Nghiên cứu quy trình chiết tách ent kauran dipecpenoit có tác dụng chống ung thư và chống viêm từ cây khổ sâm bắc bộ (croton tonkinensis gagnep , euphorbiaceae giai đoạn 2

Số TT Số, thời gian ban hành văn bản Tên văn bản 1 Quyết định Số 1472/QĐ-BKHCN ngày 16/7/2008 Quyết định của Bộ trưởng Bộ Khoa học và Công nghệ về việc phê duyệt các tổ chức và cá n

Đề tài độc lập cấp nhà nước

báo cáo tổng hợp

kết quả khoa học công nghệ đề tài

nghiên cứu quy trình chiết tách

ent-kauran Ditecpenoit có tác dụng

chống ung thư Và chống viêm từ cây

khổ sâm Bắc Bộ (croton tonkinensis

gagnep., euphorbiaceae) - Giai đoạn 2

Mã số: ĐTĐL.2009G/03

Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên,

Đại học Quốc gia Hà Nội

Chủ nhiệm : GS TSKH Phan Tống Sơn

9072

Hà Nội – 6/2011

Đề tài độc lập cấp nhà nước

báo cáo tổng hợp kết quả khoa học công nghệ đề tài

nghiên cứu quy trình chiết tách

ent-kauran Ditecpenoit có tác dụng

chống ung thư Và chống viêm từ cây

Hà Nội, ngày 30 tháng 5 năm 2011

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

Họ và tên: Phan Tống Sơn

Ngày, tháng, năm sinh: 29/7/1936 Nam/ Nữ: nam

Học hàm, học vị: Giáo sư, Tiến sĩ khoa học

Chức danh khoa học: Chức vụ Điện thoại:

Tổ chức: 04 3 8261853 Nhà riêng: 04 3 8351439 Mobile: Fax: E-mail: phantongson@yahoo.com

Tên tổ chức đang công tác: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên,

Đại học Quốc gia Hà Nội

Địa chỉ tổ chức: 334 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội

Địa chỉ nhà riêng: P 108, Nhà D 4, Giảng Võ, Ba Đình, Hà Nội

3 Tổ chức chủ trì đề tài:

Tên tổ chức chủ trì đề tài: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên,

Đại học Quốc gia Hà Nội

Điện thoại: 04 3 8584287 Fax: 04 3 8583061

E-mail: dhkhtnhn@hus.vnu.vn

Website: Địa chỉ: 334 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội

Tên cơ quan chủ quản đề tài: Đại học Quốc gia Hà Nội

Thời gian (Tháng, năm)

Kinh phí (Tr.đ)

Ghi chú

(Số đề nghị quyết toán)

Số

TT

Số, thời gian ban hành

văn bản Tên văn bản

1 Quyết định Số

1472/QĐ-BKHCN ngày 16/7/2008 Quyết định của Bộ trưởng Bộ Khoa học và Công nghệ về việc phê duyệt các tổ chức và cá nhân chủ

trì đề tài, dự án sản xuất thử nghiệm độc lập cấp Nhà nước thực hiện trong kế hoạch năm 2009

2 Quyết định Số

1991/QĐ-BKHCN ngày 12/9/2008 Quyết định của Bộ trưởng Bộ Khoa học và Công nghệ về việc phê duyệt kinh phí đề tài độc lập cấp

Nhà nước thực hiện trong kế hoạch năm 2009

3 Hợp đồng nghiên cứu khoa học

“Nghiên cứu quy trình chiết tách ent-kauran

ditecpenoit có tác dụng chống ung thư và chống

viêm từ cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis

Gagnep., Euphorbiaceae) - Giai đoạn 2”

4 Tổ chức phối hợp thực hiện đề tài, dự án:

Nội dung tham gia chủ yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt được Ghi chú*

1 Trường Đại học

Y Hà Nội

Trường Đại học Y Hà Nội

Nghiên cứu độc tính của viên nang được bào chế từ hoạt chất ent-

kauran ditecpenoit

từ cây khổ sâm

Bắc Bộ (Croton tonkinensis

Gagnep., Euphorbiaceae)

Báo cáo kết quả nghiên cứu độc tính của viên nang được bào chế từ hoạt chất

ent-kauran

ditecpenoit từ cây khổ sâm

Bắc Bộ (Croton tonkinensis

Gagnep., Euphorbiaceae) trên động vật thực nghiệm

2 Viện Kiểm

nghiệm thuốc

Trung ương

Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn và

độ ổn định của hoạt chất và viên nang chứa hoạt

chất ent-kauran

ditecpenoit từ cây

1 Tiêu chuẩn cơ

sở và kết quả nghiên cứu độ

ổn định của hoạt chất và viên nang chứa hoạt

chất ent-kauran

Euphorbiaceae)

2 Chất chuẩn đóng gói đơn liều: 20 lọ (mỗi

lọ chứa 50 mg

hoạt chất

ent- oxokaur-16-en-

7β-hydroxy-15-18-yl axetat (1),

có chứng chỉ của Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương kèm theo)

MEDIPLANTEX

Nghiên cứu quy trình bào chế viên nang từ hoạt chất

ent-kauran

ditecpenoit từ cây khổ sâm Bắc Bộ

(Croton tonkinensis

Gagnep., Euphorbiaceae)

1 Quy trình bào chế viên nang từ

hoạt chất

ent-kauran ditecpenoit từ cây khổ sâm

Bắc Bộ (Croton tonkinensis

Gagnep., Euphorbiaceae)

2 5.000 viên nang (chứa 25

mg hoạt chất

ent-7 15-oxokaur-16- en-18-yl axetat

5 Cá nhân tham gia thực hiện đề tài:

(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10 người kể cá chủ nhiệm)

Phan Tống Sơn Khoa học Tự

nhiên

2 PGS TS

Phan Minh Giang

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Thư ký đề tài Chủ nhiệm Đề tài nhánh Nghiên cứu động thái tích lũy của hoạt chất

ent-kauran ditecpenoit trong cây khổ sâm

Bắc Bộ theo thời gian ở một số vùng nguyên liệu

Trần Bình Duyên

Công ty CP Dược TƯ

MEDIPLANTEX

Chủ nhiệm Đề tài nhánh Nghiên cứu quy trình bào chế viên nang từ

hoạt chất ent-kauran ditecpenoit từ cây khổ

sâm BắcBộ

Nguyễn Trần Thị Giáng Hương

Trường Đại học

Y Hà Nội Nghiên cứu độc tính của viên nang được bào Chủ nhiệm Đề tài nhánh

chế từ hoạt chất ent-kauran ditecpenoit từ

cây khổ sâm Bắc Bộ

5 ThS

Nguyễn Đăng Lâm

Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

Chủ nhiệm Đề tài nhánh Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn và độ ổn định của hoạt chất và viên nang chứa hoạt

chất ent-kauran ditecpenoit từ cây khổ sâm

(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm,

tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng

người tham gia )

Thực tế đạt được

(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên

tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người

Thời gian

(Bắt đầu, kết thúc -tháng…năm)

