiệt

độ thấp đến cao trong khoảng 1÷440C, với sinh trưởng tối ưu ở 25÷370C Ở 7÷100C chúng sinh sản nhanh, lên men glucose mà không sinh khí Tế bào tương đối đề kháng với sự đông lạnh, đông khô, nồng độ muối cao và pH 5÷9, không chịu được nóng.[2]

1.4.5 Phân bố và nguồn lây nhiễm:

Listeria monocytogenes có mặt ở khắp mọi nơi trong tự nhiên và chúng có

sức đề kháng cao tồn tại lâu dài trong động vật, đất, nước, rơm cỏ khô, thực phẩm sống bảo quản đông lạnh, trên da và ở bàn tay con người.[7]

Vi khuẩn này có thể truyền qua cơ thể người qua đường ăn uống những thực phẩm nhiễm bẩn hoặc ăn sống hoặc qua bàn tay, dụng cụ nhiễm khuẩn Sự nhiễm bẩn có thể xảy ra tại bất kỳ khâu nào trong quá trình sản xuất sản phẩm từ vùng thu hoạch nguyên liệu, quá trình chế biến, quá trình vận chuyển và phân phối, quá trình

bảo quản,… những loại thực phẩm đặc biệt liên kết với loài Listeria monocytogenes

gồm: sản phẩm từ sữa đặc biệt như phomát mềm, kem, bơ…, thịt pate và thịt jambon, thịt gà, trứng, hải sản, các loại rau ăn sống, thức ăn chế biến sẵn hay để lạnh.[6,11]

1.4.6 Con đường xâm nhiễm:

Yếu tố gây độc của Listeria monocytogenes là một loại hemolysin đặc biệt,

listeriolysin O Các tác nhân gây bệnh xâm nhập vào các mô của cơ thể và sinh sản bên trong tế bào của cơ thể, từ đó giải phóng ra độc tố gây ra sự chết của tế bào.[2]

Hình 1.8: Quá trình xâm nhiễm và tác hại của Listeria monocytogenes

Sau khi xâm nhiễm vào cơ thể qua đường tiêu hóa, Listeria monocytogenes

tiếp tục di chuyển qua dạ dày rồi đi vào các mô ở ruột non của vật chủ, bao gồm các

tế bào biểu mô và các đại thực bào của mảng Peyer Trong suốt quá trình di chuyển chúng sẽ không gây ra những thương tổn mô học nếu liều lượng nhiễm không đủ

lớn Trong dịch lympho hoặc máu thì Listeria monocytogenes di chuyển rất nhanh

đến hạch bạch huyết, lá lách và gan rồi nhanh chóng đi sâu vào không bào

Từ không bào chúng sẽ đi vào tế bào chất và nhân lên trong vòng 30 phút sau khi xâm nhiễm, từ 40÷60 phút ở trong tế bào gan và đại thực bào Quá trình xâm nhiễm vào cơ quan hoàn thanh sau 5÷7 ngày Nếu tế bào của vật chủ không tạo ra

đủ đáp ứng miễn dịch thì Listeria monocytogenes sẽ di chuyển đến các vị trí khác

trong cơ thể như não và nhau thai

1.4.7 Khả năng gây bệnh:

Bệnh do nhiễm khuẩn Listeria monocytogenes được gọi chung là bệnh

Listeriosis được thừa nhận từ lâu, là tình trạng nhiễm khuẩn do tiếp xúc hoặc ăn

phải các loại thực phẩm bị nhiễm Listeria monocytogenes Bệnh do Listeria gây ra

ở người được coi như một bệnh cơ hội Đây là một bệnh tương đối hiếm gặp nhưng nghiêm trọng với tỷ lệ tử vong cao 20÷30 % so với các tác nhân gây bệnh lây qua

thực phẩm do vi sinh vật khác, chẳng hạn như vi khuẩn Salmonella [1,2,11] Loại vi khuẩn Listeria monocytogenes được Tổ chức Y tế Thế giới xếp vào nhóm tác nhân

sinh học có nguy cơ cao trong lĩnh vực an toàn vệ sinh thực phẩm.[21]

Những người khỏe mạnh khi ăn phải thực phẩm bị nhiễm Listeria

monocytogenes có thể có triệu chứng hay không có triệu chứng Các triệu chứng

thường gặp xuất hiện từ 1÷7 ngày sau khi ăn, bao gồm các triệu chứng đau bụng, sốt nhẹ, tiêu chảy,… Các triệu chứng giảm xuống trong một vài ngày nhưng bệnh

nhân sẽ thải Listeria monocytogenes qua phân và nước tiểu trong một thời gian từ vài ngày đến vài tháng [19] Liều lượng nhiễm trùng của Listeria monocytogenes

vào khoảng 100÷1000 tế bào đặc biệt với những người mẫn cảm cao.[11]

