Nghiên cứu quy trình chiết phlorotannin từ rong sargassum cristaefolium khánh hòa

Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only i LỜI CẢM ƠN Trải qua thời gian học tập trường trình làm đồ án tôt nghiệp Viện nghiên cứu ứng dụng công nghệ Nha Trang, nhận dạy dỗ bảo tận tình anh chị Viện Cùng với quan tâm giúp đỡ Khoa Chế Biến – Trường Đại học Nha Trang động viên gia đình, bạn bè nỗ lực thân kết thúc khóa học hồn thành đồ án tốt nghiệp Trước hết tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Trần Thị Thanh Vân trực tiếp hướng dẫn đồ án Tôi chân thành cảm ơn Khoa Chế biến – Trường Đại học Nha Trang tận tình dạy dỗ tơi thời gian học đại học Cảm ơn Th.S Võ Mai Như Hiếu, Đặng Xuân Cường anh chị công tác phịng thí nghiệm Viện tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình thực đồ án Tơi xin cảm ơn gia đình chỗ dựa vững chắc, động viên ủng hộ suốt thời gian học tập Nha Trang, tháng năm 2010 Sinh viên thực Vũ Thị Kim Dung Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only ii MỤC LỤC LỜI NÓI ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan rong biển 1.1.1 Đặc điểm chung rong biển 1.1.2 Sự phân bố nguồn lợi rong biển 1.1.3 Phân loại rong biển 1.1.4 Thành phần sinh hóa rong biển 1.1.5 Giá trị dinh dưỡng ứng dụng rong biển 1.1.6 Tình hình sử dụng, chế biển rong biển Việt Nam 1.2 Giới thiệu rong Nâu rong Mơ (Sargassum) 1.2.1 Đặc điểm phân bố rong Mơ 1.2.2 Đặc điểm sinh trưởng, phát triển thời kì thu hoạch rong biển hợp lý cho cơng nghệ chế biến .12 1.2.3 Thành phần hóa học rong Nâu 13 1.2.4 Quá trình vận chuyển biện pháp bảo quản rong khô 19 1.2.5 Một số quy trình cơng nghệ sản xuất chất từ rong Nâu 20 1.3 Tổng quan hợp chất phlorotannin (polyphenol) .24 1.3.1 Đặc điểm: 24 1.3.2 Cơ chế oxy hóa polyphenol 26 1.3.3 Hoạt tính sinh học phlorotannin 26 1.3.4 Ứng dụng 27 1.4 Giới thiệu q trình trích ly 28 1.4.1 Bản chất .28 1.4.2 Phạm vi sử dụng trình 28 1.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết 29 1.4.4 Tổng quan dung môi chiết 30 1.4.5 Tìm hiểu số loại dung mơi chiết đề tài .32 1.4.6 Phương pháp chiết xuất .34 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 36 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.2.1 Các phương pháp phân tích hóa học vật lý .36 2.2.2 Phương pháp cảm quan .36 2.3 HỐ CHẤT VÀ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM 36 2.4 QUY TRÌNH DỰ KIẾN 37 2.5 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 40 2.5.1 Xác định ảnh hưởng dung môi đến khả chiết 40 2.5.2 Xác định ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (NL/DM) 41 2.5.3 Xác định ảnh hưởng nhiệt độ đến khả chiết 43 2.5.4 Xác định ảnh hưởng thời gian đến khả chiết 44 2.5.5 Thí nghiệm xác định nhiệt độ đặc 45 2.5.6 Thí nghiệm xác định thời gian ly tâm 45 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only iii CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 47 3.1 Kết xác định số thành phần rong nguyên liệu 47 3.2 Kết xác định thông số thích hợp q trình chiết phlorotannin 48 3.2.1 Kết xác định ảnh hưởng dung môi đến khả chiết 48 3.2.2 Kết xác định ảnh hưởng tỷ lệ NL/DM (khối lượng/thể tích) đến khả chiết 50 3.2.3 Kết xác định ảnh hưởng nhiệt độ đến khả chiết .52 3.2.4 Kết xác định ảnh hưởng thời gian đến khả chiết 54 3 Kết xác định thơng số thích hợp q trình đặc 56 3.4 Kết xác định thơng số thích hợp trình ly tâm 58 3.5 Đề xuất quy trình chiết rút phlorotannins từ rong Sargassum cristaefolium - Khánh Hòa 61 3.6 Đánh giá chất lượng hợp chất chiết khơ sau q trình chiết 64 3.7 Sơ tính giá thành bán thành phẩm 65 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 66 Kết luận: 66 Đề xuất ý