BÁO CÁO TỔNG KẾT KHOA HỌC ĐỀ TÀI :NGHIÊN CỨU CÁC HOẠT CHẤT TỪ CÂY THUỐC BÀI THUỐC VIỆT NAM TRONG CÓ TÁC DỤNG CHỐNG UNG THƯ, TIM MẠCH VÀ TIỂU ĐƯỜNG

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HÓA HỌC NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC NHIỆM VỤ HỢP TÁC KHOA HỌC CÔNG NGHỆ THEO NGHỊ ĐỊN

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

VIỆT NAM

VIỆN HÓA HỌC

NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC NHIỆM VỤ HỢP TÁC KHOA HỌC CÔNG NGHỆ THEO NGHỊ

ĐỊNH THƯ VIỆT NAM – HÀN QUỐC

“ Nghiên cứu phát hiện các hoạt chất từ cây thuốc, bài

thuốc Việt Nam tác dụng trên các phân tử đích

có tác dụng chống ung thư, AIDS, tim mạch và tiểu đường”

CƠ QUAN CHỦ TRÌ: VIỆN HÓA HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM CHỦ NHIỆM NHIỆM VỤ: TS NGUYỄN MẠNH CƯỜNG

8820

HÀ NỘI-2010

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

VIỆT NAM

VIỆN HÓA HỌC

NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC NHIỆM VỤ HỢP TÁC KHOA HỌC CÔNG NGHỆ THEO NGHỊ

ĐỊNH THƯ VIỆT NAM – HÀN QUỐC

“ Nghiên cứu phát hiện các hoạt chất từ cây thuốc, bài

thuốc Việt Nam tác dụng trên các phân tử đích

có tác dụng chống ung thư, AIDS, tim mạch và tiểu đường”

HÀ NỘI-2010

Chủ nhiệm Đề tài

TS Nguyễn Mạnh Cường

Cơ quan chủ trì đề tài

Ban chủ nhiệm chương trình Bộ Khoa học và Công nghệ

COSY Correlation Spectroscopy, Phương pháp COSY (Phương pháp

CHTHN hai chiều đo tương quan 1H-1H)

DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer, Phương pháp

DEPT (Thực nghiệm kiểm tra số hiđro gắn với cacbon)

DMSO Dimetyl sunphoxit

EI-MS Electron Impact Mass Spectrometry, Phương pháp EI-MS (Phương

pháp phổ khối ion hóa bằng va chạm electron)

ESI-MS Electrospray Ionization Mass Spectrometry, Phương pháp ESI-MS,

Phương pháp phổ khối ion hóa bằng phun bụi electron

EtOAC Etyl axetat

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence, Phương pháp HMBC

(Phương pháp CHTHN hai chiều đo tương quan 1H-13C qua nhiều liên kết)

HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence, Phương pháp HSQC

(Phương pháp CHTHN hai chiều đo tương quan 1H-13C qua một liên kết)

IC 50 Half Maximal Inhibitory Concentration, Chỉ số IC50 (nồng độ hoạt

chất để ức chế 50% sự tăng trưởng của các đối tượng thử nghiệm)

IR Infrared Spectroscopy, Phương pháp phổ hồng ngoại

MeOH Metanol

MIC Minimum Inhibitory Concentration, Chỉ số MIC (nồng độ hoạt chất

tối thiểu để ức chế hoàn toàn sự tăng trưởng quan sát được của các

vi sinh vật thử nghiệm)

ppm Parts per million, Phần triệu

TLC Thin Layer Chromatography, Phương pháp sắc ký lớp mỏng

δ Chemical shift, Độ chuyển dịch hóa học đen-ta

dd Doublet of doublet, Cụm tín hiệu Đúp-lét của Đúp-lét

J Coupling constant, Hằng số tương tác J

m Multiplet, Cụm tín hiệu Mul-ti-plét

s Singlet, Cụm tín hiệu Xing-lét

t Triplet, Cụm tín hiệu Trip-lét

MỤC LỤC BẢNG

Bảng 4.3 Kết quả sang lọc hoạt tính ức chế “Wnt signaling

pathway”

