Hình 2.5: Sơ đồ quy trình kiểm tra Listeria monocytogenes.
Thuyết minh:
(1) Phần mẫu để phát hiện Listeria monocytogenes : mẫu kiểm tra được cắt nhỏ trong điều kiện vô trùng. Sau đó dùng cân phân tích cân 25 g/mẫu cho vào túi vô trùng, thêm 225 ml nước muối sinh lý 0.85 % đã vô trùng và làm dập trong 30 giây, buộc chặt miệng túi đem ủ ở 300C trong 48 giờ. Sau đó đem cấy trên môi trường OXA, kiểm tra đĩa dương tính với Esculin và sau đó tiến hành test định danh
Listeria monocytogenes bằng các thử nghiệm sinh hóa.
(2) Phần mẫu để định lượng Listeria monocytogenes.
Mẫu (25g) đã được cắt nhỏ trong điều kiện vô trùng và đồng nhất trong
225ml nước muối sinh lý 0.85 % đã vô trùng, sau đó tiến hành tăng sinh như sau:
Chuẩn bị 9 ống (5ml/ống) canh thang chứa môi trường làm giàu BLEB với 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp: 10-1, 10-2, 103 và 2 ống nước muối sinh lý 0.85 % đã được vô trùng (9ml/ống) cho mỗi mẫu kiểm tra.
Cân 25g /225ml nước muối sinh lý 0.85%
Mẫu lấy về
Xử lý mẫu
Ủ 48h/ 300C
Cấy ria trên môi
trường OXA Ghi nhận ống (+) với Listeria monocytogenes Tra bảng Mac Crandy - Tan huyết (+) - Di động (+) -Rhamnose (+) - Xylose (-) - Catalase (+) - Nhuộm Gram (+) (1) Esculin (+) (2) Test định danh
Pha loãng mẫu Ống nuôi cấy ban đầu (ống gốc) 10-1 101 10-2 102 10-3 103 10-4 104 Pha loãng Độpha loãng 10-5 105 Độpha loãng cuối
Hình 2.6: Ống canh thang chứa môi trường BLEB.
Mẫu sau khi đồng nhất trong 225 ml nước muối sinh lý 0.85 %, ta được
mẫu ban đầu có nồng độ 10-1. Tiến hành pha loãng bậc 10 liên tiếp bằng cách hút 1ml từ túi chứa mẫu ban đầu cho vào ống nước muối sinh lý được 10-2 và từống 10-
2
hút 1ml cho vào ống nước muối sinh lý được nồng độ 10-3. Cứ mỗi nồng độ hút 1ml cho vào 3 ống canh thang chứa môi trường BLEB.
Đem các ống canh thang đã tăng sinh ủở nhiệt độ phòng trong 48 giờ.
Hình 2.8: Các ống canh thang đã tăng sinh đem ủ.
Phát hiện Listeria monocytogenes có trong các ống nghiệm thuộc dãy MPN. Quá trình phân lập và định danh như sau:
Phân lập Listeria monocytogenes trên môi trường Oxford Agar.
Tại thời điểm 48 giờ sau khi tăng sinh, dùng que cấy lấy dịch mẫu từ ống
tăng sinh cấy ria trên môi trường thạch phân lập OXA chứa Esculin. Nuôi cấy trên
các đĩa thạch OXA ở 30÷380C/48 giờ. Theo dõi tại thời điểm 48 giờ ngay sau khi phân lập, các khuẩn lạc Listeria monocytogenes có màu xám đen hay nâu đen với quầng đen bao quanh, khuẩn lạc lõm, nhỏ, đường kính khoảng 1mm trên môi
trường chứa esculin. Một số khuẩn lạc màu đen hơi nâu nhưng xuất hiện chậm hơn
2 ngày nhưng không được coi là Listeria.
Định danh Listeria monocytogenes bằng các thử nghiệm sinh hóa:
Khả năng lên men đường:
Mục đích: kiểm tra vi sinh vật có khả năng lên men các loại đường là: Rhamnose, Xylose.
Phương pháp tiến hành: Sử dụng que cấy kim lấy giống vi sinh vật từ các đĩa dương tính với Esculin, dùng que cấy đâm sâu vào khối thạch hình trụ. Ủ các ống canh trùng thử khả năng lên men đường Rhamnose, Xylose 0.5 % ở 300C 2448 giờ. Kết quảListeria monocytogenes có khả năng lên men đường Rhamnose, dương tính (môi trường chuyển sang màu vàng) và âm tính (màu xanh) và theo dõi thường xuyên. Listeria monocytogenes không có khả năng lên men đường Xylose.