Số

TT

Các nội dung, công việc

chủ yếu (Các mốc đánh giá chủ yếu) Theo kế

hoạch đạt được Thực tế

Người,

cơ quan thực hiện

1 Nội dung 1:

Nghiên cứu động thái tích

luỹ của hoạt chất ent-kauran

ditecpenoit trong cây khổ

thời điểm trong năm tại năm

vùng đã lâu năm trồng cây

nguyên liệu thực vật khô Áp

dụng các quy trình này vào

11/2010 PGS TS Phan Minh Giang và

cộng sự, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Bộ bằng các phuong pháp

TLC, HPLC và 1H-NMR

- Nghiên cứu động thái tích

luỹ của hoạt chất ent-kauran

ditecpenoit trong cây khổ

sâm Bắc Bộ theo thời gian ở

năm vùng nguyên liệu trên

cơ sở áp dụng các quy trình

xử lý mẫu thực vật và các

điều kiện phân tích chuẩn đã

được nghiên cứu xác định

- Nghiên cứu độ ổn định của

hoạt chất

ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat

(1) trong các mẫu nguyên

liệu lá khô của cây khổ sâm

Bắc Bộ trong các điều kiện

bảo quản mẫu ở nhiệt độ

phòng sau các khoảng thời

gian 3 tháng

2 Nội dung 2:

Hoàn thiện quy trình chiết

tách hoạt chất ent-kauran

ditecpenoit từ cây khổ sâm

Bắc Bộ ở quy mô pilot (100

kg lá khô của cây khổ sâm

Bắc Bộ/mẻ)

- Nghiên cứu bước ngâm

chiết lá cây khổ sâm Băc Bộ

ở quy mô pilot

- Nghiên cứu bước phân bố

hai pha lỏng (nước và dung

môi hữu cơ) ở quy mô pilot

- Nghiên cứu bước phân tách

sản phẩm thô chứa hoạt chất

ở quy mô pilot

- Nghiên cứu bước tinh chế

lượng lớn sản phẩm

- Phân tích xác định chất

lương sản phẩm hoạt chất

ent-kauran ditecpenoit được

sản xuất ở quy mô pilot

01/2009 10/2010

GS TSKH Phan Tống Sơn, PGS TS Phan Minh Giang và cộng sự, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

dựng tiêu chuẩn và độ ổn

định của hoạt chất và viên

nang chứa hoạt chất

4 Nội dung 4:

Nghiên cứu quy trình bào chế

viên nang từ hoạt chất

ent-kauran ditecpenoit từ cây khổ

sâm Bắc Bộ

5/2009 10/2010

10/2010 DSCK II Trần Bình Duyên

Công ty Cổ phần Dược Trung ương MEDIPLANTEX

5 Nội dung 5:

Nghiên cứu độc tính của viên

nang được bào chế từ hoạt

chất ent-kauran ditecpenoit từ

cây khổ sâm Bắc Bộ

8/2009 10/2010

12/2010 PGS TS Nguyễn Trần Thị

Giáng Hương Trường Đại học Y Hà Nội

6 Nội dung 6:

Nghiên cứu xây dựng tiêu

chuẩn và độ ổn định của hoạt

chất và viên nang chứa hoạt

chất ent-kauran ditecpenoit từ

cây khổ sâm Bắc Bộ

8/2009 10/2010

5/2011 (việc nghiên cứu

độ ổn định cần thời gian)

ThS Nguyễn Đăng Lâm Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI

1 Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:

Thực tế đạt được

1 Viên nang được bào chế từ

(1)/viên nang), gọi tên viên

nang thuốc này là viên nang

Crotokinan

Viên nang Crotokinan đạt

viên nang 5.000 viên 5.000 viên 5.000 viên

2 Chất chuẩn đóng gói đơn liều

(chứa 50 mg hoạt chất

Ghi chú

1 Báo cáo kết quả nghiên cứu

động thái tích lũy của hoạt chất

ent-kauran ditecpenoit trong cây

2 Quy trình chiết tách hoạt chất

ent-kauran ditecpenoit từ cây

khổ sâm Bắc Bộ ở quy mô pilot

(100 kg lá khô của cây khổ sâm

Bắc Bộ/mẻ)

01 quy trình 01 quy trình

Thực tế quy mô pilot đã đạt 125 kg

lá khô của cây khổ sâm Bắc Bộ/mẻ

3 Quy trình bào chế viên nang từ

hoạt chất ent-kauran ditecpenoit

từ cây khổ sâm Bắc Bộ 01 quy trình 01 quy trình

Quy trình đáp ứng đầy đủ các yêu cầu chuyên môn của ngành Y tế

4 Báo cáo kết quả nghiên cứu độc

tính của viên nang được bào chế

Y tế

5 Tiêu chuẩn cơ sở và kết quả

nghiên cứu độ ổn định của hoạt

chất và viên nang chứa hoạt chất

ent-kauran ditecpenoit từ cây

khổ sâm Bắc Bộ

tiêu chuẩn

cơ sở của hoạt chất và viên nang, báo cáo nghiên cứu

độ ổn định của hoạt

tiêu chuẩn

cơ sở của hoạt chất và viên nang, báo cáo nghiên cứu

độ ổn định của hoạt

Các báo cáo kết quả nghiên cứu và tiêu chuẩn đáp ứng đầy đủ các yêu cầu chuyên môn của ngành Y tế

Yêu cầu khoa học cần đạt

Số

TT Tên sản phẩm

Theo kế hoạch Thực tế đạt được

Số lượng, nơi công bố

Cấp đào tạo, Chuyên

ngành đào tạo Theo kế

hoạch

Thực tế đạt được

Ghi chú

(Thời gian kết thúc)

1 Thạc sỹ 01 01 Bảo vệ năm 2009 đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp, quyền đối với giống cây trồng:

Ghi chú

(Thời gian kết thúc)

1

Đăng ký nhãn hiệu

Crotokinan cho thuốc được

bào chế từ hoạt chất

ent-kauran ditecpenoit từ cây

khổ sâm Bắc Bộ (Croton

tonkinensis Gagnep.,

Euphorbiaceae)

01 nhãn hiệu thuốc

01 nhãn hiệu thuốc

2 Đánh giá về hiệu quả do đề tài mang lại:

a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:

Cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) là một loài cây đặc

hữu ở Việt Nam và là một cây thuốc quen biết trong nhân dân ta Việc tìm ra các hoạt

chất ent-kauran ditecpenoit có nhiều hoạt tính sinh học có giá trị của cây này mở ra

triển vọng nghiên cứu ứng dụng các hoạt chất này trong một số lĩnh vực điều trị, thí dụ trong chống viêm và trong hỗ trợ điều trị ung thư Mặc dầu hiện nay các lĩnh vực điều trị này đều có nhiều loại thuốc, nhưng việc bổ sung các thuốc mới vào hệ thống thuốc chữa bệnh luôn là một nhu cầu của thực tiễn, vì mỗi loại thuốc có thể có cơ chế tác dụng khác nhau cũng như các đặc điểm khác nhau Các hợp chất thiên nhiên, như các

ent-kauran ditecpenoit từ cây khổ sâm Bắc Bộ thưòng có ưu điểm là độc tính tương

Việc sử dụng được nguồn hoạt chất ent-kauran ditecpenoit được chiết tách từ cây khổ

sâm Bắc Bộ làm thuốc sẽ góp phần nâng cao giá trị của một cây thuốc dân gian của Việt Nam