kiến 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 PHỤ LỤC Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Nguồn lợi rong biển giới, sản lượng thu hoạch tiềm sản xuất (1.000 tấn) Bảng1 2: Diện tích vùng quy hoạch ni trồng rong biển số tỉnh duyên hải Việt Nam Bảng 1.3: Các giống lồi rong Nâu tìm thấy phân bố 10 Bảng1 4: Trữ lượng rong Mơ theo vùng biển tỉnh 12 Bảng 5: Hàm lượng Mannitol số oài rong Nâu vùng biển Khánh Hòa- Việt Nam (% so với trọng lượng khô tuyệt đối) 14 Bảng 6: Hàm lượng Alginic trung bình số lồi rong Nâu (% so với rong khô tuyệt đối) 15 Bảng 7: Hàm lượng acid amin số loại rong Nâu (mg%) 17 Bảng 1.8: Thành phần sinh hóa học số loại rong Nâu vùng biển vùng biển Jeddah, Saudi Arabia (mg % rong khô) 19 Bảng 3.8 Phân tích thành phần chất chiết khơ 64 Bảng 3.9 Sơ tính chi phí giá thành bán thành phẩm (1 kg chiết khô)…………….64 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only v DANH MỤC HÌNH Hình 1: Sơ đồ quy trình chiết rút Mannitol phương pháp hòa tan Alcol 21 Hình 2: Sơ đồ quy trình tổng quát chiết rút Iod từ rong Nâu 22 ( Được nghiên cứu Trần Thị Luyến, Ngô Lê Minh Thảo năm 2001 ) 22 Hình 3: Sơ đồ quy trình chiết rút Iod từ rong Nâu vùng biển Nha Trang để phối chế sản xuất nước mắm 23 Hình 4: Cấu trúc hóa học phlorotannin chiết từ rong Ecklonia cava 25 Hình 5: Sơ đồ quy trình dự kiến chiết phlorotannin từ rong 37 Sargassum cristaefolium - Khánh Hòa 37 Hình Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng dung môi đến khả chiết 40 Cách tiến hành thí nghiệm .40 Hình 8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng nhiệt độ đến khả chiết 43 Hình 9: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng thời gian đến khả chiết 44 Hình 10: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ cô đặc 45 Hình 11: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian ly tâm 46 Hình 3.1a: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng dung môi đến khối lượng chất chiết khơ q trình chiết 48 Hình 3.1b: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng dung môi đến hàm lượng phlorotannin trình chiết 49 Hình 3.2a: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng tỷ lệ NL/DM đến khối lượng chất chiết khô trình chiết .51 Hình 3.2b: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng tỷ lệ NL/DM đến hàm lượng phlorotannin trình chiết .51 Hình 3.3a: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến khối lượng chất chiết khơ q trình chiết 53 Hình 3.3b: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng phlorotannin trình chiết 53 Hình 3.4a: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng thời gian đến khối lượng chất chiết khơ q trình chiết 55 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only vi Hình 3.4b: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng thời gian đến hàm lượng phlorotannin trình chiết 55 Hình 3.5: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng phlorotannin q trình đặc 57 Hình 3.6: Sơ đồ quy trình chiết rút phlorotannins từ rong Sargassum cristaefolium - Khánh Hịa 61 Hình 3.7: Hình ảnh chất chiết khơ có ngun liệu sau đơng khơ 64 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only vii DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT NL : Nguyên liệu DM : Dung môi chiết NL/DM : Nguyên liệu/Dung môi chiết P’ : Phút Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only LỜI NÓI ĐẦU Hệ sinh thái biển nước ta phong phú, có nhiều lồi có giá trị kinh tế cao Bên cạnh nguồn hải sản dồi nguồn rong biển khơng phần đa dạng Ngành rong biển có nhiều lồi, lồi có nhiều tính ưu việt nhiều nhà nghiên cứu nước ta quan tâm tới ngành rong Nâu mà điển hình