34

Bảng 4.8 Tác dụng ức chế kênh Ca2+ của các mẫu dịch chiết 47

Bảng 4.10 Tác dụng gây co thắt cua các dẫn xuất Chrysosplenol

Bảng 4.12 Tác dụng của các dịch chiết đến sự tăng sinh của tế

bào xương MC3T3-E1 No.1

56

Bảng 4.13 Tác dụng của các dịch chiết đến sự tăng sinh của tế

bào xương MC3T3-E1 No.2a

62

Bảng 4.14 Tác dụng của các dịch chiết đến sự tăng sinh của tế

bào xương MC3T3-E1 No.2b

64

Bảng 4.15 Tác dụng của các dịch chiết đến sự tăng sinh của tế

bào xương MC3T3-E1 No.2c

65

Bảng 4.17 Kết quả thử các hợp chất tách từ hoa Mật mông 69

Bảng 5.1 Dữ kiện phổ 1H-NMR của dẫn xuất (R)-MTPA ester

và (S)-MTPA ester của 11

105

Bảng 5.2 Tác dụng chống TOSC cặn chiết MeOH và nước

của hoa Mật mông

Bảng 5.5 Kết quả thử hoạt tính sinh học của hợp chất 35-45

trên hai dòng tế bào ung thư bạch cầu HL-60 và ung thư đại tràng HCT-116

139

Bảng 6.1 Tác dụng ức chế của dẫn xuất indirubin đến sự sinh

trưởng của tế bào ung thư máu HL-60

145

MỤC LỤC HÌNH

Hình 4.2 Biểu đồ so sánh tác dụng ức chế kênh Ca2+ của 30

mẫu và hình mô tả 7 mẫu có hoạt tính cao

49 Hình 4.3 Kết quả thử hoạt tính chống co thắt (contraction) 51

Hình 4.4 Hình mô tả hoạt tính chống co thắt cơ tim của

VHKC 0026

52 Hình 4.5 Tác dụng gây co thắt cơ tim của VHKC-5050, 5052 53

Hình 4.6 Giản đồ hoạt tính chống co thắt của Chrysopleol C 53

Hình 4.7 Giản đồ hoạt tính chống co thắt của Chrysopleol C

theo thời gian

53

Hình 4.8 Tác dụng gây co thắt của Murrayafolin A trên tế

bào cơ tim

54

Hình 4.9 Tác dụng gây co thắt của Murrayafolin A trên tế

bào cơ tim

55

Hình 4.10 Thí nghiệm mô tả khả năng chống co thắt của

indirubin-3’-oxime theo nồng độ

56 Hình 5.1 Sơ đồ chiết tách và phân lập các hợp chất từ rễ cây

Hình 5.20 Phổ ESI-MS của hợp chất 5 84

Hình 5.24 Mô tả thí nghiệm Murrayafoline A (1) là chất ức

qua proteasome

88

Hình 5.27 Tác dụng Murrayafoline A (1) với dòng ung thư

ruột kết

90 Hình 5.28 Sơ đồ phân lập các hoạt chất từ loài Uncaria

lancifolia

91

Hình 5.33 Quy trình phân lập lá cây Goniothalmus tamirensis 99

Hình 5.34 Quy trình phân lập các hợp chất của lá cây

Hình 5.40 Ảnh hưởng của hợp chất 12 và 13 đến sự phát triển

của tế bào tạo xương chuột MC3T3-E1 (a) Khả năng sống sót

(b) Sự tổng hợp collgen (c) Enzym photphat kiềm ALP (d) Độ tạo khoáng canxi

108

Hình 5.41 Sơ đồ phân lập fucoidan (hợp chất 13) từ rong nâu 109

Hình 5.62 Hoạt tính Rnase H của hợp chất từ hoa Mật mông 130

Hình 5.63 Linarin (20) làm tăng sinh trưởng của tế bào tạo

xương MC3T3-E1

131 Hình 5.64 Sơ đồ phân lập Chrysoeriol (34) từ loài Eurya

Hình 5.67 Mức độ tế bào HL-60 and HCT 116 tự chết (degree

of apoptosis) thể hiện ở hình sáng trắng của nhân tế bào khi gắn bởi Hoechst 33342

140

Hình 5.68 Hợp chất 35 và 36 làm tế bào ung thư ruột kết

HCT-116 tự chết theo kiểu bên ngoài (extrisie) và bên trong (intrisie)

141

Hình 6.1 Sơ đồ tổng hợp các dẫn xuất indirubin (hợp chất 46) 142

Hình 6.2 Tác dụng ức chế của các dẫn xuất indirubin đến sự

sinh trưởng của tế bào ung thư máu LH-60

145

Hình 6.3 Tác dụng của I-2 và I-3 đến khả năng sống và tổng

hợp collagen của tế bào MC3T3-E1

rễ cây cơm rượu

Hình 7.3 Đồ thị HPLC của Murrayafoline A (1) ở nồng độ

30µg/ml

157

Hình 7.5 Bảng dữ kiện đo HPLC của mẫu Murrayafoline A

(1) ở nồng độ khác nhau

158

Hình 7.7 Bản dữ kiện đo HPLC của 3 mẫu Murrayafoline A

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC NHIỆM VỤ

NGHỊ ĐỊNH THƯ VIỆT NAM – HÀN QUỐC

CƠ QUAN CHỦ TRÌ: VIỆN HÓA HỌC CHỦ NHIỆM: TS NGUYỄN MẠNH CƯỜNG

MỤC LỤC

Mở đầu 1 Tổng quan và phương pháp nghiên cứu 2

Chương 1 Tổng quan về các phép thử hoạt tính sinh học sử dụng trong nhiệm

vụ

2

1.1.2 Phép thử sàng lọc ức chế Wnt/β-catenin signaling pathway 3

Chương 2 Phương pháp nghiên cứu 10

2.1 Phương pháp thu thập mẫu, giám định tên khoa học 10

2.2 Phương pháp hóa học 10

2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 11

2.3.1 Phương pháp thử hoạt tính chống ung thư 11

2.3.4 Phương pháp thử hoạt tính chống loãng xương 15

3.2 Xử lý và tạo dịch chiết mẫu thực vật 22

4.1 Kết quả thử hoạt tính chống ung thư 25

4.3 Kết quả thử hoạt tính chống bệnh tim mạch 47

4.4 Kết quả thử hoạt tính chống loãng xương 56

Chương 5 Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính của một số loài thực vật 71