3 Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài, dự án:

Số

TT Nội dung

Thời gian thực hiện

Ghi chú

(Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ

trì…)

I Báo cáo định kỳ

Lần 1 24/3/2010 Các nội dung của đề tài đã đuợc thực hiện

nghiêm túc và đạt yêu cầu về chất lượng công việc

II Kiểm tra định kỳ 06/4/2010 Các nội dung của đề tài được hoàn thành theo

Hợp đồng III Nghiệm thu cơ sở 28/6/2011

Chủ nhiệm đề tài

(Họ tên, chữ ký)

Thủ trưởng tổ chức chủ trì

(Họ tên, chữ ký và đóng dấu)

1.2 Nhân tố phiên mã NF-κB và các bệnh ung thư và viêm 12

1.3 Ent-kauran ditecpenoit có tác dụng chống ung thư và chống viêm từ

cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) 18

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Thiết kế nghiên cứu và Tổ chức thực hiện 24

2.1.2 Tổ chức thực hiện 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật sử dụng 26 2.2.1 Hóa học 26

2.2.2 Bào chế 28

2.2.4 Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn và độ ổn định của hoạt chất và

Chương 3 NGHIÊN CỨU ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY CỦA HOẠT CHẤT

ENT-KAURAN DITECPENOIT TRONG CÂY KHỔ SÂM BẮC BỘ

3.1 Khảo sát các vùng trồng cây nguyên liệu khổ sâm Bắc Bộ và Thu thập

các mẫu nguyên liệu cây khổ sâm Bắc Bộ cho nghiên cứu 31 3.1.1 Lựa chọn các vùng trồng cây nguyên liệu khổ sâm Bắc Bộ 31 3.1.2 Khảo sát các vùng trồng cây nguyên liệu khổ sâm Bắc Bộ 31 3.1.3 Thu thập các mẫu thực vật 323.2 Nghiên cứu quy trình xử lý các mẫu thực vật 34 3.2.1 Mẫu thực vật 34 3.2.2 Quy trình chung xử lý các mẫu thực vật 34

3.2.4 Kết luận 373.3 Điều chế phần chiết metanol toàn phần của các mẫu thực vật 37 3.3.1 Nguyên liệu thực vật 38 3.3.2 Quy trình chung điều chế các phần chiết metanol toàn phần Chiết

en-18-yl axetat và các hoạt chất ent-kauran ditecpenoit phụ khác từ lá cây

3.4.1 Nguyên liệu thực vật 41

3.4.2 Các quy trình chiết tách và tinh chế các mẫu chuẩn ent-kauran

ditecpenoit từ lá cây khổ sâm Bắc Bộ 41 3.4.3 Kết luận 48

3.5 Phân tích định tính và định lượng

ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat và xác định các hoạt chất ent-kauran ditecpenoit phụ khác

trong các mẫu nguyên liệu cây khổ sâm Bắc Bộ bằng các phương pháp

3.5.1.3 Các ví dụ phân tích TLC định tính các ent-kauran ditecpenoit từ

3.5.1.4 Kết luận 62

3.5.2 Nghiên cứu phân tích định tính và định lượng phần chiết metanol

toàn phần bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 63

3.5.2.3 Khảo sát tính phù hợp của hệ thống sắc ký 64

3.5.2.4 Đánh giá sự phù hợp của phương pháp định lượng 66

3.5.2.5 Phân tích định tính: Xác định các hoạt chất ent-kauran ditecpenoit 71

3.5.2.6 Phân tích HPLC định lượng

ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1), hoạt chất ent-kauran ditecpenoit chính của cây khổ sâm

3.5.2.7 Kết luận 82

3.5.3 Nghiên cứu phân tích định tính các hoạt chất

ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1),

3.5.3.7 Ví dụ phân tích định tính một mẫu phần chiết n-hexan từ lá 95 3.5.3.8 Ví dụ phân tích định tính một mẫu phần chiết diclometan từ lá 98

3.5.3.9 Ví dụ phân tích định tính một mẫu phần chiết n-hexan từ cành con 100 3.5.3.10 Ví dụ phân tích định tính một mẫu phần chiết diclometan từ cành

con 103 3.5.3.11 Kết luận 105

3.6 Nghiên cứu độ ổn định của hoạt chất

ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) trong các mẫu nguyên liệu lá khô của cây khổ sâm Bắc

Bộ trong điều kiện bảo quản mẫu ở nhiệt độ phòng sau các khoảng thời

3.6.4 Đánh giá độ ổn định của hoạt chất

ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) trong mẫu bột nguyên liệu lá khô của cây khổ sâm Bắc

Chương 4 HOÀN THIỆN QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH HOẠT CHẤT

ENT-KAURAN DITECPENOIT TỪ CÂY KHỔ SÂM BẮC BỘ Ở QUY

MÔ PILOT 1104.1 Hoàn thiện quy trình chiết tách lượng lớn ở quy mô 10 - 25 kg bột lá

khô của cây khổ sâm Bắc Bộ/mẻ 111

4.2 Hoàn thiện quy trình chiết tách hoạt chất ent-kauran ditecpenoit từ cây

4.2.1 Chuẩn bị nguyên liệu thực vật 114 4.2.2 Ngâm chiết bằng metanol ở quy mô pilot 114

4.2.4 Nghiên cứu hoàn thiện các quy trình phân tách sắc ký cột lượng lớn

và tinh chế sản phẩm 121 4.2.4.1 Quy trình sắc ký điều chế cột lớn 121 4.2.4.2 Quy trình sắc ký điều chế cột trung bình 126 4.2.5 Phân tích xác định chất lượng sản phẩm 1314.3 Kết luận 131

Chương 5 NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH BÀO CHẾ VIÊN NANG TỪ

HOẠT CHẤT ENT-KAURAN DITECPENOIT TỪ CÂY KHỔ SÂM BẮC

BỘ 1345.1 Các nội dung công việc chủ yếu 135

5.4 Quá trình thực hiện nghiên cứu 136 5.4.1 Nghiên cứu lựa chọn tá dược để phối hợp với dược chất 136 5.4.2 Nghiên cứu công thức bào chế 1375.5 Quy trình sản xuất 138 5.5.1 Chuẩn bị nguyên phụ liệu 138 5.5.2 Cân chia nguyên phụ liệu 139

5.6 Đóng gói sản phẩm 140 5.6.1 Lựa chọn nguyên liệu đóng gói và phương pháp, thiết bị đóng gói 140 5.6.2 Quy trình ép vỉ 1405.7 Dự kiến tiêu chuẩn cơ sở của thành phẩm 141

Chương 6 NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CỦA VIÊN NANG ĐƯỢC BÀO