rong Mơ Gần đây, ngành nuôi trồng chế biến rong biển lên ngành công nghiệp mang lại số thành tựu định Nhiều cơng trình nghiên cứu giá trị dinh dưỡng dược học từ rong biển công bố ứng dụng rộng rãi toàn cầu Người ta phát nhiều thành phần quý có rong biển như: Iod, alginate, fucoidin, hợp chất chống oxy hóa (polyphenol, phlorotannin ), acid béo…rất có giá trị y học, thực phẩm, mỹ phẩm… giúp cho quốc gia giải vấn đề nhập dược liệu Xuất phát từ nhu cầu xã hội đại, đồng thời tận dụng nguồn nguyên liệu dồi dào, nhà khoa học nước ta tăng cường nghiên cứu, chuyển nguồn rong biển phế thải từ rong biển thành sản phẩm có giá trị, cách sản xuất loại thực phẩm khác nhau, tách chiết thành phần khác có hoạt tính sinh học hỗn hợp thành phần có hoạt tính sinh học để gia tăng giá trị rong biển Việt Nam Để góp phần vào xu đó, tơi thực đề tài tốt nghiệp “Nghiên cứu quy trình chiết Phlorotannin từ rong Sargassum cristaefolium - Khánh Hòa” Đề tài gồm nội dung: - Xác định số thành phần hóa học chủ yếu nguyên liệu chất chiết khô - Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến trình chiết phlorotannin - Nghiên cứu xác định nhiệt độ cô đặc thích hợp - Nghiên cứu xác định thời gian ly tâm thích hợp Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only - Đề xuất quy trình chiết phlorotannin từ rong Sargassum cristaefolium – Khánh Hịa tính giá thành bán thành phẩm Bước đầu tiếp cận với nghiên cứu khoa học, điều kiện kiến thức hạn chế, điều kiện sở vật chất, kinh phí nghiên cứu cịn thiếu thốn, ngồi việc nỗ lực thân, giúp đỡ người hưỡng dẫn anh chị phụ trách phịng thí nghiệm Viện Nghiên cứu ứng dụng công nghệ Nha Trang, tơi hồn thành đề tài giao Tuy nhiên khơng tránh nhữnh khỏi sai sót, mong quan tâm góp ý kiến độc giả Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan rong biển 1.1.1 Đặc điểm chung rong biển Rong biển hay tảo biển thực vật thủy sinh, chúng đơn bào, đa bào sống thành quần thể, có kích thước hiển vi có dài hàng chục mét Hình dạng chúng hình cầu, hình sợi, hình phiến hay hình thù đặc biệt Sản lượng hàng năm đại dương cung cấp cho Trái đất khoảng 200 tỷ rong Nhiều nhà khoa học cho 90% cacbon tổng hợp hàng năm nhờ quang hợp môi trường lỏng, có 20% rong biển tổng hợp nên 1.1.2 Sự phân bố nguồn lợi rong biển Rong biển thường phân bố vùng nước mặn, nước lợ, cửa sông, vùng triều sâu vùng biển cạn * Nguồn lợi rong biển giới Nguồn lợi rong biển giới lớn, song sản lượng rong khai thác sử dụng hàng năm không (Theo tài liệu FAO sản lượng rong biển hàng năm giới) Châu Á khu vực cung cấp rong Đỏ Trong đó, Philippines kể từ năm 1970 sau áp dụng thành công phương pháp phát triển rong Eucheuma bào tử chuyển lên hàng đầu giới rong biển nguyên liệu, 85% lượng nguyên liệu sản xuất Carrageenan Furcellaran hàng năm Philippines cung cấp Nam Triều Tiên nước cung cấp nguyên liệu sản xuất agar với khối lượng lớn giới, chiếm 52% Theo thống kê gần (FAO, 1997) sản lượng thu hoạch rong biển kinh tế giới đạt triệu tươi/năm, theo CEVA (AlgoRythme, 2000) triệu [1] Nguồn lợi rong Nâu chủ yếu tập trung nước Châu Âu Bắc Mỹ Canada tập trung 75% khối lượng rong nguyên liệu sản xuất Alginate, khối lượng rong Nâu Châu Á khoảng 5% Theo FAO ước tính năm giới rong Nâu khai thác khoảng 1,3 triệu tấn, sản lượng có thê tăng lên 12 lần tiếp tục khai thác dọc bờ Đại Tây Dương kể biển Đen Địa Trung Hải [1] Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only 67 - Cần nghiên cứu thêm phương pháp thu hái, bảo quản rong tươi nguyên liệu để hạn chế tổn thất thành phần quý rong, đồng thời đảm bảo nguyên liệu chiết thời gian trái vụ - Tiếp tục nghiên cứu quy trình, đặc biệt công đoạn chiết (Như nghiên