monocytogenes TRONG THỰC PHẨM: 1.6.1. Phương pháp truyền thống :
Nghiên cứu để phát hiện và định lượng vi sinh vật trong thực phẩm sử dụng nhiều phương pháp truyền thống như : đếm trực tiếp dưới kính hiển vi, đếm khuẩn lạc qua đổ đĩa hay cấy trên bề mặt thạch, đếm khuẩn lạc trên màng lọc, hay phương
pháp MPN,…
Riêng với loài vi khuẩn Listeria monocytogenes sử dụng phương pháp MNP. Vì vi khuẩn Listeria monocytogenes tồn tại trong thực phẩm không nhiều như vi khuẩn
E. coli, Salmonella… nên để định lượng chính xác loài vi khuẩn này trong thực phẩm cụ thể là trong nguyên liệu cải bẹ xanh và dưa cải muối chua thì phương pháp MPN được áp dụng cho kết quả tối ưu nhất.
Phương pháp MPN (Most Probable Number):
Phương pháp MPN (phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn
độ) là phương pháp dùng để ước lượng số lượng vi sinh vật hiện diện trong một đơn
vị thể tích dựa vào bảng Mac Crandy. Phương pháp MPN dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố VSV trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu.
Mỗi độ pha loãng được nuôi cấy lập lại nhiều lần (310 lần).
Các độ pha loãng được chọn lựa sao cho trong các lần lặp lại có một số lần
dương tính và có một số lần âm tính.
Số lần dương tính được ghi nhận và so sánh với bảng thống kê giá trị
ước đoán số lượng VSV trong mẫu.
Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp MPN.
Có 2 hệ thống MPN: Hệ thống 9 ống và hệ thống 15 ống.
Cho phép định lượng được mật độ VSV thấp trong thể tích mẫu lớn.
Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm tra trong ống nghiệm để xác định ống dương tính. Tra bảng Mac Crandy để có kết quả.[4,9,16]
1.6.2. Một số phương pháp hiện đại khác:
Phát hiện vi sinh vật bằng phương pháp nuôi cấy được xây dựng và phát triển trong thời gian dài, được nhiều nước công nhận và trở thành những phương pháp tiêu chuẩn. Tuy vậy nhược điểm lớn nhất của phương pháp nuôi cấy là tốn nhiều thời gian cho kết quả chậm, mất nhiều công sức, cồng kềnh và ngày càng tỏ ra không đáp ứng được các yêu cầu phân tích phục vụ nhu cầu thực tế hiện nay. Để khắc phục những nhược điểm trên của phương pháp nuôi cấy, nhiều phương pháp nhanh và tự động đã được hình thành và phát triển dựa trên nhiều nguyên tắc sinh học và vi sinh vật học khác nhau. Các phương pháp mới này nhằm mục đích rút ngắn thời gian phân tích, giảm thiểu sự phức tạp trong thao tác, dễ dàng thực hiện vì có độ nhạy cao và độ chính xác cao.
Một số phương pháp hiện đại như: Elisa (Enzyme – Linked ImmunoSorbent Assay), PCR (Polymerase Chain Reaction), lai phân tử,…[4,10]
CHƯƠNG II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU:
Nguyên liệu cải bẹ xanh được mua tại chợ Vĩnh Hải từ các đầu mối thu mua nhập rau từ các vùng trồng cấy khác nhau: Đà Lạt, Huyện Diên Khánh – Khánh Hòa và Thị xã Ninh Hòa – Khánh Hòa.
Dịch lên men chua cải bẹ xanh theo thời gian lên men.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Listeria monocytogenes NHIỄM TRÊN NGUYÊN LIỆU CẢI BẸ XANH VÀ DƯA CẢI MUỐI CHUA: NGUYÊN LIỆU CẢI BẸ XANH VÀ DƯA CẢI MUỐI CHUA:
2.2.1. Mẫu nghiên cứu:
Cải bẹ xanh sau khi mua từ chợ Vĩnh Hải được đưa về phòng thí nghiệm sau đó chia thành 5 mẫu:
Mẫu 1: mẫu cải bẹ xanh chưa qua xử lý.