CHẾ TỪ HOẠT CHẤT ENT-KAURAN DITECPENOIT TỪ CÂY KHỔ

SÂM BẮC BỘ 1446.1 Kết quả thử độc tính cấp 144 6.1.1 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 144 6.1.2 Kết quả nghiên cứu 145 6.1.3 Kết luận 1456.2 Kết quả thử độc tính bán trường diễn 145 6.2.1 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 145 6.2.2 Kết quả nghiên cứu 148 6.2.3 Nhận xét và Kết luận 175

Chương 7 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN VÀ ĐỘ ỔN

ĐỊNH CỦA HOẠT CHẤT VÀ VIÊN NANG CHỨA HOẠT CHẤT

ENT-KAURAN DITECPENOIT TỪ CÂY KHỔ SÂM BẮC BỘ 179

7.1 NGHIÊN CỨU ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA NGUYÊN LIỆU ENT-KAURAN

DITECPENOIT 182 7.1.1 Đề cương nghiên cứu 182 7.1.1.1 Mục đích 182 7.1.1.2 Thiết kế thử nghiệm 182 7.1.1.2.1 Mẫu thử 182

7.1.2.1 Điều kiện lão hóa cấp tốc 183 7.1.2.2 Điều kiện thường 184 7.1.3 Kết luận 1857.2 NGHIÊN CỨU ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA VIÊN NANG CROTOKINAN 188 7.2.1 Đề cương nghiên cứu 188 7.2.1.1 Mục đích 188 7.2.1.2 Thiết kế thử nghiệm 188 7.2.1.2.1 Mẫu thử 188 7.2.1.2.2 Điều kiện bảo quản và khoảng thời gian lấy mẫu 188 7.2.1.2.3 Tiêu chuẩn và phương pháp thử 188 7.2.2 Kết quả thử độ ổn định 189

7.2.2.2 Điều kiện thường 190 7.2.3 Kết luận 1907.3 QUY TRÌNH THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN (PROTOCOL)

Ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl acetat 193

7.3.1 Kiểm tra nguyên liệu 193 7.3.1.1 Mô tả 193

7.3.1.10 Định lượng 195 7.3.1.10.1 Thuốc thử 195

7.3.2.2 Quy cách đóng gói 196 7.3.2.3 Bảo quản 196 7.3.3 Đánh giá thành phẩm 1967.4 CHỨNG CHỈ PHÂN TÍCH CHẤT CHUẨN LÀM VIỆC

Ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl acetat 1977.5 BÁO CÁO XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH TIÊU CHUẨN

7.5.1 Báo cáo xây dựng tiêu chuẩn 198 7.5.1.1 Lựa chọn các chỉ tiêu và yêu cầu chất lượng 198 7.5.1.2 Phương pháp thử 199 7.5.2 Thẩm định tiêu chuẩn 199 7.5.2.1 Yêu cầu thẩm định 199 7.5.2.2 Kết quả thẩm định 199 7.5.2.2.1 Tính đặc hiệu 199 7.5.2.2.2 Tính tuyến tính và khoảng xác định 200 7.5.2.2.3 Độ lặp lại 201 7.5.2.2.4 Độ đúng 202

7.5.3 Kết luận 2047.6 BÁO CÁO XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH TIÊU CHUẨN THÀNH

7.6.1 Báo cáo xây dựng tiêu chuẩn 205 7.6.1.1 Lựa chọn các chỉ tiêu và yêu cầu chất lượng 205

7.6.2 Thẩm định tiêu chuẩn 205 7.6.2.1 Yêu cầu thẩm định 205 7.6.2.2 Kết quả thẩm định 206 7.6.2.2.1 Tính đặc hiệu 206 7.6.2.2.2 Tính tuyến tính và khoảng xác định 207 7.6.2.2.3 Độ lặp lại 207 7.6.2.2.4 Độ đúng 208

LIỆU ENT-KAURAN DITECPENOIT 210 7.7.1 Yêu cầu kỹ thuật 210 7.7.2 Phương pháp thử 211 7.7.2.1 Mô tả 211

7.7.2.2.1 Thuốc thử 211 7.7.2.2.2 Sắc ký lớp mỏng 211

7.8.1.1 Công thức bào chế 214 7.8.1.2 Nguyên liệu 214 7.8.1.3 Yêu cầu kỹ thuật 214 7.8.1.3.1 Tính chất 214

7.8.1.3.3 Độ đồng đều khối lượng 214

7.8.1.3.5 Định lượng 214 7.8.2 Phương pháp thử 214

7.8.2.2.1 Thuốc thử 215

Bảng 3.1 Danh sách các mẫu cây khổ sâm Bắc Bộ cho nghiên cứu 32

Bảng 3.2 Xác định các hoạt chất 1, 2 và 3 trong các mẫu khổ sâm Bắc Bộ 52

Bảng 3.3 Sắc ký đồ TLC chuẩn của phần chiết MeOH từ lá và cành con của

Bảng 3.6 Sắc ký đồ TLC chuẩn của phần chiết diclometan từ lá và cành con

của cây khổ sâm Bắc Bộ 62

Bảng 3.7 Khảo sát độ lặp lại trong ngày của hệ thống 65

Bảng 3.12 Xác định các hoạt chất 1, 2 và 3 trong các mẫu khổ sâm Bắc Bộ

Bảng 3.13 Hàm lượng chất 1 trong các mẫu khổ sâm Bắc Bộ 81 Bảng 3.14 Đánh giá độ ổn định của hoạt chất 1 107

Bảng 4.2 Phân tách sắc ký cột mẫu phần chiết V1 (80 g) 123

Bảng 4.4 Phân tách sắc ký cột mẫu phần chiết R3 (50 g) 128

Bảng 6.2 Ảnh hưởng của Crotokinan đến số lượng hồng cầu trong máu thỏ 149

Bảng 6.3 Ảnh hưởng của Crotokinan đến hàm lượng huyết sắc tổ trong máu

thỏ 149

Bảng 6.4 Ảnh hưởng của Crotokinan đến hematocrit trong máu thỏ 149

Bảng 6.5 Ảnh hưởng của Crotokinan đến thể tích trung bình hồng cầu 150

Bảng 6.6 Ảnh hưởng của Crotokinan đến số lượng bạch cầu trong máu thỏ 150

Bảng 6.7 Ảnh hưởng của Crotokinan đến công thức bạch cầu trong máu thỏ 151

Bảng 6.8 Ảnh hưởng của Crotokinan đến số lượng tiểu cầu trong máu thỏ 151

Bảng 6.9 Ảnh hưởng của Crotokinan đến hoạt độ AST trong máu thỏ 152

Bảng 7.6 Kết quả xác định tính tuyến tính và khoảng xác định 201

Bảng 7.11 Kết quả xác định độ đúng 208

Hình 3.2 Phân tích TLC các phần chiết MeOH và các chất chuẩn 53

Hình 3.3 Phân tích TLC các phần chiết MeOH và các chất chuẩn 54

Hình 3.4 Phân tích TLC các phần chiết MeOH và các chất chuẩn 55

Hình 3.5 Phân tích TLC các phần chiết MeOH-SPE và các chất chuẩn 57

Hình 3.6 Phân tích TLC phần chiết n-hexan và các chất chuẩn 59

Hình 3.7 Phân tích TLC phần chiết CH2Cl2 và các chất chuẩn 60

Hình 3.8 Phân tích TLC phần chiết n-hexan và các chất chuẩn 60

Hình 3.9 Phân tích TLC phần chiết CH2Cl2 và các chất chuẩn 61

Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn khoảng tuyến tính của mẫu chuẩn 1 68