cứu chiết phlorotannin vùng biển có điều kiện sống rong khác nhau, thực chiết mơi trường có pH khác nhau, dung mơi khác, …) Vì vấn đề nghiên cứu nước - Nghiên cứu quy trình chiết phlorotannin từ đối tượng rong khác - Cần nghiên cứu khả ứng dụng rộng rãi chế phẩm vào lĩnh vực như: thực phẩm, dược phẩm, y học, mỹ phẩm… Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Ngô Đăng Nghĩa (2004), Chế biển rong biển, NXB Nơng nghiệp TP Hồ Chí Minh Nguyễn Hữu Đại (1997), Rong Mơ Việt Nam nguồn lợi sử dụng, NXB Nơng nghiệp TP Hồ Chí Minh Đỗ Minh Phụng, Đặng Văn Hợp (1997), Phân tích kiểm nghiệm sản phẩm thủy sản, Trường Đại học Thủy Sản Nha Trang Khoa hóa thực phẩm cơng nghệ sinh học, Các q trình cơng nghệ sản xuất thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Nguyễn Hải Hà (2004), Nghiên cứu trích ly polyphenol từ trà Camellia sinensis (L), Luận văn Thạc sỹ, Đại học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh Đặng Xuân Cường (2009), Nghiên cứu thu nhận dịch chiết có hoạt tính kháng khuẩn từ rong Nâu Dictyota Dichotoma Việt Nam, Luận văn Thạc sỹ, Đại học Nha Trang Một số đồ án tốt nghiệp anh chị khóa trước Riitta Koivikko (2008), Brown algal phlorotannins improving and applying chemical methods, Annales Universitatis Turkuensis Ragan M A., and Glombitza K W 1986, Phlorotannins, Brown algal polyphenols, Prog Phycol Res, 4: 129-241 10.Yong Li, Zhong-Ji Qian, BoMi Ryu, Sang-Hoon Lee, Moon-Moo Kim, SeKwon Kim, Chemical components and its antioxidant properties in vitro: An edible marine brown alga, Ecklonia cava, Bioorg Med Chem (2009), doi:10.1016/j.bmc.2009.01.031 11 Mayalen Zubia, Daniel Robledo, Yolanda Freile-Pelegrin, Antioxidant activities in tropical marine macroalgae from the Yucatan Peninsula, Mexico, J Appl Phycol (2007) 19:449–458 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only 69 12 Koki Nagayama, Yoshitoshi Iwamura, Toshiyuki Shibata, Izumi Hirayama1 and Takashi Nakamura, Bactericidal activity of phlorotannins from the brown alga Ecklonia kurome, Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2002) 50, 889–893 ] công bố năm 2002 13 TL: Sang-Hoon Lee, Li-Yong, Fatih Karadeniz, Moon-Moo Kim, Se-Kwon Kim, Alpha-glucosidase and alpha-amylase inhibitory activities of phlorotannin derivatives from Ecklonia cava, Journal of Biotechnology 136S (2008) S577–S588 14 Moon-Moo Kim, Quang Van Ta, Eresha Mendis , Niranjan Rajapakse , Won-Kyo Jung ,Hee-Guk Byun, You-Jin Jeon , Se-Kwon Kim, Phlorotannins in Ecklonia cava extract inhibit matrix metalloproteinase activity, Life Sciences 79 (2006) 1436–1443 15 Murat Artan, Yong Li, Fatih Karadeniz, Sang-Hoon Lee, Moon-Moo Kim, Se-Kwon Kim, Anti-HIV-1 activity of phloroglucinol derivative, 6,6’-bieckol, from Ecklonia cava, Bioorganic & Medicinal Chemistry 16 (2008) 7921–7926 16 Quang-To Le, Yong Li, Zhong-Ji Qian, Moon-Moo Kim, Se-Kwon Kim, Inhibitory effects of polyphenols isolated from marine alga Ecklonia cava on histamine release, Process Biochemistry 44 (2009) 168–176 17 Nelson T.E., Lewis B.A Separation and characterization of the soluble and insoluble components of insoluble laminaran // Carbohydr Res - 1974 - Vol 33 P 63-74 ) 18 Maria E.R Duarte,a Marc A Cardoso,a Miguel D Noseda,a,1 Alberto S Cerezo (2001), “Structural studies on fucoidans from the brown seaweed Sargassum stenophyllum”, Carbohydrate Research 333, pp 281–293 19 Google.com Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only 70 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Xác định hàm lượng ẩm phương pháp sấy [3] a) Nguyên lý: Dùng nhiệt độ cao để làm bay mẫu thử, sau dựa vào hiệu số khối lượng mẫu thử