5.1 Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính của Glycosmis

stenocarpa

71 5.2 Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính của cây Uncaria

lancifolia

90

5.3 Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính của cây Goniothalamus

officinalis

1135.6 Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính của cây Eurya ciliata 132

5.7 Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính của cây Panax

Chương 7 Kết quả quy trình chiết tách lượng lớn và tạo chế phẩm 154

7.1 Quy trình chiết tách lượng lớn hoạt chất Murrayfoline A (1) 154

7.3 Xây dựng phương pháp định lượng hoạt chất Murrayfoline A (1) 156

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 169

VIỆN HÓA HỌC CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

Hà nội, ngày 12 tháng 2 năm 2010

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ

I THÔNG TIN CHUNG

1 Tên nhiệm vụ

Nghiên cứu phát hiện các hoạt chất từ các cây thuốc, bài thuốc Việt Nam tác dụng trên các phân tử đích có tác dụng chống các bệnh ung thư, AIDS, tim mạch và tiểu đường

Thuộc: Nhiệm vụ Hợp tác Quốc tế theo Nghị định thư Việt Nam – Hàn quốc giai đoạn 2007-2010

2 Chủ nhiệm nhiệm vụ

Phía Việt Nam

TS Nguyễn Mạnh Cường, Viện Hóa học Địa chỉ: 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội, Việt Nam Tel: 84 -4- 3791 3755 Fax: : 84-4-3836 1283 Email: nmcuong_inpc@yahoo.com.vn

Phía Hàn Quốc:

GS.TS Young Ho Kim, Khoa Dược, Trường Đại học Chungnam

Địa chỉ: Daejeon, 305-764, Korea

Tel: 82-42-821-5933 Fax: 82-42-823-6566

Email yhk@cnu.ac.kr

3 Tổ chức chủ trì đề tài/dự án

Tên tổ chức chủ trì đề tài: Viện Hóa học Điện thoại: 84-4-3756 4312 Fax : 84-4-3836 1283 Địa chỉ: 18 – Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội

Họ và tên thủ trưởng tổ chức: PGS.TS Nguyễn Văn Tuyến

Số tài khoản: 30101045 Ngân hàng: Kho bạc Nhà nước Cầu giấy, Hà Nội Tên cơ quan chủ quản đề tài: Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN

1 Thời gian thực hiện nhiệm vụ

- Thực tế thực hiện: 32 tháng từ tháng 11/2007 đến tháng 5/2010

- Được gia hạn nếu có:

- Lần 1:

2 Kinh phí và sử dụng kinh phí

- Tổng kinh phí thực hiện: 1.350 triệu đồng

Trong đó: Kinh phí hỗ trợ từ NSSNKH: 1.350 triệu đồng

3 Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài/dự án

“Nghiên cứu phát hiện các hoạt chất

từ các cây thuốc, bài thuốc Việt Nam tác dụng trên các phân tử đích có tác dụng chống các bệnh ung thư, AIDS, tim mạch và tiểu đường”

4 Cá nhân tham gia thực hiện nhiệm vụ

(Người tham gia thực hiên thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10 người

kể cả chủ nhiệm)

a Thành viên chính

1 TS Nguyễn Mạnh Cường Viện Hóa học

2 NCS Bùi Hữu Tài Viện Hóa học

3 CN Trần Thu Hường Viện Hóa học

4 ThS Phùng Gia Luân Viện Hóa học

5 CN Ngô Thị Anh Viện Hóa học

6 CVC Ngô Văn Trại Viện Dược liệu

7 PGS TS Phạm Quốc Long Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên

8 PGS TS Nguyễn Quyết Chiến Viện Hóa học

b Cán bộ tham gia

9 GS.TS Trần Văn Sung Viện Hóa học

10 ThS Đặng Hoàng Hoan Viện Hóa học

11 ThS Trần Thị Quế Trường Đại học Khoa học tự nhiên

12 ThS.Vũ Thị Huyền Trường Đại học Khoa học tự nhiên

13 TS Đỗ Thu Hương Viện Hóa học

14 PGS TS Nguyễn Văn Hùng Viện Hóa học

17 ThS Trần Quốc Toàn Viện Hóa học

18 TS Trần Văn Lộc Viện Hóa học

19 Ths Bá Thị Châm Viện Hóa học

20 TS Bùi Kim Anh Viện Hóa học

21 TS Nguyễn Thị Thủy Viện Hóa học

22 TS Nguyễn Duy Nhất Viện Nghiên cứu ứng dụng và phát triển công

nghệ Nha trang

5 Tình hình hợp tác quốc tế

(Nội dung, thời gian, kinh

phí, địa điểm, tên tổ chức hợp

tác, số lượng người tham

gia…)

Thực tế đạt được

(Nội dung, thời gian, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số lượng người tham gia…)

Ghi chú

1 Năm 2007:

Nội dung: Trao đổi, thống nhất

với đối tác Hàn quốc nội dung

thực hiện dự án hợp tác

Thời gian: năm 2007

Kinh phí: theo thuyết minh

Nội dung: Trao đổi, thống nhất

với đối tác Hàn quốc nội dung thực hiện dự án hợp tác, tham dự Hội thảo quốc tế về hợp chất thiên nhiên