Hình 3.12 Sắc ký đồ HPLC của các mẫu chuẩn 1, 2 và 3 74 Hình 3.13 Phổ HPLC-UV của các mẫu chuẩn 1, 2 và 3 75 Hình 3.14 Sắc ký đồ HPLC phần chiết MeOH một mẫu lácây khổ sâm Bắc Bộ 76 Hình 3.15 Sắc ký đồ HPLC của phần chiết MeOH một mẫu lá khổ sâm Bắc

Bộ (Hình 2.14) đã được thêm chất chuẩn 1 (phương pháp

Hình 3.26 Phổ 1H-NMR (CD3OD) của một mẫu phần chiết MeOH từ lá 93

Hình 3.27 Phổ 1H-NMR (CD3OD) (nâng cường độ tín hiệu) của một mẫu phần

Hình 2.28 Phần dãn rộng trên phổ 1H-NMR của một mẫu phần chiết MeOH từ

Hình 3.31 Phổ H-NMR (CDCl3) của một mẫu phần chiết n-hexan từ lá (phần

Hình 3.32 Phổ 1H-NMR (CDCl3) của một mẫu phần chiết diclometan từ lá 99

Hình 3.33 Phổ 1H-NMR (CDCl3) của một mẫu phần chiết diclometan từ lá

Hình 3.34 Phổ 1H-NMR (CDCl3) của một mẫu phần chiết diclometan từ lá

Hình 3.35 Phổ 1H-NMR (CDCl3) của một mẫu phần chiết n-hexan từ cành con 101

Hình 3.36 Phổ 1H-NMR (CDCl3) của một mẫu phần chiết n-hexan từ cành con

Hình 4.1 Sơ đồ hệ thiết bị ngâm chiết ở quy mô pilot 119

Hình 4.2 Một số thiết bị dùng cho ngâm chiết và phân bố hai pha lỏng ở quy

Ảnh 6.1 Hình thái vi thể gan thỏ lô chứng sau 4 tuần uống thuốc 156

Ảnh 6.2 Hình thái vi thể gan thỏ lô chứng sau 4 tuần uống thuốc 157

Ảnh 6.3 Hình thái vi thể gan thỏ lô chứng sau 4 tuần uống thuốc 157

Ảnh 6.4 Hình thái vi thể gan thỏ lô trị 1 sau 4 tuần uống thuốc 158

Ảnh 6.5 Hình thái vi thể gan thỏ lô trị 1 sau 4 tuần uống thuốc 158

Ảnh 6.6 Hình thái vi thể gan thỏ lô trị 1 sau 4 tuần uống thuốc 159

Ảnh 6.7 Hình thái vi thể gan thỏ lô trị 2 sau 4 tuần uống thuốc 159

Ảnh 6.8 Hình thái vi thể gan thỏ lô trị 2 sau 4 tuần uống thuốc 160

Ảnh 6.9 Hình thái vi thể gan thỏ lô trị 2 sau 4 tuần uống thuốc 160

Ảnh 6.10 Hình thái vi thể thận thỏ lô chứng sau 4 tuần uống thuốc 161

Ảnh 6.11 Hình thái vi thể thận thỏ lô chứng sau 4 tuần uống thuốc 162

Ảnh 6.12 Hình thái vi thể thận thỏ lô chứng sau 4 tuần uống thuốc 162

Ảnh 6.13 Hình thái vi thể thận thỏ lô trị 1 sau 4 tuần uống thuốc 163

Ảnh 6.14 Hình thái vi thể thận thỏ lô trị 1 sau 4 tuần uống thuốc 163

Ảnh 6.15 Hình thái vi thể thận thỏ lô trị 1 sau 4 tuần uống thuốc 164

Ảnh 6.16 Hình thái vi thể thận thỏ lô trị 2 sau 4 tuần uống thuốc 164

Ảnh 6.21 Hình thái vi thể gan thỏ lô chứng sau 2 tuần ngừng uống thuốc 168

Ảnh 6.22 Hình thái vi thể gan thỏ lô trị 1 sau 2 tuần ngừng uống thuốc 168

Ảnh 6.23 Hình thái vi thể gan thỏ lô trị 1 sau 2 tuần ngừng uống thuốc 169

Ảnh 6.24 Hình thái vi thể gan thỏ lô trị 1 sau 2 tuần ngừng uống thuốc 169

Ảnh 6.25 Hình thái vi thể gan thỏ lô trị 2 sau 2 tuần ngừng uống thuốc 170

Ảnh 6.26 Hình thái vi thể gan thỏ lô trị 2 sau 2 tuần ngừng uống thuốc 170

Ảnh 6.27 Hình thái vi thể thận thỏ lô chứng sau 2 tuần ngừng uống thuốc 171

Ảnh 6.28 Hình thái vi thể thận thỏ lô chứng sau 2 tuần ngừng uống thuốc 172

Ảnh 6.29 Hình thái vi thể thận thỏ lô chứng sau 2 tuần ngừng uống thuốc 172

Ảnh 6.30 Hình thái vi thể thận thỏ lô trị 1 sau 2 tuần ngừng uống thuốc 173

Ảnh 6.31 Hình thái vi thể thận thỏ lô trị 1 sau 2 tuần ngừng uống thuốc 173

Ảnh 6.32 Hình thái vi thể thận thỏ lô trị 1 sau 2 tuần ngừng uống thuốc 174

Ảnh 6.33 Hình thái vi thể thận thỏ lô trị 2 sau 2 tuần ngừng uống thuốc 174

Ảnh 6.34 Hình thái vi thể thận thỏ lô trị 2 sau 2 tuần ngừng uống thuốc 175

Hình 7.1 Đồ thị khảo sát tính tuyến tính và khoảng xác định 201

Trang

Sơ đồ 3.1 Quy trình chung xử lý các mẫu thực vật của cây khổ sâm Bắc Bộ 36

Sơ đồ 3.2 Quy trình điều chế các phần chiết MeOH từ cây khổ sâm Bắc Bộ 39

Sơ đồ 4.1 Quy trình ngâm chiết lá cây khổ sâm Bắc bộ ở quy mô pilot 117

Sơ đồ 4.2 Quy trình chiết phân bố với n-hexan và diclometan ở quy mô pilot 118

LỜI MỞ ĐẦU

Cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae)

mọc hoang và được trồng khắp nơi ở các tỉnh phía Bắc nước ta Cây dễ trồng

và sau một thời gian ngắn đã có thể thu hái lấy nguyên liệu Cây khổ sâm Bắc

Bộ được dùng phổ biến trong y học dân gian của Việt Nam Lá cây khổ sâm Bắc Bộ dùng chữa ung nhọt, lở loét, viêm mũi, đau bụng, tiêu hóa kém, lỵ và viêm loét dạ dày - tá tràng