Mẫu 2: mẫu cải bẹ xanh được rửa dưới vòi nước chảy. Mẫu 3: mẫu cải bẹ xanh sau khi đã làm héo.
Mẫu 4: mẫu cải bẹ xanh lên men với dung dịch lên men 7 % muối.
Mẫu 5: mẫu cải bẹ xanh lên men với dung dịch lên men 7 % muối có bổ sung 10% dịch lên men cũ.
Mẫu 6: mẫu dịch lên men chua cải bẹ xanh theo thời gian lên men.
2.2.2. Các loại hóa chất và dụng cụ thí nghiệm:
Môi trường nuôi cấy, canh thang, nước pha loãng và môi trường sinh vật hoá
học được điều chế theo công thức. Các môi trường được pha chế vào bình tam giác,
hút vào các ống nghiệm và được hấp tiệt trùng (1100C/30 phút hoặc 1210C/15 phút). Các dụng cụ như pipet, ống đong, đĩa peptri được sấy 1800C/30 phút nếu sử dụng
đĩa peptri nhựa dùng dung dịch khử trùng 0.2 % và để ráo trước khi đổ đĩa.
2.2.2.1. Hóa chất và môi trường:
Nước muối sinh lý 0.85 %.
Môi trường tăng sinh BLEB.
Thạch máu cừu.
Môi trường test đường gồm: Môi trường cơ bản, 0.6 % cao nấm men và
canh thang đường Rhamnose, Xylose 0.5 %.
Bộ thuốc nhuộm Gram.
Hydrogen Peroxide 30 %.
Dung dịch đệm Phosphate pH 7.0.
Môi trường giữ chủng: môi trường lỏng BLEB hay TSA, bổ sung 0.6 %
cao nấm men, 1.5 % agar.
2.2.2.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm: Ống đong (100ml, 250ml,500ml, 1000ml). Ống đong (100ml, 250ml,500ml, 1000ml). Bình tam giác. Pipet (1ml, 5ml, 10ml). Đĩa peptri. Que cấy. Đèn cồn. Ống nghiệm các loại. Cân điện tử. Tủ sấy. Máy hấp vô trùng.
2.2.3. Quy trình muối chua cải bẹ xanh:
Hình 2.1: Sơ đồ quy trình muối chua cải bẹ. [9]
Thuyết minh quy trình:
Trong các món ăn cổ truyền nổi tiếng của dân tộc Việt Nam, dưa cải muối chua được xem là một món ăn rất quen thuộc với người dân Việt. Nó được sản xuất thủ công mang sắc thái kinh nghiệm và bản sắc riêng của dân tộc Việt Nam, và được truyền từ đời này sang đời khác. Để hiểu rõ hơn về sản phẩm lên men này thì chúng ta sẽ phải đi sâu vào qui trình công nghệ.
Làm sạch Làm héo Cắt nhỏ Muối chua Cải bẹ xanh Sản phẩm Lên men
(nén chặt khối lên men) Dung dịch nước muối
Nguyên liệu:
Cải bẹ xanh được chọn tốt nhất ở độ già bánh tẻ, mới chớm có hoa để số lượng vi sinh vật lên men lactic có số lượng cao nhất. Không nên sử dụng loại rau già khi lên men sẽ có hiện tượng dưa khú, cũng như rau quá non thì hàm lượng nước nhiều và số lượng vi sinh vật lên men lactic ít nên khi lên men sẽ dễ bị hư hỏng.
Sử dụng các cây dưa có bẹ, khối lượng trung bình mỗi cây 2÷3 kg, với hàm lượng đường trung bình trong nguyên liệu là 4÷4.5 %.
Làm sạch:
Cắt bỏ những phần cuộng già ở sát gốc cây.