Mọi người đều có thể bị nhiễm và mắc bệnh Những người có nguy cơ nhiễm

trùng Listeria monocytogenes cao:

 Phụ nữ mang thai, thai nhi và trẻ sơ sinh

 Người già: tỷ lệ tử vong trên 63% với người mắc bệnh trên 60 tuổi

 Những người có cơ địa suy giảm miễn dịch: Những người bị AIDS dễ bị

nhiễm Listeria hơn 300 lần so với những người có hệ miễn dịch bình thường

Phụ nữ mang thai nguy cơ mắc bệnh nhiễm Listeria monocytogenes gấp 20

lần so với người lớn khỏe mạnh khác Nếu một người phụ nữ mang thai bị nhiễm

Listeria monocytogenes và chúng phát triển trong ba tháng đầu của thai kỳ, có thể

dẫn đến đẻ non Biểu hiện căn bệnh giống như cúm nhẹ với các triệu chứng ớn lạnh,

mệt mỏi, đau đầu cũng như đau cơ bắp và khớp Bệnh nhiễm Listeria

monocytogenes ở giai đoạn sau trong mang thai có thể dẫn đến thai chết lưu hoặc dị

tật.[11,19]

Tỷ lệ tử vong gần 2040 % ở trẻ sơ sinh nhiễm Listeria monocytogenes bùng

phát sớm và ở trẻ bùng phát muộn là 020% Tỷ lệ tử vong ở trẻ lớn là dưới 10%

Đối với trẻ bị nhiễm Listeria monocytogenes còn sống sót thì thường để lại những

duy chứng: nhiễm trùng huyết, viêm não, viêm màng não, não úng thủy, chậm phát triển tâm thần.[19]

Nếu mẹ ăn thực phẩm bị ô nhiễm trong thai kỳ, bệnh thường không ảnh hưởng nặng đến sức khỏe và tính mạng của mẹ nhưng trẻ sơ sinh có thể được sinh

ra với bệnh nhiễm Listeria.[11]

1.4.8 Điều trị và cách phòng ngừa:

Căn bệnh này có thể được hiệu quả điều trị bằng kháng sinh nhóm beta

lactam, cephalosporin, ofloxacin,…nhưng hiện nay Listeria monocytogenes đã

kháng với một số loại kháng sinh thông thường vậy nên điều trị theo kháng sinh đồ Phát hiện sớm bệnh rất quan trọng trong vào việc điều trị thành công, đặc biệt là cho những người có nguy cơ cao Tại thời điểm này, không có thuốc chủng ngừa

Listeria monocytogenes.[19,27]

Để dự phòng bệnh cần thực hiện một số biện pháp phòng tránh như sau:

 Bảo đảm vệ sinh an toàn thực phẩm ở các khâu chế biến, vận chuyển, phân phối, bảo quản và tiêu dùng các sản phẩm thịt tươi, sữa tươi, sản phẩm sữa, trứng, các loại rau quả tươi sống

 Bảo đảm vệ sinh ăn uống, thực hiện “ăn chín, uống sôi”, sử dụng nước sạch và nguyên liệu an toàn để chế biến

 Rửa sạch tay trước khi ăn và sau khi đi vệ sinh ít nhất là 20 giây

 Giữ vệ sinh dụng cụ chế biến, dụng cụ chứa đựng và tủ lạnh bảo quản thức ăn; để riêng thực phẩm sống và chín, thực phẩm cũ và mới; bảo quản thực phẩm ở nhiệt độ an toàn

 Phát hiện sớm những biểu hiện bệnh và đến cơ sở y tế để chẩn đoán và điều trị sớm nhất khi có thể.[2,11,13]

1.5 TÌNH HÌNH NHIỄM VI KHUẨN Listeria monocytogenes TRONG THỰC PHẨM TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM HIỆN NAY

Tỉ lệ nhiễm bệnh ở thanh niên khỏe mạnh là rất thấp, khoảng 0.7 trường hợp trên 100.000 người Tuy nhiên, khả năng nhiễm ở trẻ em thường cao hơn khoảng trên 10 trường hợp trên 100.000 người và ở người già tỉ lệ này là 1.4 trường hợp trên 100.000 người Phụ nữ mang thai dễ dàng bị nhiễm bệnh gấp 17 lần so với thanh niên khỏe mạnh