Từ cây khổ sâm Bắc Bộ Phan Tống Sơn, Phan Minh Giang và cộng sự

đã phân lập và xác định cấu trúc của ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat, hoạt chất chủ yếu của cây, và nhiều hoạt chất ent-kauran ditecpenoit

khác

Đề tài nghiên cứu Khoa học và Phát triển Công nghệ độc lập cấp Nhà

nước “Nghiên cứu quy trình chiết tách ent-kauran ditecpenoit có tác dụng chống ung thư và chống viêm từ cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis

Gagnep., Euphorbiaceae)”, Mã số: ĐTĐL-2005/05, do GS TSKH Phan Tống Sơn làm chủ nhiệm đã giải quyết thành công các nhiệm vụ xây dựng quy trình

chiết tách ent-kauran ditecpenoit có tác dụng chống ung thư và chống viêm từ

cây khổ sâm Bắc Bộ; thử độ an toàn của hoạt chất chiết tách được; và chứng minh tác dụng chống ung thư và chống viêm của hoạt chất chiết tách được trên động vật thực nghiệm

Các kết quả nghiên cứu của Đề tài ĐTĐL-2005/05 đã tạo cơ sở để phát triển dược phẩm tạo ra các thuốc chống viêm, giảm đau, bảo vệ dạ dày,

hỗ trợ điều trị ung thư và dự phòng ung thư mới từ hoạt chất ent-kauran ditecpenoit từ cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep.,

gian ở một số vùng nguyên liệu

- Hoàn thiện quy trình chiết tách hoạt chất ent-kauran ditecpenoit từ

cây khổ sâm Bắc Bộ ở quy mô pilot

- Xây dựng quy trình bào chế viên nang từ hoạt chất ent-kauran

ditecpenoit từ cây khổ sâm Bắc Bộ

- Nghiên cứu độc tính của viên nang được bào chế từ hoạt chất

ent-kauran ditecpenoit từ cây khổ sâm Bắc Bộ

- Xây dựng tiêu chuẩn và nghiên cứu độ ổn định của hoạt chất và viên

nang chứa hoạt chất ent-kauran ditecpenoit từ cây khổ sâm Bắc Bộ

Như vậy mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu được xác định cho Giai đoạn 2 là hoàn thiện các nghiên cứu về nguyên liệu và quy trình chiết tách ở

quy mô pilot, và hoàn thiện việc nghiên cứu tiền lâm sàng của hoạt chất kauran ditecpenoit từ cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep.,

ent-Euphorbiaceae)

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Các hợp chất thiên nhiên từ thực vật trong liệu pháp chống bệnh ung thư và chống viêm

Theo thống kê, bệnh ung thư hiện là nguyên nhân chính thứ hai gây tử

vong ở các nước phát triển [1] Ở các nước đang phát triển ung thư cũng đang trở thành phổ biến [2]

Đã có nhiều tiến bộ trong việc chẩn đoán sớm và điều trị ung thư Vào đầu thế kỷ hai mươi, ít bệnh nhân ung thư sống sót được Vào những năm

1930 dưới một trong năm bệnh nhân ung thư còn sống năm năm sau khi chẩn đoán ra bệnh Vào những năm 1940, con số này đã đạt một trong bốn, vào những năm 1960 một trong ba, và vào khoảng 1990 là gần 50% [1]

Mặc dầu đã có nhiều liệu pháp mới được phát triển, phẫu thuật, bức xạ liệu pháp (xạ trị) và hóa liệu pháp được dùng riêng biệt hoặc trong sự phối hợp vẫn là các phương pháp điều trị ung thư có hiệu quả [1]

Các bệnh viêm và tự miễn, bao gồm cả viêm khớp dạng thấp, các

bệnh viêm ruột, đa xơ cứng, bệnh vảy nến và xuyễn, đang đặt ra cho các nhà nghiên cứu phát triển thuốc chữa bệnh những thách thức to lớn Những bệnh này hiện được điều trị bằng các thuốc chống viêm non-steroid (NSAIDs), các corticosteroit và methotrexat, các thuốc này có tác dụng hạn chế và/hoặc không đủ an toàn [3] Một cuộc chạy đua đang diễn ra nhằm tạo ra các thế hệ mới các thuốc chống viêm có hiệu quả cao và an toàn để bổ sung hoặc thay thế các liệu pháp hiện đang được áp dụng

Các hợp chất thiên nhiên luôn có vai trò chính trong việc phát hiện và

phát triển các dược phẩm mới [4] Giá trị của nhiều hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học không chỉ ở công dụng trực tiếp của chúng làm thuốc chữa bệnh, mà còn vì chúng có thể dùng làm nguyên mẫu hoặc các cấu trúc dẫn đường cho sự phát hiện và phát triển các dược phẩm mới Thực vật bậc cao luôn là một trọng tâm đặc biệt quan trọng trong nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học do sự đa dạng sinh học - và vì thế sự đa dạng hóa học - của chúng

Cũng như trong lĩnh vực thuốc chống HIV, nhiều thuốc chống bệnh

ung thư hiện đang được sử dụng trong liệu pháp hóa học hoặc được thu nhận

một cách trực tiếp từ các sản phẩm thiên nhiên hoặc là các chất được tổng hợp dựa trên các mẫu hợp chất thiên nhiên [1], [4], [5], [6] Các tác nhân chống ung thư bắt nguồn từ thiên nhiên (thực vật, vi sinh vật, sinh vật biển) cũng đang cho ta cơ hội to lớn để đánh giá không những các lớp hợp chất hóa học

chống ung thư hoàn toàn mới, mà còn các cơ chế tác dụng mới

Nhiều hợp chất có nguồn gốc thực vật hiện đang được sử dụng có hiệu quả trong điều trị ung thư Một trong các thí dụ đáng kể nhất là nhóm các

Vinca ancaloit được phân lập từ cây dừa cạn (Catharanthus roseus) Trong số

bốn ancaloit của cây dừa cạn thể hiện hoạt tính chống bệnh bạch cầu trên chuột chỉ có vincristin và vinblastin được sử dụng để điều trị ung thư trên người Các hợp chất này đã chứng tỏ có hiệu quả trong điều trị các bệnh bạch cầu, các u bạch huyết, và một số carcinoma Các Vinca ancaloit phá vỡ cân bằng tubulin/microtubule, do liên kết với các Vinca ancaloit mà các dime tubulin không thể tập hợp để tạo thành các microtubule

Vincristin: R = CHO Vinblastin: R = CH 3

Một thí dụ khác về một tác nhân có hoạt tính cao có nguồn gốc thực vật

là etoposide (VP-16), chất này đã đưa lại tỷ lệ chữa khỏi cao trong điều trị ung thư tinh hoàn khi dùng phối hợp với bleomycin (cũng là một sản phẩm thiên nhiên) và cisplatin; etoposide cũng có hoạt tính đáng kể chống lại carcinoma phổi tế bào nhỏ Etoposide là một dẫn xuất bán tổng hợp của podophyllotoxin, một chất ức chế gián phân do liên kết thuận nghịch với tubulin và ức chế việc lắp ráp microtubule Podophyllotoxin là một thành

phần của các cây Podophyllum pelatum, P emodi, và P pleianthum

Etoposide ức chế enzym hết sức quan trọng topoisomerase II và, sau đó, làm tăng sự phân cắt DNA