Loại bỏ những lá có khuyết tật, héo, giập nát, bị sâu, rệp,… Nếu dùng lá dưa đã úa vàng thì tỉ lệ hao hụt cao và vitamin C bị thất thoát nhiều.
Sau đó rửa kĩ dưới vòi nước chảy cho hết đất, cát, tạp chất và sạch một phần vi sinh vật có trên lá. Tránh làm giập lá khi rửa.
Làm héo:
Giúp làm giảm lượng nước trong nguyên liệu giúp cho quá trình trích ly sau này tốt hơn.
Tạo cho sản phẩm giòn, dễ dàng thẩm thấu dung dịch lên men làm dưa muối có hương vị đậm đà.
Cắt nhỏ:
Cắt nhỏ giúp khả năng thẩm thấu các dung dịch nhanh thời gian lên men ngắn hơn.
Dễ dàng hơn khi sử dụng.
Muối chua:
Muối dưa trong các vại sành, thùng gỗ. Dùng muối NaCl tinh để muối dưa.
Tỉ lệ muối thông thường khi muối chua rau quả sử dụng 7 % so với trọng lượng nguyên liệu. Nếu lượng muối càng tăng thì quá trình lên men càng bị chậm lại và sự tạo thành acid lactic càng giảm. Cho muối để tạo áp suất thẩm thấu, làm
cho các chất khô được thoát nhanh ra ngoài, làm các tổ chức mô bào của nguyên liệu thực vật được nén chặt lại nguyên liệu không bị nát mà trở nên giòn hơn.
Tỉ lệ nước sử dụng là 20 % so với khối lượng dưa.
Trước khi muối có thể thêm 5 % hành tươi để tạo hương cho sản phẩm. Đồng thời hành cũng có tác dụng hạn chế một số vi sinh vật có hại và bổ sung thêm 1.5 % đường.
Lên men:
Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men này là 26-30-350C nhưng trong
khoảng nhiệt độ này vi khuẩn butyric có thể sẽ phát triển mạnh, dưa có màu xỉn,
mềm, có mùi vị lạ. Vì vậy nên khống chế ở nhiệt độ 20÷250C để sản phẩm có hương vị tốt, trạng thái giòn.
Thông thường vi khuẩn lactic sẽ chịu được pH thấp hơn so với các vi
khuẩn khác (pH=3). Vì thế, trong muối chua cần tăng nhanh độ acid để loại trừ khả
năng nhiễm các loài vi khuẩn khác bằng cách bổ sung nước chua cũ.
Sản phẩm:
Sản phẩm thu được cần đạt được một số chỉ tiêu cảm quan:
Trạng thái : vẻ ngoài đẹp thịt rau chắc giòn, dịch lên men không nổi váng. Màu sắc : màu vàng sáng, không ngả màu lạ.
Mùi, vị : hương vị hài hòa, có mùi thơm.
2.2.4. Bố trí thí nghiệm:
2.2.4.1. Nghiên cứu mức độ nhiễm Listeria monocytogenes trên nguyên liệu cải bẹ xanh: bẹ xanh:
Hình 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu mức độ nhiễm Listeria monocytogenes trên nguyên liệu cải bẹ xanh.
Phương pháp tiến hành:
Nguyên liệu cải bẹ xanh được mua từ các đầu mối thu mua nhập rau từ Đà
lạt, Diên Khánh – Khánh Hòa và Ninh Hòa – Khánh Hòa.
Yêu cầu chất lượng nguyên liệu: cải bẹ xanh được chọn tốt nhất ở độ già bánh tẻ, mới chớm có hoa, không nên sử dụng loại rau già khi lên men sẽ có hiện tượng dưa khú, cũng như rau quá non thì hàm lượng nước nhiều và số lượng vi sinh vật lên men lactic ít nên khi lên men sẽ dễ bị hư hỏng. Sử dụng các cây dưa có bẹ, khối lượng trung bình mỗi cây 2÷3 kg, không bị giập nát hay héo úa.