1.5.1 Tình hình thế giới:

Việc phát hiện vi khuẩn Listeria monocytogenes ô nhiễm vào thực phẩm gây

ra các vụ ngộ độc thực phẩm trong nhiều năm qua tại nhiều nước trên thế giới như:

Mỹ, Úc, Canada, Pháp, Bỉ,… Các vụ ngộ độc thường dẫn đến tử vong Theo thống

kê từ năm 2008 tại Mỹ, hàng năm tại nước này, số bệnh nhân nhiễm bệnh do

Listeria monocytogenes khoảng 2500 người, với gần 500 người chết; còn tại Anh từ

2001 – 2005 có 1993 người mắc, với trên 200 ca tử vong; tại Canada hàng năm vẫn

thường xảy ra các vụ ngộ độc do Listeria monocytogenes Gần đây tại Trung Quốc

cũng đã báo cáo vài vụ ngộ độc do loại vi khuẩn này.[27]

1.5.2 Tình hình ở Việt Nam:

Những năm gần đây, công tác đảm bảo chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm, phòng chống ngộ độc thực phẩm và các bệnh truyền qua thực phẩm ngày càng được mọi tầng lớp trong xã hội quan tâm Sự vào cuộc quyết liệt của các cơ quan chức năng, cùng ý thức, tránh nhiệm của người sản xuất, kinh doanh, người tiêu dùng đã làm công tác này có những tiến bộ

Tuy nhiên, trong thời gian qua trên địa bàn cả nước vẫn xảy ra một số vụ ngộ độc thực phẩm ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng Theo số liệu thống kê đầy đủ của Cục ATVSTP chỉ trong 5 tháng đầu năm 2012, cả nước đã xảy ra:

(Theo Cục An toàn vệ sinh thực phẩm - Bộ Y tế)

Phần lớn các vụ ngộ độc xảy ra với quy mô nhiều người mắc, nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc là do thực phẩm nhiễm vi sinh vật Điển hình như vụ ngộ độc tập thể xảy ra trong một đám cưới ngày 12/4/2012 tại bản Hùn, xã Chiềng Cọ,

Thành phố Sơn La do thực phẩm nhiễm vi khuẩn Staphylococcus aureus làm hơn

300 người mắc và phải nhập viện cấp cứu Một vụ ngộ độc tập thể khác xảy ra ngày 16/4/2012 khiến hơn 200 công nhân của Công ty Dream MeKong thuộc xã An Cư, huyện Cái Bè, tỉnh Tiền Giang bị ngộ độc,… [29,31]

Thực tế với điều kiện phát triển nhanh các loại thực phẩm không rõ nguồn gốc tại Việt Nam như hiện nay, thì thực phẩm bị nhiễm loại vi khuẩn Listeria monocytogenes không phải là ngoại lệ nhưng công tác điều tra dịch tễ và sàng lọc

tác nhân gây bệnh chưa được đúng mức nên theo Bác sĩ Nguyễn Trung Cấp – Phó khoa Điều trị tích cực – Bệnh viện Nhiệt đới TW cho biết: “Mỗi năm bệnh viện chỉ

điều trị cho khoảng 3÷4 trường hợp nhiễm khuẩn Listeria monocytogenes Đây là

bệnh hiếm gặp nhưng khi đã nhiễm thì thường rất nặng”.[30]

Mặc dù, tình hình lây nhiễm vi khuẩn Listeria monocytogenes không xảy ra

nhiều dịch bệnh tại Việt Nam Nhưng tình hình lây nhiễm chúng trên thực phẩm với mức độ ngày càng tăng cao Nên vấn đề về loại vi khuẩn này là vấn đề đang được quan tâm hàng đầu cả trên thế giới và Việt Nam

1.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG Listeria

monocytogenes TRONG THỰC PHẨM:

1.6.1 Phương pháp truyền thống :

Nghiên cứu để phát hiện và định lượng vi sinh vật trong thực phẩm sử dụng nhiều phương pháp truyền thống như : đếm trực tiếp dưới kính hiển vi, đếm khuẩn lạc qua đổ đĩa hay cấy trên bề mặt thạch, đếm khuẩn lạc trên màng lọc, hay phương pháp MPN,…

Riêng với loài vi khuẩn Listeria monocytogenes sử dụng phương pháp MNP

Vì vi khuẩn Listeria monocytogenes tồn tại trong thực phẩm không nhiều như vi khuẩn