Thời gian: 8 ngày, từ 26/8/2007

Nội dung: Cử cán bộ sang Hàn

Quốc thực tập trao đổi khoa học

Nội dung: Cử cán bộ sang Hàn

Quốc thực tập trao đổi khoa học ngắn hạn

Thời gian: 03 tháng, từ tháng 5-7 năm 2008

Kinh phí: theo thuyết minh Tên tổ chức tiếp nhận: GS

Young Ho Kim, Khoa Dược, Đại học Chungnam

Tên cán bộ Việt Nam: CN Bùi

Hữu Tài Tên cán bộ Việt Nam:

TS.Nguyễn Mạnh Cường, Bùi Hữu Tài, GS.TSKH Trần Văn Sung

3 Năm 2008:

Nội dung: Cử cán bộ sang Hàn

Quốc thực tập trao đổi khoa học

Năm 2008:

Nội dung: Cử cán bộ sang Hàn

Quốc trao đổi khoa học, theo học

Kinh phí: theo thuyết minh

Nội dung: cán bộ dự án sang

Hàn Quốc trao đổi, đánh giá,

bàn kế hoạch triển khai năm

2009

Thời gian: 07 ngày

Kinh phí: theo thuyết minh

Tên tổ chức tiếp nhận: GS

Young Ho Kim, Khoa Dược,

Đại học Chung nam

Tên cán bộ Việt Nam: TS

Nguyễn Mạnh Cường,

GS.TSKH Trần Văn Sung

Năm 2008:

Nội dung: cán bộ dự án sang Hàn

Quốc trao đổi, đánh giá, bàn kế hoạch triển khai năm 2009

Thời gian: 07 ngày, tháng

Thời gian: 02 tháng, năm 2009 Kinh phí: theo thuyết minh Tên tổ chức tiếp nhận: GS

Young Ho Kim, Khoa Dược, Đại học Chungnam

Tên cán bộ Việt Nam: ThS Phạm

Thùy Linh

6 Năm 2009:

Nội dung: cán bộ dự án sang

Hàn Quốc trao đổi, đánh giá, nội

dung công việc kết thúc dự án

Thời gian: 07 ngày

Kinh phí: theo thuyết minh

Nội dung: cán bộ dự án sang Hàn

Quốc trao đổi, đánh giá, nội dung công việc kết thúc dự án và kế hoạch phát triển dự án giai đoạn hai

Thời gian: 07 ngày, tháng 3 năm

B Đoàn vào

làm việc với chủ nhiệm dự án

phía Việt Nam, tham dự hội

nghị khoa học quốc tế

Thời gian: 5 ngày trong tháng 9

năm 2008

Kinh phí: Theo thuyết minh

Địa điểm: Viện Hóa học

Số đoàn: 02

Số người: 02-04

việc với chủ nhiệm dự án phía Việt Nam, tham dự hội nghị khoa học quốc tế

Thời gian: 5 ngày trong tháng 9

năm 2008

Kinh phí: Theo thuyết minh Địa điểm: Viện Hóa học

Số đoàn: 01

Số người: GS Young Ho Kim và

GS Sun Hee Woo

2 Năm 2009:

Nội dung: Chủ nhiệm nhiệm vụ

phía Hàn Quốc và Việt Nam

trao đổi về kết quả dự án, đị

thực địa, tham dự hội nghị khoa

học

Thời gian: tháng 7 và 10 năm

2009

Kinh phí: Theo thuyết minh

Địa điểm: Viện Hóa học và

thành phố tổ chức hội nghị

Số đoàn: 02

Số lượng người: 05-06

Năm 2009:

Nội dung: Chủ nhiệm nhiệm vụ

phía Hàn Quốc và Việt Nam trao đổi về kết quả dự án, đị thực địa, tham dự hội nghị khoa học

Thời gian: tháng 7 và 12 năm

6 Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị

Thời gian: 27 tháng 8 năm 2007 Thành viên: VHH, CNU

Thời gian: 11/12/2008 Thành viên: Nguyễn Mạnh Cường, Trần Văn Sung, Bùi Hữu Tài (VHH), Young Ho Kim, Sun-Hee Woo, Guy-Wong Song, Sang Kyum Kim (CNU)

3 Năm 2009

Nội dung: Hội thảo khoa học

báo cáo tống kết về các kết quả

đã đạt được giữa hai phía

Thời gian: tháng 12 2009

Năm 2009

Nội dung: tổ chức hội thảo khoa

học báo cáo tống kết về các kết

quả đã đạt được giữa hai phía

“Nghiên cứu phát hiện các hoạt

tử đích có tác dụng chống các bệnh ung thư, AIDS, tim mạch,

loãng xương và tiểu đường”

Thời gian: 15/12/2009 Địa điểm: Viện Hóa học, Việt Nam

Thành viên: VHH, INPC, CNU

7 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:

(Nêu tại mục 18 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong nước và nước ngoài)