Podophyllotoxin Etoposide (VP-16)

N N

N N OH

O O

O

H 3 CO

OCH 3 OCH 3 O

OH

O O

O

H 3 CO

OH OCH 3

O

O O HO

HO

O O H

H 3 C

Chất ancaloit tự nhiên camptothecin được phân lập từ cây

Camptothecin acuminata của Trung Quốc là một hợp chất khác đã được liên

tục biến cải cấu trúc nhằm phát triển các tác nhân hữu ích hơn cho liệu pháp hóa học Camptothecin được dùng điều trị các bệnh ung thư dạ dày, trực tràng, ruột kết, và bàng quang, tuy nhiên nó khó kiếm được từ thiên nhiên và kém tan trong nước Các chất thiên nhiên camptothecin và 10-hydroxycamptothecin cũng như các dẫn xuất tổng hợp của camptothecin (9-aminocamptothecin, topotecan, và irinotecan (CPT-11)) là các tác nhân chống khối u mạnh và ức chế DNA topoisomerase I Các hợp chất topotecan và irinotecan đều là các muối amin-hydroclorua; topotecan tan trong nước nhiều gấp 100 lần so với camptothecin và được dùng để chữa ung thư buồng trứng tái phát; và irinotecan chuyển hóa thành chất phenolic có tác dụng ức chế

topoisomerase I in vivo mạnh hơn, thậm chí gấp 200-1.000 lần Irinotecan

cũng thể hiện hoạt tính chống khối u mạnh đối với ung thư buồng trứng Cả topotecan lẫn irinotecan đều có tác dụng mạnh chống ung thư ruột kết-thẳng

Topotecan Irinotecan

Các taxoit taxol® (paclitaxel), lúc đầu được phân lập từ vỏ cây thông đỏ

Tây Thái bình dương (Taxus brevifolia), và taxotere® (docetaxel), một chất

tương tự được bán tổng hợp từ 10-deacetyl-baccatin III nhận được từ lá cây

Taxus baccata thể hiện hoạt tính mạnh trên lâm sàng đối với ung thư vú và

ung thư buồng trứng Paclitaxel có một phương thức tác dụng độc đáo, nó ức

chế gián phân bằng cách đẩy mạnh sự lắp ráp các microtubule

Như vậy các Vinca ancaloit và các taxoit có thể được coi như là các

thuốc tác dụng trên cùng một đích, tức là bộ máy gián phân, nhưng có các cơ

chế tác dụng khác nhau và bổ sung cho nhau: các Vinca ancaloit ức chế sự

polyme hóa tubulin thành các microtubule, trong khi các taxoit ức chế phản

ứng ngược lại, đó là sự depolyme hóa các microtubule thành tubulin hòa tan

Hai họ thuốc chống gián phân này có các tính chất lâm sàng rất có giá trị khác

Taxol: R1 = COCH3, R2 = HNCOC6H5

Taxotere: R1 = H, R2 = HNCOOC(CH3)3

10-Deacetyl-baccatin III

Flavopiridol là một trong các tác nhân bắt nguồn từ thực vật lý thú nhất hiện đang trong bước phát triển, nó là chất ức chế kinase phụ thuộc cyclin đầu tiên được đi vào nghiên cứu lâm sàng Flavopiridol là một flavon tổng hợp có nguồn gốc từ chất ancaloit thực vật rohitukine, ancaloit này đầu tiên được

phân lập từ lá và thân cây Amoora rohituka và sau này từ cây Dysoxylum

binectariferum Cơ chế tác dụng của flavopiridol bao hàm việc cản trở sự

phosphoryl hóa các kinase phụ thuộc cyclin, ngăn trở sự hoạt hóa chúng và ngăn cản sự tiến triển của chu trình tế bào ở giai đoạn khối u 1 (G1) hoặc 2 (G2) Các cuộc thử lâm sàng giai đoạn I đã đạt được các tỷ lệ đáp ứng đáng khích lệ đối với nhiều loại u ác tính rắn và u huyết ác tính Các kết quả đó đã

H

H O

H HO

H 3 COCO

H 3 C

dẫn đến sự bắt đầu các cuộc thử lâm sàng giai đoạn II với các bệnh nhân mắc các bệnh carcinoma ruột kết-thẳng, tuyến tiền liệt, tế bào thận và phổi tế bào không nhỏ, cũng như u lymphô không Hodgkin và bệnh bạch cầu lymphô mạn tính

Rohitukine Homoharringtonine

(absolute configuration)

Một số tác nhân có nguồn gốc thực vật khác hiện cũng đang được nghiên cứu Thí dụ, homoharringtonine, một ancaloit được phân lập từ cây

Cephalotaxus harringtonia của Trung Quốc, thể hiện tính hiệu quả chống

nhiều bệnh bạch cầu khác nhau Cơ chế tác dụng chủ yếu của homoharringtonine là ức chế sự tổng hợp protein, ngăn cản sự tiến triển của chu trình tế bào 4-Ipomeanol là một dẫn xuất furan độc đối với phổi

được phân lập từ củ khoai lang (Ipomoeca batatas) bị nấm Fusarium solani hoặc Ceratocystis fimbriata làm hư hại và đang được đánh giá trên lâm

sàng về tác dụng chống ung thư đặc hiệu đối với bệnh ung thư phổi Hợp chất này chuyển hóa thành các sản phẩm chuyển hóa liên kết với DNA nhờ

sự hoạt hóa chuyển hóa bởi các enzym cytochrome P450 có mặt trong các

tế bào phổi β-Lapachone (từ gỗ lõi của cây tếch, Tectona grandis) là một

chất ức chế DNA topoisomerase I gây ra sự chậm trễ của chu trình tế bào ở giai đoạn G1 hoặc S (tổng hợp) trước khi gây ra sự chết của tế bào do

O O

CH 3

HO

N

CH 3 OH OH

O

O

O CH 3

N H

O

CH 3

O C

chương trình hóa hoặc do hoại tử trong nhiều loại tế bào carcinoma ở người, bao gồm buồng trứng, ruột kết, phổi, tuyến tiền liệt và vú

Một tác nhân mới nữa cũng đang được thử lâm sàng là combretastatin A4 phosphate (CA4-P) Combretastatin A4 là một hợp chất thiên nhiên được

phân lập từ cây Combretum caffrum của Nam Phi Chất này là một dẫn xuất

cis-stilben liên kết được vào cùng một vị trí liên kết của tubulin như

colchicine, colchicine là một chất ức chế sự trùng hợp tubulin đã được biết đến Các nghiên cứu rộng rãi trên các khối u được cấy dưới da và ở đúng vị trí

ở chuột còn cho thấy combretastatin A4 có thể ngắt sự cung cấp máu cho các khối u, làm “chết đói” khối u đang phát triển, mà vẫn duy trì dòng máu chảy bình thường ở các mô bình thường ở bên cạnh