Nguyên liệu mua về được chia thành 2 phần và tiến hành kiểm tra ngay trong ngày. Phần 1: nguyên liệu cải bẹ xanh mua về đem kiểm tra ngay mà không qua xử lý gì.
Phần còn lại: nguyên liệu cải bẹ xanh được rửa thông thường dưới vòi nước chảy (3 lần) sau đó tiến hành kiểm tra.
Quy trình kiểm tra để phát hiện và định lượng Listeria monocytogenes được trình bày phần 2.2.4.3.
Chưa qua xử lý Rửa dưới vòi nước chảy
Phát hiện và định lượng Listeria monocytogenes
2.2.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch lên men chua tới sự sinh trưởng và phát triển của Listeria monocytogenes theo thời gian lên men: triển của Listeria monocytogenes theo thời gian lên men:
Hình 2.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu mức độ nhiễm Listeria monocytogenes trên dưa muối chua.
Phương pháp tiến hành:
Phần mẫu cải bẹ xanh sau khi được làm sạch, tiến hành làm héo qua trong điều kiện tự nhiên trong thời gian 4 giờ sau đó lấy mẫu sau khi làm héo đem kiểm tra.
Phần cải sau khi làm héo được chia thành 2 phần để muối chua:
Phần 1: nguyên liệu cải bẹ xanh sau khi làm héo được muối chua với dung dịch lên men là 7 % muối. Sau đó tiến hành lấy mẫu kiểm tra qua các ngày lên men.
Phần 2: nguyên liệu cải bẹ xanh sau khi làm héo đem muối chua với dung dịch lên men 7 % muối có bổ sung thêm 10 % dịch lên men cũ. Sau đó cũng tiến hành lấy mẫu kiểm tra qua các ngày lên men.
Quy trình kiểm tra để phát hiện và định lượng Listeria monocytogenes được trình bày phần 2.3.2.3.
Cải bẹ xanh làm héo
Phát hiện và định lượng
Listeria monocytogenes
Dung dịch lên men 7 % muối NaCl tinh bổ sung 10% dịch
lên men cũ.
Dung dịch lên men 7% muối NaCl tinh
Lên men
1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày
2.2.4.3. Sơ đồ quy trình kiểm tra Listeria monocytogenes :
Hình 2.5: Sơ đồ quy trình kiểm tra Listeria monocytogenes.
Thuyết minh:
(1) Phần mẫu để phát hiện Listeria monocytogenes : mẫu kiểm tra được cắt nhỏ trong điều kiện vô trùng. Sau đó dùng cân phân tích cân 25 g/mẫu cho vào túi vô trùng, thêm 225 ml nước muối sinh lý 0.85 % đã vô trùng và làm dập trong 30 giây, buộc chặt miệng túi đem ủ ở 300C trong 48 giờ. Sau đó đem cấy trên môi trường OXA, kiểm tra đĩa dương tính với Esculin và sau đó tiến hành test định danh
Listeria monocytogenes bằng các thử nghiệm sinh hóa.
(2) Phần mẫu để định lượng Listeria monocytogenes.
Mẫu (25g) đã được cắt nhỏ trong điều kiện vô trùng và đồng nhất trong
225ml nước muối sinh lý 0.85 % đã vô trùng, sau đó tiến hành tăng sinh như sau:
Chuẩn bị 9 ống (5ml/ống) canh thang chứa môi trường làm giàu BLEB với 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp: 10-1, 10-2, 103 và 2 ống nước muối sinh lý 0.85 % đã được vô trùng (9ml/ống) cho mỗi mẫu kiểm tra.
Cân 25g /225ml nước muối sinh lý 0.85%
Mẫu lấy về
Xử lý mẫu
Ủ 48h/ 300C
Cấy ria trên môi
trường OXA Ghi nhận ống (+) với Listeria monocytogenes Tra bảng Mac Crandy - Tan huyết (+) - Di động (+) -Rhamnose (+) - Xylose (-) - Catalase (+) - Nhuộm Gram (+) (1) Esculin (+) (2) Test định danh
Pha loãng mẫu Ống nuôi cấy ban đầu (ống gốc) 10-1 101 10-2 102 10-3 103 10-4 104 Pha loãng Độpha loãng 10-5 105 Độpha loãng cuối
Hình 2.6: Ống canh thang chứa môi trường BLEB.