Thời gian STT Các nội dung công việc chủ

hoạch

Thực tế đạt được

Người, cơ quan thực hiện

1 - Xây dựng đề cương chi tiết,

nội dung tiến độ thực hiện cho

từng năm

01/2007 đến 06/2007

Mạnh Cường, Viện Hóa học

2 Tổ chức các chuyến đi thực địa

thu mẫu thực vật Các chuyến đi

dự kiến vào hai mùa trong năm

Thu 400 mẫu thực vật

06/2007 đến 8/2009

Mạnh Cường, Viện Hóa học

3 Xử lý mẫu, chiết, đóng gói, bảo

quản mẫu để thử hoạt tính 400

dịch chiết

06/2007 đến 07/2009

12/2009 TS Nguyễn

Mạnh Cường, Viện Hóa học

4 Thử hoạt tính sinh học dịch

chiết theo 4 phép thử

07/2007 đến 6/2009

Kim và Cộng sự Đại học Chung nam

5 Nghiên cứu hóa học các mẫu có

hoạt tính, phân lập, xác định cấu

trúc các hoạt chất

9/2007 đến 11/2009

12/2009 Các đơn vị tham

gia phía Việt nam

và Hàn Quốc

7 + Cử cán bộ đi đào tạo, tham

gia thực hiện nhiệm vụ tại Hàn

Quốc

Bao gồm:

- 03 đợt cán bộ dự án sang trao

đổi, thống nhất kế hoạch, tiến

độ, nội dung thực hiện; tham dự

hội thảo khoa học

- 01 chuyên gia về thử sinh học

sang tiếp thu kỹ thuật, tham gia

thực hiện đề tài

8 lượt cán bộ Việt nam sang công tác, nghiên cứu, đào tạo tại Hàn quốc

- 02 đợt

9/2007 đến 3/2010

- 03 đợt cán bộ

dự án sang trao đổi- 01 chuyên gia về thử sinh

Viện Hóa học Đại học Chung nam

trao đổi, làm cao học

+ Tiếp cán bộ Hàn Quốc sang

làm việc tại Việt nam (mỗi năm

1 đoàn)

của Hàn quốc sang Việt Nam

03 cán

bộ sang nghiên cứu, trao đổi, làm cao học

tập các báo cáo hội thảo

Theo kế hoạch

Thực tế đạt được

lý cụ thể, đạt TCCS

Thực tế đạt được

Ghi chú

1 Qui trình tách chiết các 5 dịch chiết 7 dịch chiết

06 hoạt chất chính

3 Qui trình công nghệ chiết

(Tạp chí, nhà xuất bản)

1 Bài báo: Công trình khoa

học đăng ở tạp chí trong

và ngoài nước

quốc tế: 06 Tạp chí trong nước: 07

2 Các báo cáo tại hội nghị

trong nước và quốc tế

Không đăng

ký số lượng

16 Hội nghị khoa

học quốc tế: 10 Hội nghị khoa học quốc gia: 05

d Kết quả đào tạo, trao đổi khoa học

Số lượng

Số

TT

Cấp đào tạo, Chuyên

ngành đào tạo Theo kế hoạch Thực tế đạt

ký

01 NCS đang làm tại Hàn Quốc

3 Thực tập, trao đổi khoa

học

e Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp

Yêu cầu khoa học cần đạt

28/7/2010 Cục sở hữu tuệ, Bộ KH và

CN Việt Nam

2 A composition

compopring chrysosplenol

C for treating and

preventing heart disease

A for treating and

preventing hearting heart

2 Đánh giá về hiệu quả do nhiệm vụ mang lại

a Hiệu quả về khoa học và công nghệ

- Đã sàng lọc hoạt tính các mẫu thu trong nước bằng năm kỹ thuật thử sinh

học hiện đại: phép thử độc tính với tế bào ung thư gan SK-Hep-1, ung thư phổi MCF-7 và tác dụng trên protein Wnt nhằm phát hiện các chất có tác dụng chữa ung thư; phép thử kháng enzym Rnase H phát hiện mẫu có tiềm năng chữa trị bệnh AIDS; phép thử đặc hiệu trên kênh Canxi (Ca2+)

và tác dụng chống co thắt phát hiện chất chữa bệnh tim mạch; phép thử TOSC sàng lọc các hợp chất chống oxy hóa và các phép MC3T3-E1 nhằm phát hiện các hoạt chất chữa bệnh loãng xương

- Đã tiếp cận thông tin, công nghệ và trang thiết bị tiên tiến trong lĩnh vực

nghiên cứu tác dụng dược lý và phân lập hoạt chất của phía đối tác Hàn Quốc

- Đã phát hiện nhiều hoạt chất quí có tiềm năng, có tính khả thi cao trong

các nghiên cứu tiếp theo để phát triển thành các dược chất chữa trị bệnh ung thư, loãng xương và tim mạch

- Góp phần đào tạo, nâng cao năng lực đội ngũ cán bộ khoa học và công

nghệ của đơn vị trong lĩnh vực hóa hợp chất thiên nhiên-hóa dược

b Hiệu quả về kinh tế xã hội

- Đã góp phần mở rộng giao lưu và hội nhập quốc tế với các nhà khoa học

thế giới, đóng góp vào các hoạt động đối ngoại trong khoa học công nghệ

- Tạo cơ sở khoa học cho việc góp phần tạo ra những sản phẩm có giá trị

dược dụng phục vụ cho chương trình chăm sóc sức khỏe nhân dân

3 Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài, dự án:

Số

Thời gian thực hiện

Ghi chú

(Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì…)

I Báo cáo định kỳ

các nội dung; các nội dung khoa học bước đầu kết quả tốt Người chủ trì: Ông Lê Quang Thành, PVT Vụ KHXHTN

III Nghiệm thu cơ sở

Nghiệm thu cấp cơ sở 5/2010 Nghiệm thu đạt

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

TS Nguyễn Mạnh Cường

THỦ TRƯỞNG ĐƠN VỊ

MỞ ĐẦU

Cây cỏ đã được sử dụng từ hàng ngàn năm nay trên thế giới cũng như ở nước ta để phòng và chữa bệnh Cho đến nay thảo dược vẫn là

nguồn rất quan trọng trong việc nghiên cứu tìm kiếm các dược chất mới,

các hoạt chất dẫn đường trong công nghiệp dược Theo thống kê, ở

nước ta có gần 4000 loài cây làm thuốc Nguồn tài nguyên thực vật và

cây thuốc này là cơ sở để nghiên cứu và phát triển các dược chất nếu

được có giá trị cao, thuốc và thực phẩm chức năng phục vụ cuộc sống

của nhân dân

Việc hợp tác nghiên cứu với các nhà khoa học Hàn quốc, nơi có

nhiều thế mạnh và kinh nghiệm nghiên cứu tác dụng sinh học định

hướng đích phân tử, sẽ góp phần nhanh chóng làm rõ tác dụng sinh học

của thực vật và cây thuốc, phát hiện các hoạt chất từ nguồn tài nguyên

thực vật Việt Nam, tạo cơ sở khoa học cho việc khai thác, phát triển và

sử dụng có hiệu quả nguồn tài nguyên thực vật của nước ta

Báo cáo tổng hợp này đề cập đến:

+ Các kết quả về thu mẫu thực vật và hoạt tính của các dịch chiết, phân đoạn và các hợp chất thiên nhiên trên 5 phép thử sinh học

PHẦN 1: TỔNG QUAN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ CÁC PHÉP THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC SỬ DỤNG TRONG NHIỆM VỤ

Thảo dược đã được sử dụng từ hàng ngàn năm nay trên thế giới cũng như

ở nước ta để phòng và chữa bệnh Cho đến nay thảo dược vẫn là nguồn rất quan trọng trong việc nghiên cứu tìm kiếm các dược chất mới, phát hiện các hoạt chất dẫn đường trong công nghiệp dược Trong hai năm 2001-2002, có đến 25 % các biệt dược bán chạy nhất trên thế giới có nguồn gốc từ tự nhiên

Tỷ lệ này hiện đang tăng lên vì thị trường biệt dược có nguồn gốc từ thực vật đang tăng trưởng mạnh [1]

Ngày nay, cùng với sự phát triển rất nhanh chóng và hiện đại của công nghệ sinh học phân tử, với những khám phá có tính đột biến về hiểu biết ngày càng sâu các chuỗi gen của người; về cơ chế, bản chất, vai trò của các enzym, các tác nhân liên quan đến chu trình tế bào, bao gồm quá trình tạo thành, phát triển, chết đi của các tế bào đang mang lại những ứng dụng quan trọng trong việc nghiên cứu phát triển thuốc mới có tác dụng chữa trị bệnh một cách chọn lọc và hiệu quả Hướng nghiên cứu mới, hiện đại trong việc phòng chống các bệnh hiểm nghèo là điều trị nhắm đích (targeted therapy) Trong điều trị nhắm đích các dược chất có tác dụng tiêu diệt, ức chế và làm chết các enzym, cơ chất và các tế bào bị bệnh lý mà không ảnh hưởng tới các tế bào thông thường khác Vì vậy các bệnh sẽ được chữa trị hiệu quả hơn, không để lại di chứng và tác dụng phụ Các đích (target) mà dược chất tác động tới thông thường được phân loại theo sáu đối tượng như sau: các enzym, các receptor ở bề mặt tế bào, các receptor hormon nhân tế bào, các kênh ion, chất vận chuyển và DNA Các thống kê gần đây (2005) cho thấy có đến 317 dược phẩm đang được bán trên thị trường có tác dụng chữa trị bệnh trên cơ sở ức chế một enzym nào đó Số dược phẩm trên có tác dụng ức chế 71 loại enzym, trong đó có 48 enzym của người, 13 enzym của vi khuẩn, 5 của virus, 4 của nấm và 1 enzym của ký sinh trùng [2]

Chính vì vậy, hướng nghiên cứu hiện đại về nhằm phát hiện các biệt dược mới từ tự nhiên hiện nay là sàng lọc nhắm đích, với các phép thử trên các enzym, protein hoặc yếu tố nhân nào đó đã được nghiên cứu và xác định được vai trò sinh học của chúng Các phép thử theo kiểu này có thể kể đến là nF-κB, CDKs, Wnt, MC3T3-E1, kênh Ca2+ Hơn nữa, các phép thử sinh học chọn lọc phân tử đích nâng cao khả năng loại trừ, hạn chế được các tác dụng độc của các hoạt chất với các tế bào thường, hạn chế các tác dụng phụ của thuốc khi đưa vào sử dụng Ví dụ: enzym GSK-3 (glycogen synthase kinase-3), bao gồm 2 loại GSK-3α và GSK-3β Người ta phát hiện ra rằng GSK-3 có

chức năng liên quan đến sự truyền dẫn tín hiệu ở protein Wnt, đến hoạt động của isulin, đến sự tự chết của tế bào Enzym GSK-3 có cơ chế điều khiển đặc biệt duy nhất đến sự phosphoryl hóa trên protein Ser9, vì vậy các chất ức chế enzym GSK-3 có khả năng ứng dụng để phát triển thành thuốc chữa nhiều loại bệnh ở người như bệnh ung thư, tiểu đường, Alzheimer’s (bệnh hay quên