trước sau sấy khơ từ tính hàm lượng nước thực phẩm (%) b) Dụng cụ hóa chất: - Tủ sấy điều chỉnh nhiệt độ - Cân phân tích, độ xác 10-4g - Cốc sấy thủy tinh - Đũa thủy tinh - Bình hút ẩm c) Tiến hành: Sấy cốc đến khối lượng không đổi: Cốc rửa sạch, úp khô, sấy nhiệt độ 100 ÷ 1050C khoảng giờ, sau lấy làm nguội bình hút ẩm mang cân sấy tiếp nhiệt độ trên, làm nguội bình hút ẩm cân đến hai lần liên tiếp sai khác khối lượng không 5.10-4g (sấy đến khối lượng khơng đổi) Cân xác lượng rong cắt nhỏ (khoảng 10g) vào cốc sấy khô đến khối lượng không đổi Dùng đũa thủy tinh đánh tơi mẫu dàn mẫu đáy cốc Chuyển cốc vào tủ sấy, sấy 60 ÷ 800C Sau nâng nhiệt độ lên 100 ÷ 1050C, sấy liên tục Chú ý, trình sấy sau đảo mẫu lần Lấy mẫu để nguội bình hút ẩm, sau mang cân cân phân tích sấy tiếp nhiệt độ 100 ÷ 1050C đến khối lượng khơng đổi d) Tính kết quả: Độ ẩm rong tính theo cơng thức: X  G1  G *100(%) G1  G Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only 71 Trong đó: X: Độ ẩm (hàm lượng nước) rong (%) G1: Khối lượng cốc sấy mẫu thử trước sấy (g) G2: Khối lượng cốc sấy mẫu thử sau sấy (g) G: khối lượng cốc sấy (g) Phụ lục 2: Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Kjeldadl Từ hàm lượng nitơ định lượng theo phương pháp Kjeldadl, nhân với hệ số 6,25 tính hàm lượng protein mẫu rong * Phương pháp Kjeldadl [3]: a) Nguyên lý: Để xác định đạm tổng quát thực phẩm người ta dùng H2SO4 đậm đặc chất xúc tác đặc biệt hỗn hợp CuSO4 K2SO4 theo tỷ lệ 1/10 để vơ hóa; mục đích để chuyển tồn nitơ thực phẩm dạng muối (NH4)2SO4 Sau dùng NaOH đặc để đẩy NH3 dùng nước lôi NH3 khỏi thiết bị chưng cất vào cốc hứng chứa H2SO4 1,1N dư, cuối dùng NaOH 0,1N chuẩn độ lại H2SO4 dư b) Cách tiến hành: - Lấy xác g mẫu rong cắt nhỏ cho vào bình Kjeldadl.Thêm g hỗn hợp chất xúc tác CuSO4 K2SO4 20 ml H2SO4 đậm đặc để nghiêng bếp điện đun từ từ Trong q trình vơ hóa màu sắc mẫu chuyển từ màu nâu đen sang màu vàng xanh không màu Chú ý: + Trong q trình vơ cơ, mẫu chưa đạt đến màu xanh mà dung dịch bị cạn lấy bình để nguội thêm vào 5ml dung dịch H2SO4 đậm dặc tiếp tục vơ + Khi vơ hóa mẫu, tránh tượng mẫu sơi q mạnh bị bắn ngồi gây sai số, phải vơ triệt để hồn tồn - Rửa thiết bị chưng cất: Tiến hành sục rửa thiết bị chưng cất kiểm tra khớp nối phải đảm bảo kín Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only 72 - Chuẩn bị cốc hứng: Lấy cốc thủy tinh 250 ml cho vào cốc hứng 25 ml dung dịch H2SO4 0,1N vài giọt methyl đỏ 0,1% Đặt cốc hứng ngập đầu ống sinh hàn thiết bị chưng cất - Chưng cất chuẩn độ: cho mẫu vơ hóa vào bình chưng cất thiết bị, tráng bình Kjeldadl vài lần nước cất để lấy hết mẫu thử vơ hóa, dịch tráng chuyển vào bình chưng cất Thêm vài giọt phenolphthalein 1% cho từ từ dung dịch NaOH 40% có màu đỏ (hoặc tím đỏ), tráng phễu nước cất, đậy kín khớp nối tiến hành chưng cất lôi NH3 nước hết NH3 bình chưng cất (thử giấy đo pH) Định lượng trực tiếp NH3 bay H2SO4 0,1N dư cốc hứng, sau dùng NaOH 0,1N chuẩn độ lại lượng H2SO4 0,1N dư cốc hứng đến dung dịch chuyển từ màu đỏ sang màu vàng nhạt c) Tính kết quả: Hàm lượng đạm tồn phần tính theo cơng thức sau: Ntp  0,0014 * ( A  B ) *100 (%) P Trong đó: A: số ml H2SO4 0,1N dùng cốc hứng B: số ml NaOH 0,1N dùng chuẩn độ P: khối lượng mẫu thử (mẫu rắn) (g) 0,0014: số gam nitơ tương ứng với 1ml H2SO4 0,1N Hàm lượng protein rong tính theo cơng thức sau: Xp = Ntp*6,25 (%) Phụ lục 3: Xác định hàm lượng lipid tổng theo phương pháp Bligh Dyer hỗn hợp chloroform/methanol a) Nguyên lý: Giải phóng lipid từ hợp chất với protein glucid nhờ thủy phân chloroform (CHCl3) mơi trường có cồn (CH3OH) b) Dụng cụ hóa chất: Sử dụng dụng cụ, hóa chất thơng thường