Hình 2.11: Các ống nghiệm kiểm tra khả năng lên men đường Rhamnose.
Thử catalase:
Mục đích: kiểm tra khả năng phân huỷ H2O2 của vi sinh vật nhờ sản sinh ra
enzyme catalase.
Phương pháp tiến hành:
Hóa chất dùng để thử nghiệm là: Hydrogen Peroxide 30%, dung dịch đệm
Phosphate pH 7.0.
Dùng que cấy thẳng lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuẩn mới hoạt hóa
(24 giờ) đặt trên lame, nhỏ một giọt H2O2 30% lên sinh khối vi sinh vật trên lame, nhỏ một giọt H2O2 0.5 % rồi đậy lại bằng lamelle.
Nếu dương tính sẽ xuất hiện bọt khí giữ lại giữa lame và lamelle.
Hình 2.12: Catalase âm tính Hình 2.13: Catalase dương tính
Nhuộm gram:
Mục đích: giúp ta phân biệt vi khuẩn thành 2 nhóm lớn: vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím và vi khuẩn Gram (-) bắt màu hồng. Ngoài ra nó còn giúp ta quan sát rõ và phân biệt về hình dạng, cấu tạo, cách phân bố của các loại vi khuẩn khác nhau.
Phương pháp tiến hành:
Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa lame, làm khô trong không khí.
Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2÷3 lần.
Phủ crystal violet lên vết bôi, giữ trong 20 giây. Sau đó rửa sạch bằng nước cất và làm ráo nước thừa.
Phủ vết bôi với dung dịch iodine của bộ nhuộm gram, giữ 1 phút. Đổ hết dung dịch iodine và phủ vết bôi với ethyl alcohol 95 % trong 10÷20 giây. Dừng hoạt động của alcohol bằng cách rửa lame với nước vài phút.
Phủ bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 20 giây, rửa nước, để khô trong không khí.
Soi kính: dùng vật kính đầu 100x.
Listeria monocytogenes, Gram (+) bắt màu tím.
Thử khả năng di động theo phương pháp giọt treo:
Mục đích: Xác định khả năng di động của vi sinh vật. Phương pháp tiến hành:
Kiểm tra bằng tiêu bản soi tươi, dùng nước muối sinh lý 0.85 % tạo huyền dịch. Chọn một khuẩn lạc đủ lớn để làm giọt treo tương đối cao, đánh cho tan đều.
Nếu lấy quá ít vi khuẩn, một vài tế bào hiện diện sẽ dán dính trên lame và cho thấy
không di động.
Theo dõi trên kính hiển vi Listeria monocytogenes có hình que ngắn, mảnh,
di động quay tròn chậm hoặc theo kiểu nhào lộn do nó có tiêu mao. Đối với, các trực khuẩn lớn hoặc trực khuẩn di chuyển nhanh, kiểu bơi không phải là Listeria monocytogenes.
Thử khả năng tan huyết:
Phương pháp tiến hành: Chọn khuẩn lạc điển hình trên môi trường thạch OXA, dùng que cấy vòng cấy chuyển sang môi trường thạch máu. Hồng cầu cừu rửa (3 %) đã được đưa vào môi trường thạch tương TSA, bổ sung thêm 0.6 % chất chiết nấm men. Các khuẩn lạc đặc trưng được cấy chấm trên môi trường thạch máu và ủ 370C trong 2428 giờ.
Ghi nhận có hoạt tính tan máu hay không. Trên môi trường thạch máu, khuẩn lạc Listeria monocytogenes được bao quanh bởi vòng sáng hẹp do hiện tượng dung huyết dạng nên vòng tan huyết trong và rõ.
Xác định tính chất sinh hóa của Listeria monocytogenes như bảng sau: Bảng 2.1: Tính chất sinh hóa của Listeria monocytogenes.
STT Phản ứng sinh hóa Biểu hiện của
Listeria monocytogenes
1 Lên men đường Rhamnose (+)
2 Lên men đường Xylose (-)
3 Catalase (+)
4 Nhuộm Gram (+)
5 Khả năng di động (+)
6 Khả năng tan huyết (+)