ở người lớn tuổi) [3]

Các phép thử hoạt tính sinh học hiện đại được thực hiện trong khuôn khổ hợp tác này được chọn trong các phép thử đang được thực hiện tại Khoa Dược, trường Đại học quốc gia Chung Nam và một số cơ sở khoa học mạnh khác của Hàn Quốc Các phép thử này bao gồm phép thử xác định hoạt chất

ức chế “Wnt/β-catenin signlling pathway” với protein Wnt nhằm phát hiện các chất có tác dụng chữa ung thư, với enzym RNase H nhằm phát hiện các chất có tác dụng chống virut HIV, phép thử đặc hiệu trên kênh Canxi (Ca2+)

và tác dụng gây co thắt phát hiện hợp chất chữa bệnh tim mạch, phép thử TOSC nhằm phát hiện hợp chất chống oxy hóa, phép thử độc tính tế bào với các dòng tế bào ung thư và phép thử phát hiện hoạt chất chống loãng xương trên tế bào tạo xương MC3T3-E1 của chuột

1.1 Phép thử sàng lọc, phát hiện hoạt chất chống ung thư

Các phép thử sàng lọc, phát hiện hoạt chất chống ung thư thực hiện trong đề

tài này sử dụng cả các hai loại: phép thử xác định độc tính với các dòng tế bào ung thư và phép thử trên cơ sở đích phân tử (Wnt/ β-catenin signalling pathway)

1.1.1 Phép thử độc tính với các dòng tế bào ung thư

Các dòng tế bào ung thư được sử dụng để xác định độc tính tế bào bao gồm: dòng ung thư gan SK-Hep-1, ung thư vú MCF-7, ung thư máu ở người LH-60, các dòng ung thư ruột kết HCT116, SW480, DLD-1 và LS174T

1.1.2 Phép thử sàng lọc chất ức chế Wnt/β-catenin signaling pathway

Quá trình tạo Wnt/β-catenin (Wnt/β-catenin pathway)

Các protein Wnt, tên Wnt được ghép từ (Wg) từ một loài ruồi không

cánh Drosophila Wingless và gen Int-1 của chuột, là một nhóm protein có vai

trò rất quan trọng trong cả sự phát triển và chết của tế bào [4] Họ các protein Wnt là các protein giàu cystein và cho đến nay chưa được khám phá nhiều Các nghiên cứu sinh học phân tử hiện đại ngày nay đã phát hiện thấy protein Wnt liên quan đến nhiều hoạt động của tế bào như sự sinh trưởng của phôi tế bào, sự biệt hóa, sống và chết của tế bào

Quá trình tạo Wnt được phát hiện lần đầu năm 1982 khi Nusse thấy chúng trong các khối u ung thư của chuột [5] Kể từ đó các nhà khoa học trên thế giới đã phát hiện thấy sự liên quan của “Wnt signaling pathway” đến nhiều loại bệnh như ung thư, tim mạch, lão hóa, tiểu đường, thần kinh và viêm nhiễm

Các protein Wnt có khối lượng phân tử dao động trong khoảng 39-46 kDa và chứa từ 350 đến 400 đơn vị acid amin

Quá trình tạo Wnt hiện nay được phân biệt thành hai dạng: canonical và non-canonical Quá trình canonical-Wnt điều khiển sự phiên mã gen qua β-catenin Người ta đã phát hiện thấy hơn 90 % ung thư ruột kết (colon cancer)

có di căn liên quan đến quá trình tạo canonical-Wnt, thể hiện ở chỗ có sự tạo thành và tích tụ β-catenin trong tế bào ung thư

Các β-catenin là một thành phần chủ yếu trong liên kết giữa hai tế bào

và quá trình Wnt/β-catenin, chúng đóng một vai trò quan trọng trong sự tăng sinh tế bào, hình thành tế bào, tính chất tế bào, quá trình sống và chết của tế bào [4]

Lượng β-catenin nội bào là chìa khoá khống chế quá trình catenin, được điều chỉnh bằng quá trình suy giảm proteasom phụ thuộc phosphoryl hóa Các enzym casein kinase 1 (CK1) và GSK-3β xúc tác liên tục cho quá trình phosphoryl hoá β-catenin ở các protein Ser45, Thr41, Ser33 Đồng thời, các hệ protein/enzym như PKA/GSK-3β, CDK2/cylinE và PKCα phosphoryl hoá các hợp phần chứa Nitơ của β-catenin Vì vậy, trong tế bào bình thường, β-catenin nội bào thường xuyên được duy trì ở mức thấp