phịng thí nghiêm Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only 73 c) Tiến hành: Cân 50-100 gam mẫu rong hay bã rong nghiền nhỏ máy xay, đem ngâm chiết CHCl3:CH3OH tỷ lệ 1: (100ml CHCl3 : 200ml CH3OH) siêu âm (chiết lần) Bổ sung 100ml CHCl3 , sau thêm 100ml nước vào lắc Phân lớp lấy phần dung dịch phía dưới, rửa lại nước hai lần, sau đem làm khan Na2SO4 Dịch chiết thu đem cô cất loại dung môi máy quay cất chân không 40O C áp suất 25 tor Hàm lượng dầu béo thu sau cân cân phân tích Sortorius analytic (10-4) tính tốn theo phần trăm khối lượng so với mẫu ban đầu d) Tính kết quả: Hàm lượng lipid (%) tính theo cơng thức sau: A p *100 (%) G Trong đó: A: Hàm lượng lipid mẫu thử (%) P: khối lượng lipid đem cân (g) G: khối lượng mẫu thử (g) Phụ lục Xác định hàm lượng Iod theo phương pháp chuẩn độ [3] a) Nguyên lý: Iodua ( I- ) oxy hóa nước Brom bão hòa thành Iodat ( IO3- ), Iodat kết hợp ( I- ) mơi trường acid giải phóng I2 tự Chuẩn độ Na2S2O3 với thị hồ tinh bột Từ tính lượng Iod thực phẩm * Các phản ứng chính: KI + Br2 + H2O = KIO3 + HBr KIO3 + KI + H3PO4 = I2 + 2K3PO4 + H2O I2 + Na2S2O3 = NaI + Na2S4O6 b) Tiến hành: Cân 20g mẫu cho vào cốc nung.Trộn với 10g bột MgO để khống chế nhiệt độ tránh Iod thăng hoa Nung 2h nhiệt độ tối đa 350 0C Hòa tan Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only 74 tro nước cất ( 10 – 15 ml ) lọc giấy lọc không tàn, lấy dung dịch Phần tro lại giấy lọc nung lại nhiệt độ 450 – 500 0C Sau hịa tan nước cất, lọc giấy lọc không tàn Nếu cặn cịn đen tiếp tục nung lại lần thành tro trắng ( phải nung nhiều lần để tránh Iod thăng hoa ) Dịch lọc dồn chung vào bình định mức 50 ml, thêm nước cho đủ mức dung dịch thử Cho vào bình tam giác có nút mài kín: Dung dịch thử: 10 ml Dung dịch H2C2O4 10% (acid oxalic ): giọt Nước Brom bão hịa: 3ml Đun cách thủy bình tam giác khoảng 10 phút để đuổi Brom dư Để nguội làm lạnh đến 10 0C Cho thêm vào bình tam giác: H3PO4 đ ( d = 1,3 ): ml KI tinh thể: g Đậy nắp, lắc đều, để yên bóng tối 15 phút ( để phản ứng hồn tồn).Sau mở nắp thêm ml hồ tinh bột % dung dịch có màu xanh tím Chuẩn độ Na2S2O3 0,01N tới màu xanh tím Đọc thể tích Na2S2O3 0,01N dùng hết.Từ tính hàm lượng Iod theo công thức: XI = N 0,21.F 100 ( mg % ) P Trong đó: X1: Hàm lượng Iod mẫu phân tích (%) N: Số ml Na2S2O3 0,01N dùng để chuẩn độ ( ml ) 1,27: Số mg I2 tương đương 1ml Na2S2O3 0,01N F: Hệ số pha lỗng P: Khối lượng mẫu phân tích (g ) * Để xác định hàm lượng Iod dịch chiết tiến hành từ khâu cho vào bình tam giác Phụ lục Xác định tro toàn phần [3] a) Nguyên lý Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only 75 Dùng sức nóng (550-6000C) nung cháy hoàn toàn chất hữu Phần cịn lại đem cân tính hàm lượng tro tồn phần mẫu phân tích a) Dụng cụ, vật liệu thuốc thử - Chén nung sứ - Đèn cồn hay bếp điện - Lò nung điều chỉnh nhiệt độ (đến 550- 6000C) - Cân phân tích - Bình hút ẩm, phía để chất hút ẩm - H2O2 10 thể tích HNO3 đậm đặc c) Tiến hành Nung chén sứ rửa lò nung tới đến 550- 6000C đến trọng lượng không đổi Để nguội bình hút ẩm cân phân tích xác đến 10-4g Cho vào chén khoảng 5g chất thử Cân tất cân phân tích với độ xác Cho tất vào lị nung tăng nhiệt độ từ từ 550- 6000C Nung cho trắng, nghĩa loại hết chất hữu thông thường khoảng 6- Trường hợp tro đen, lấy để nguội, cho thêm vài giọt H2O2 10 thể tích HNO3 đậm đặc nung lại tro trắng Để nguội bình hút ẩm, cân cân có độ xác Tiếp tục nung thêm nhiệt độ 30 phút để nguội bình hút ẩm cân, lặp lặp lại thao tác trọng lượng không đổi Kết hai lần nung cân liên tiếp không cách 0,0005 gam d) Tính kết Hàm lượng tro theo phần trăm (X1) tính băng cơng thức X1  G2  G * 100(%) G1  G Trong đó: -X1: Hàm lượng tro mẫu phân tích (%) - G1: Khối lượng chén nung mẫu (g) - G: Khối lượng chén nung (g) - G2: Khối lượng chén nung tro trắng (g) Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only 76 Chú ý: Khi chén nung cịn nóng để vào bình hút ẩm, nhớ để nắp mở lúc đầu mở vịi khơng khí nắp bình hút ẩm tránh khơng khí nóng nở đẩy bật làm vỡ nắp bình Phụ lục Xác định hàm lượng xơ thơ theo Crudefibre định lượngcarbohydrate Để xác định xơ thô, việc đánh giá xử lý dựa rong nhiên liệu loại ẩm chất béo với axit loãng 1,25%, sau với kiềm 1,25% Như vậy, 2g rong nguyên liệu loại ẩm chất béo xử lý với 200ml dung dịch H2SO4 1,25% Sau lọc rửa, bã xử lý với dung dịch NaOH 1,25% Bã lọc, rửa với nước nóng sau với HNO3 1% rửa lại với nước nóng Bã sấy khô 1300C ± 20C, để nguội bình hút ẩm cân (W2) Nung 30 phút 600oC ± 15oC, để nguội bình hút ẩm cân (W3) CrudeFiger  W *100(%) Trong đó: W1 - lượng mẫu thử * Xác định hàm lượngcarbohydrate % Carbohydrate = 100 - (ẩm + protein + chất béo + tro + xơ) Phụ lục Xác định hàm lượng Fucoidan Lượng sinh khối rong nghiền mịn (100 g) xử lý nhiệt độ phòng với hỗn hợp MeOH-CHCl3-H2O = 4:2:1 để loại bỏ chất màu, lọc sấy khô chân không cho lượng sinh khối rong khử chất béo Nguyên liệu dung dịch CaCl2 2% (5x250ml) khuấy trộn học 850C Đưa 80ml dung dịch hexadecyl trimethylammonium bromide nồng độ 10% nước vào dung dịch chiết gom chung lại Tủa tạo thành li tâm, rửa với nước khuấy với dung dịch NaI nồng độ 20% cồn (5*150ml) vòng 2-3 ngày nhiệt độ phòng, rửa với cồn hòa tan nước Dung dịch thẩm tách đông khô nhanh để thu fucoidan thô (F) dạng muối Na+ cân cân phân tích Sortorius analytic (10-4) tính tốn theo phần trăm khối lượng so với mẫu ban đầu Phụ lục Xác định hàm lượng alginate Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only 77 Cân khoảng 10g rong khô, ngâm rong 500 ml formaldehit 1%, khuấy nhẹ 12 Sau rửa rong nước cất Tiếp tục ngâm rong H2SO4 0,2N lại rửa nước cất Chiết alginate Na2CO3 1% 12 giờ, có khuấy nhẹ Lọc thu dịch lọc Tủa cồn 95o theo tỉ lệ dịch chiết:cồn 1: 2, lọc thu tủa, rửa tủa acetone, sấy khô 40oC Cân sản phẩm tính thành phần phần trăm Hàm lượng alginate (%) tính theo cơng thức A p *100 (%) G Trong đó: A: Hàm lượng alginate (%) P: khối lượng alginate đem cân (g) G: khối lượng mẫu thử (g) Phụ lục Xác định hàm lượng phlorotannin dịch chiết Hàm lượng phlorotannin dịch chiết xác định phương pháp so màu, dùng thuốc thử Folin – Ciocalteu bước sóng 750 nm a) Nguyên lý: Oxy hóa tồn lượng phlorotannin dịch chiết dung dịch Folin – Ciocalteu (hỗn hợp acid phosphotungstic acid phosphomolyblic) Các acid bị khử thành Vonfram (W8O23) oxyt molipden (Mo8O23) có màu xanh Màu xanh hấp thụ nhiều bước sóng 750 nm b) Dụng cụ, hóa chất: Dụng cụ: - Máy quang phổ UV – Vis - Piper 0,5, 1, 2, 5, 10 ml - Bình định mức 100 ml Hóa chất: - Dung dịch phloroglucin 0,1% (C6H6O3 0,1%) làm chuẩn - Dung dịch thuốc thử Folin – Ciocalteu (sản phẩm thương mại) - Na2CO3 10% c) Tiến hành: Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only 78 - Chuẩn bị mẫu: Cân 0,05 gam mẫu đơng khơ, nghiền nhỏ pha lỗng 10 lần với nước cất Lắc mạnh để hòa tan chất dung dịch (dung dịch mẫu1) - Từ dung dịch mẫu tiến hành pha loãng 10 lần tiếp (1ml dd 1+ 9ml nước cất) (dd mẫu 2) - Chuẩn bị mẫu thử vào ống nghiệm sạch: Om: 1ml dd mẫu + 2ml Folin – Ciocalteu (sau 3p’) +4ml Na2CO3 - Pha loãng 10 lần dd chuẩn C6H6O3 0,1% (dd chuẩn 1) - Chuẩn bị mẫu chuẩn: Lấy ống thủy tinh sau cho vào ống: C1: 0ml dd chuẩn1+1ml nước cất +2ml Folin – Ciocalteu (sau 3p’)+4ml Na2CO3 C2:0,2ml dd chuẩn1+0,8ml nước cất+2ml Folin-Ciocalteu (sau 3p’)+4ml Na2CO3 C3:0,4ml dd chuẩn1+0,6 ml nước cất+2ml