O

O

HO OCH 3

O P ONa

O ONa

CH 3

CH 3

Ipomeanol Combretastatin A4-phosphate (CA4-P) β-Lapachone

Đang được thử lâm sàng còn có một số hoạt chất khác được phân lập từ các loài cây mọc ở Trung Quốc, như lycobetaine, một phenanthridinium ancaloit bậc bốn được phân lập từ một số loài cây thuộc họ Amaryllidaceae,

thí dụ từ Lycoris radiata, được xem là có tác dụng điều trị ung thư cổ, buồng

trứng và dạ dày; và indirubin là một thành phần phụ có cấu trúc bisindol với

một liên kết 3,2' trong cây Indigo naturalis, indirubin thể hiện hiệu quả điều

trị cao trên lâm sàng ở các bệnh nhân bị bệnh bạch cầu tủy mạn tính

Liên quan đến tác dụng chống và dự phòng ung thư cũng như tác dụng

chống viêm, gần đây người ta quan tâm nhiều đến nhóm các ent-kauran ditecpenoit Các ent-kauran ditecpenoit được tìm thấy ở nhiều loài cây thuốc

được dùng điều trị chống viêm và khối u trong y học dân gian của nhiều nước

châu Á, như từ chi Isodon (còn gọi là Rabdosia) Nhiều ent-kauran

ditecpenoit thể hiện hoạt tính độc hại tế bào đối với nhiều dòng tế bào ung thư người [7], ức chế sự tạo mạch [8], ức chế sự hoạt hóa nhân tố phiên mã NF-

ĸB [9]; và nhiều hoạt tính khác như kháng vi sinh vật, chống sốt rét, chống sự kết tụ tiểu cầu, chống co thắt [10], [11], [12], [13]

Đặc biệt từ cây Rabdosia rubescens (Hemsl.) Hara của Trung Quốc người ta đã phân lập được các ent-kauran ditecpenoit oridonin và

ponicidin, các ditecpenoit này đã được phát hiện là các hoạt chất độc hại tế

bào chủ yếu của các loài Rabdosia [6]; chúng cũng thể hiện hoạt tính chống tạo mạch mạnh [8] R rubescens đã chứng tỏ hiệu quả cao trong

điều trị bệnh nhân bị bệnh carcinoma thực quản trong cuộc thử lâm sàng bằng cách so sánh giữa nhóm bệnh nhân được điều trị bằng liệu pháp hóa

học đơn thuần với nhóm được điều trị bằng liệu pháp hóa học cộng R

rubescens, và cuộc thử lâm sàng với các bệnh nhân được điều trị bằng sự

phối hợp liệu pháp hóa học và R rubescens hoặc R rubescens cộng các

thuốc cổ truyền khác nhau của Trung Quốc đã được cấp bằng sáng chế Cũng đã có thông báo là oridonin và ponicidin đã được thử lâm sàng với

O OH

OH OH

OH OH H

OH H

Thuốc chống viêm và giảm đau có nguồn gốc thực vật được biết đến

nhiều và sử dụng rộng rãi nhất là aspirin [5], chất này được coi là nguyên mẫu của các tác nhân giảm đau và chống viêm nhẹ Các thuốc chống viêm non-steroid vẫn được đánh giá so sánh với aspirin Những cố gắng nhằm biến cải hóa học phân tử aspirin đã dẫn đến sự tổng hợp và đánh giá hoạt tính chống viêm của hàng trăm chất mới Mặt khác việc tìm kiếm các thuốc chống viêm mới từ thực vật vẫn đang được tiếp tục Trong một bài tổng quan mới đây, S Darshan và Doreswamy [14] đã nêu các bằng sáng chế được bảo vệ của các thuốc chống viêm thảo mộc có nguồn gốc từ 38 loài cây Các tác giả này đã nêu bật vai trò của các thành phần trong cây, như polysaccharit, tecpenoit, curcuminoit, ancaloit, , đối với tác dụng làm giảm các bệnh viêm bao gồm viêm khớp, bệnh thấp, viêm nang bã, Một vấn đề đang thu hút sự quan tâm đặc biệt của các nhà nghiên cứu phát triển thuốc là tìm kiếm các chất thiên nhiên có tác dụng ức chế nhân tố phiên mã NF-ĸB để phát triển làm thuốc chống viêm

1.2 Nhân tố phiên mã NF-ĸB và các bệnh ung thư và viêm

Lĩnh vực nghiên cứu các hợp chất có các tác dụng chống viêm, chống và dự phòng ung thư có những bước phát triển mới nhờ sự phát hiện nhân tố phiên

mã NF-ĸB (transcription factor NF-ĸB) bởi Sen và Baltimore vào năm 1986 Nhân tố phiên mã NF-ĸB điều chỉnh nhiều quá trình sinh lý quan trọng, bao gồm các quá trình phát triển, các đáp ứng viêm và miễn dịch, sự tăng trưởng của tế bào, ung thư, sự chết được chương trình hóa của tế bào (apoptosis), và

sự biểu hiện của một vài gen virút Bởi vậy NF-ĸB cũng là đích của nhiều thuốc chống ung thư và chống viêm [15]

Các nhân tố phiên mã NF-ĸB là một trong các nhóm protein điều chỉnh gen thuộc nhân chuẩn được nghiên cứu nhiều nhất Ở các động vật có xương sống, NF-ĸB đang hoạt động có thể là bất cứ dime nào trong số nhiều homo-

và heterodime được tạo thành bởi các tiểu đơn vị p50, p52, RelA (p65), RelB,

và c-Rel Trong các điều kiện cơ bản, NF-ĸB được giữ ở trong chất tế bào, trong một trạng thái không hoạt động, bởi một protein để kiềm chế có liên quan được gọi là chất ức chế (I)ĸB (Inhibitor of ĸB; quan trọng nhất trong số các Inhibitor of ĸB có thể là các protein IĸBα, IĸBβ, và IĸBε) IĸB chắn cản các chuỗi di chuyển vào nhân của NF-ĸB và giữ NF-ĸB ở trong chất tế bào

Một trong những cơ chế phổ biến nhất dẫn đến sự hoạt hóa NF-ĸB đòi hỏi sự phosphoryl hóa nhanh IĸB (cụ thể là ở serine-32 và -36 của IĸBα) để đáp lại các tác nhân kích thích khác nhau, thí dụ các tác nhân kích thích gây viêm (các cytokin như TNF-α hoặc IL-1, stress oxi hóa, các tác nhân truyền nhiễm, các endotoxin) IĸB được phosphoryl hóa lan toả rộng nhanh chóng,

và rồi IĸB được lan tỏa rộng là đích cho sự thoái biến nhanh bởi 26S proteasome Sự thoái biến IĸB gỡ bỏ sự chắn cản các chuỗi di chuyển vào nhân của NF-ĸB, vì vậy để cho NF-ĸB đi vào nhân để điều khiển sự phiên mã các gen mục tiêu

Các cơ chế làm mất hoạt tính của NF-ĸB sau khi nó đã được hoạt hóa bởi một sự kích thích gây viêm chẳng hạn, như vậy phục vụ như các “cái