E coli, Salmonella… nên để định lượng chính xác loài vi khuẩn này trong thực phẩm

cụ thể là trong nguyên liệu cải bẹ xanh và dưa cải muối chua thì phương pháp MPN được áp dụng cho kết quả tối ưu nhất

 Phương pháp MPN (Most Probable Number):

Phương pháp MPN (phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ) là phương pháp dùng để ước lượng số lượng vi sinh vật hiện diện trong một đơn

vị thể tích dựa vào bảng Mac Crandy Phương pháp MPN dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố VSV trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu

 Mỗi độ pha loãng được nuôi cấy lập lại nhiều lần (310 lần)

 Các độ pha loãng được chọn lựa sao cho trong các lần lặp lại có một số lần dương tính và có một số lần âm tính

 Số lần dương tính được ghi nhận và so sánh với bảng thống kê giá trị ước đoán số lượng VSV trong mẫu

 Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp MPN

 Có 2 hệ thống MPN: Hệ thống 9 ống và hệ thống 15 ống

Cho phép định lượng được mật độ VSV thấp trong thể tích mẫu lớn

Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm tra trong ống nghiệm để xác định ống dương tính Tra bảng Mac Crandy để có kết quả.[4,9,16]

1.6.2 Một số phương pháp hiện đại khác:

Phát hiện vi sinh vật bằng phương pháp nuôi cấy được xây dựng và phát triển trong thời gian dài, được nhiều nước công nhận và trở thành những phương pháp tiêu chuẩn Tuy vậy nhược điểm lớn nhất của phương pháp nuôi cấy là tốn nhiều thời gian cho kết quả chậm, mất nhiều công sức, cồng kềnh và ngày càng tỏ

ra không đáp ứng được các yêu cầu phân tích phục vụ nhu cầu thực tế hiện nay Để khắc phục những nhược điểm trên của phương pháp nuôi cấy, nhiều phương pháp nhanh và tự động đã được hình thành và phát triển dựa trên nhiều nguyên tắc sinh học và vi sinh vật học khác nhau Các phương pháp mới này nhằm mục đích rút ngắn thời gian phân tích, giảm thiểu sự phức tạp trong thao tác, dễ dàng thực hiện vì

có độ nhạy cao và độ chính xác cao

Một số phương pháp hiện đại như: Elisa (Enzyme – Linked ImmunoSorbent Assay), PCR (Polymerase Chain Reaction), lai phân tử,…[4,10]

CHƯƠNG II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU:

­ Nguyên liệu cải bẹ xanh được mua tại chợ Vĩnh Hải từ các đầu mối thu

mua nhập rau từ các vùng trồng cấy khác nhau: Đà Lạt, Huyện Diên Khánh – Khánh Hòa và Thị xã Ninh Hòa – Khánh Hòa

­ Dịch lên men chua cải bẹ xanh theo thời gian lên men

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Listeria monocytogenes NHIỄM TRÊN

NGUYÊN LIỆU CẢI BẸ XANH VÀ DƯA CẢI MUỐI CHUA:

2.2.1 Mẫu nghiên cứu:

Cải bẹ xanh sau khi mua từ chợ Vĩnh Hải được đưa về phòng thí nghiệm sau

đó chia thành 5 mẫu:

­ Mẫu 1: mẫu cải bẹ xanh chưa qua xử lý

­ Mẫu 2: mẫu cải bẹ xanh được rửa dưới vòi nước chảy

­ Mẫu 3: mẫu cải bẹ xanh sau khi đã làm héo

­ Mẫu 4: mẫu cải bẹ xanh lên men với dung dịch lên men 7 % muối

­ Mẫu 5: mẫu cải bẹ xanh lên men với dung dịch lên men 7 % muối có bổ sung 10% dịch lên men cũ

­ Mẫu 6: mẫu dịch lên men chua cải bẹ xanh theo thời gian lên men

2.2.2 Các loại hóa chất và dụng cụ thí nghiệm:

Môi trường nuôi cấy, canh thang, nước pha loãng và môi trường sinh vật hoá học được điều chế theo công thức Các môi trường được pha chế vào bình tam giác, hút vào các ống nghiệm và được hấp tiệt trùng (1100C/30 phút hoặc 1210C/15 phút) Các dụng cụ như pipet, ống đong, đĩa peptri được sấy 1800C/30 phút nếu sử dụng đĩa peptri nhựa dùng dung dịch khử trùng 0.2 % và để ráo trước khi đổ đĩa

2.2.2.1 Hóa chất và môi trường:

­ Nước muối sinh lý 0.85 %

­ Môi trường tăng sinh BLEB

­ Thạch Oxford Agar