Folin-Ciocalteu (sau 3p’)+4ml Na2CO3 C4:0,6ml dd chuẩn1+0,4ml nước cất+2ml Folin-Ciocalteu (sau 3p’)+4ml Na2CO3 C5: 1ml dd chuẩn1 + 0ml nước cất+2ml Folin-Ciocalteu (sau 3p’)+4ml Na2CO3 - Sau chuẩn bị mẫu chuẩn, đặt ống nghiệm bong tối khoảng 60 ÷ 90phút - Sau khoảng thời gian quan sát ta thấy màu xanh đen xuất tiến hành so màu máy quang phổ UV – Vis bước sóng 750 nm, ghi độ hấp thụ tính tốn xác định lượng phlorotannin có mẫu thử Phụ lục 10 Bảng 3.2 Kết xác định ảnh hưởng dung môi đến khả chiết (cô đặc 500C, thời gian ly tâm 15 phút) Khối Hàm lượng Nhiệt phlorotannin gian chiết khô (% chất chiết Cảm chiết chiết (g)/100 g khô) quan (0C) NL/DM lượng chất độ Dung môi Thời (giờ) rong 50 20 25,9 Màu Nước 1/20 18,57 vàng nhạt Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only 79 Màu vàng Ethanol 1/20 50 20 8,2 2,23 99,5% đậm, có vángds Acetone/nước Màu 1/20 (7/3) 50 20 23,78 27,01 vàng ánh xanh Phụ lục 11 Bảng 3.3 Kết xác định ảnh hưởng tỷ lệ NL/DM (khối lượng/thể tích) đến khả chiết (cơ đặc 500C, thời gian ly tâm 15 phút) Khối lượng Hàm lượng Nhiệt độ chất chiết phlorotannin Tỷ lệ Dung môi Thời gian chiết chiết khô (% chất chiết NL/DM (0C) (giờ) (g)/100g khô) rong Acetone/nước (7/3) 1/10 50 20 18,9 20,36 1/15 50 20 23,6 26,68 1/20 50 20 23,8 26,97 1/25 50 20 23,9 26,97 1/30 50 20 23,9 26,97 Acetone/nước (7/3) Acetone/nước (7/3) Acetone/nước (7/3) Acetone/nước (7/3) Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only 80 Phụ lục 12 Bảng 3.4 Kết xác định ảnh hưởng nhiệt độ đến khả chiết (cô đặc 500C, thời gian ly tâm 15 phút) Thời Khối lượng Hàm lượng tỷ lệ Acetone/nước gian chất chiết phlorotannin NL/DM chiết chiết khô (g)/100g (% chất chiết (0C) Dung mơi Nhiệt độ (giờ) rong khơ) 1/15÷1/20 20 20 16,8 13,40 1/15÷1/20 30 20 19,9 17,74 1/15÷1/20 40 20 21,6 24,67 1/15÷1/20 50 20 23,8 26,89 1/15÷1/20 60 20 24,0 27,00 1/15÷1/20 70 20 24,1 27,00 (7/3) Acetone/nước (7/3) Acetone/nước (7/3) Acetone/nước (7/3) Acetone/nước (7/3) Acetone/nước (7/3) Phụ lục 13 Bảng 3.5 Kết xác định ảnh hưởng thời gian đến khả chiết (cô đặc 500C, thời gian ly tâm 15 phút) Nhiệt Thời Khối lượng Hàm lượng Tỷ lệ độ chiết gian chất chiết khô phlorotannins NL/DM Dung môi (0C) (g)/100g rong (% chất chiết chiết (giờ) Acetone/nước 1/15÷1/20 (7/3) 50÷ 60 khơ) 5,9 18,57 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only 81 Acetone/nước 1/15÷1/20 50÷ 60 14,9 22,81 50÷ 60 10 20,8 23,08 50÷ 60 15 23,7 26,57 50÷ 60 20 24,2 26,99 50÷ 60 25 23,8 26,99 (7/3) Acetone/nước 1/15÷1/20 (7/3) Acetone/nước 1/15÷1/20 (7/3) Acetone/nước 1/15÷1/20 (7/3) Acetone/nước 1/15÷1/20 (7/3) Phụ lục 14 Bảng 3.6 Kết xác định nhiệt độ cô đặc mẫu (chiết dung mơi: acetone/nước (7/3), tỷ lệ NL/DM: 1/15 ÷ 1/20, nhiệt độ chiết 50 ÷ 600C, thời gian chiết 15 ÷ 20 giờ) Nhiệt độ (0C) 50 60 70 Thể tích dịch trước (ml) 100 100 100 10 ÷ 15 10 ÷15 10 ÷ 15 35 30 20 26,95 26,34 25,62 Cảm quan dịch chiết sau Vàng có Vàng đậm Vàng (màu sắc) ánh xanh có ánh xanh đen Thể tích dịch sau cô (ml) Thời gian cô (phút) Hàm lượng phlorotannin sau cô (%) ... chiết Phlorotannin từ rong Sargassum cristaefolium - Khánh Hòa? ?? Đề tài gồm nội dung: - Xác định số thành phần hóa học chủ yếu nguyên liệu chất chiết khô - Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến trình. .. II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu loài rong Mơ (Sargassum cristaefolium) nuôi trồng vùng biển Nha Trang – Khánh Hòa Rong thu nhận rửa qua nước... For evaluation only - Đề xuất quy trình chiết phlorotannin từ rong Sargassum cristaefolium – Khánh Hịa tính giá thành bán thành phẩm Bước đầu tiếp cận với nghiên cứu khoa học, điều kiện kiến thức