Mẫu sau khi đồng nhất trong 225 ml nước muối sinh lý 0.85 %, ta được
mẫu ban đầu có nồng độ 10-1. Tiến hành pha loãng bậc 10 liên tiếp bằng cách hút 1ml từ túi chứa mẫu ban đầu cho vào ống nước muối sinh lý được 10-2 và từống 10-
2
hút 1ml cho vào ống nước muối sinh lý được nồng độ 10-3. Cứ mỗi nồng độ hút 1ml cho vào 3 ống canh thang chứa môi trường BLEB.
Đem các ống canh thang đã tăng sinh ủở nhiệt độ phòng trong 48 giờ.
Hình 2.8: Các ống canh thang đã tăng sinh đem ủ.
Phát hiện Listeria monocytogenes có trong các ống nghiệm thuộc dãy MPN. Quá trình phân lập và định danh như sau:
Phân lập Listeria monocytogenes trên môi trường Oxford Agar.
Tại thời điểm 48 giờ sau khi tăng sinh, dùng que cấy lấy dịch mẫu từ ống
tăng sinh cấy ria trên môi trường thạch phân lập OXA chứa Esculin. Nuôi cấy trên
các đĩa thạch OXA ở 30÷380C/48 giờ. Theo dõi tại thời điểm 48 giờ ngay sau khi phân lập, các khuẩn lạc Listeria monocytogenes có màu xám đen hay nâu đen với quầng đen bao quanh, khuẩn lạc lõm, nhỏ, đường kính khoảng 1mm trên môi
trường chứa esculin. Một số khuẩn lạc màu đen hơi nâu nhưng xuất hiện chậm hơn
2 ngày nhưng không được coi là Listeria.
Định danh Listeria monocytogenes bằng các thử nghiệm sinh hóa:
Khả năng lên men đường:
Mục đích: kiểm tra vi sinh vật có khả năng lên men các loại đường là: Rhamnose, Xylose.
Phương pháp tiến hành: Sử dụng que cấy kim lấy giống vi sinh vật từ các đĩa dương tính với Esculin, dùng que cấy đâm sâu vào khối thạch hình trụ. Ủ các ống canh trùng thử khả năng lên men đường Rhamnose, Xylose 0.5 % ở 300C 2448 giờ. Kết quảListeria monocytogenes có khả năng lên men đường Rhamnose, dương tính (môi trường chuyển sang màu vàng) và âm tính (màu xanh) và theo dõi thường xuyên. Listeria monocytogenes không có khả năng lên men đường Xylose.
Hình 2.11: Các ống nghiệm kiểm tra khả năng lên men đường Rhamnose.
Thử catalase:
Mục đích: kiểm tra khả năng phân huỷ H2O2 của vi sinh vật nhờ sản sinh ra
enzyme catalase.
Phương pháp tiến hành:
Hóa chất dùng để thử nghiệm là: Hydrogen Peroxide 30%, dung dịch đệm
Phosphate pH 7.0.
Dùng que cấy thẳng lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuẩn mới hoạt hóa
(24 giờ) đặt trên lame, nhỏ một giọt H2O2 30% lên sinh khối vi sinh vật trên lame, nhỏ một giọt H2O2 0.5 % rồi đậy lại bằng lamelle.
Nếu dương tính sẽ xuất hiện bọt khí giữ lại giữa lame và lamelle.
Hình 2.12: Catalase âm tính Hình 2.13: Catalase dương tính
Nhuộm gram:
Mục đích: giúp ta phân biệt vi khuẩn thành 2 nhóm lớn: vi khuẩn Gram (+)