Wnt/β-Ung thư ruột kết là một dạng ung thư phổ biến, gây tử vong đứng hàng thứ ba

ở các quốc gia phương Tây Sự di căn trong nhiều loại ung thư ruột kết đã được biết có nguyên nhân do sự phosphoryl hoá các hợp phần chứa Nitơ của β-catenin, dẫn đến sự tích lũy quá nhiều β-catenin [6] Các β-catenin này thâm nhập vào trong nhân tế bào khác, dẫn đến sự hoạt động quá mức của các gen như là cyclin D1, myc, matrix metalloprotein-7 và PPAR-δ, những gen này được biết đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển ung thư đại tràng [7-10] Vì vậy, việc thúc đẩy giảm β-catenin là một phương pháp điều trị tiềm năng trong việc phòng và chống ung thư đại tràng

Hiện nay, ‘Wnt signaling pathway’ đang là đích phân tử tiềm năng trong việc phát hiện các biệt dược mới chống ung thư và các loại bệnh hiểm nghèo khác

1.2 Phép thử chống oxy hóa TOSC

Hiện nay, việc sử dụng các hoạt chất chống oxi hóa có vai trò như là thuốc hoặc thực phẩm chức năng, đang được ngày càng quan tâm nghiên cứu

ở trong và ngoài nước [11-12]

Trong tế bào sinh vật, các tiểu phần oxi hóa hoạt động (Reactive oxygen species – ROS) liên tục được tạo ra theo nhiều con đường và do nhiều loại phản ứng có sự tham gia của các enzym Các tiểu phần oxi hóa hoạt động ROS này có thể bao gồm các anion như superoxide anion (O2⎯), hydrogen peroxide (H2O2), gốc hydroxyl (OH•), gốc peroxyl (ROO•), alkoxyl (RO•), nitric oxide (NO•), thiyl (RS•), peroxinitrite (ONOO ⎯) Các ROS được coi là

có liên quan đến các tổn thương ở tế bào và các quá trình trong đó như gây ra

quá trình peroxy hóa màng lipit, thay đổi DNA, hủy hoại các protein và bất hoạt các hệ enzym

Bởi vậy, vấn đề tìm kiếm, phát hiện các chất chống oxi hóa cũng như phương pháp xác định khả năng chống oxi hóa hiện nay đang được các nhà khoa học quốc tế rất quan tâm

Ngày nay có nhiều phương pháp xác định khả năng và đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của các hợp chất như: ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity), TEAC (Trolox Equivelent Antioxidant Capacity), TRAP (Total Radical-Trapping Antioxidant Parameter), DPPH, DPPH reactivity, LDL, PSC, PCTPA và TOSC (Total Oxyradical Scavenging Capacity)

Phương pháp xác định khả năng loại trừ toàn bộ gốc oxi (TOSC - Total Oxyradical Scavenging Capacity) là một trong số các phương pháp xác định khả năng loại gốc tự do được sử dụng phổ biến hiện nay Phương pháp TOSC

là một phương pháp mới được giới thiệu lần đầu năm 1998 [13] Phương pháp này cho kết quả nhanh và đáng tin cậy để xác định khả năng chống oxi hóa của chất thử hay mô sinh học đối với 3 loại gốc tự do thường gặp, có khả năng gây tổn hại lớn đối với các phân tử sinh học là gốc hydroxyl, peroxyl và peroxynitrite

Cơ sở của phương pháp dựa trên nghiên cứu động học phản ứng của các gốc tự do như *OOR, *OR, *ClO,… hay peroxinitrit (ROS) với axit α-keto-γ-methiolbutyric (KMBA) Về mặt hóa học, các gốc tự do phản ứng với KMBA sinh ra khí etylen Do đó, động học của phản ứng được khảo sát dựa trên lượng khí etylen được giải phóng theo thời gian trong phản ứng hóa học này [14,15]

*OR + CH3S-CH2-CH2-CO-COOH ==> (CH3S)2 + CO2 + CH2=CH2 + ROH

Các ROS thường gặp là *OOR, *OR và –OONO trong đó:

Gốc Peroxy (*OOR) được sinh ra bởi sự phân hủy nhiệt của metylpropionamidin)diclorua (ABAP)

2,2’-azobis(2-Gốc hydroxyl được sinh ra bởi phản ứng Fenton

Gốc peroxy được sinh ra bởi sự phân hủy của etylcacbamit (SIN-1)

3-morpholinosydnonimin-N-Với thiết bị sắc ký khí (GC), khí etylen sinh ra trong phản ứng được định lượng và từ đó xác định được dịch chiết hoặc hoạt chất có tác dụng chống oxy hóa

1.3 Phép thử sàng lọc hoạt chất ức chế trên kênh Ca 2+ và tác dụng co bóp cơ tim

Sự co bóp của các cơ tim động vật có vú được điều khiển bởi một loạt các tác động, nó được bắt đầu bằng hoạt động của dòng ion Ca2+ dạng L (ICa),

nó mở các “cổng” phù hợp để các kênh giải phóng Ca2+ (chủ yếu từ các lớp protein của cơ quan thụ cảm RyRs) của lưới cơ tương Ryanodine receptor (RyRs) bao gồm nhiều kênh giải phóng ion Ca2+, có vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh nồng độ Ca2+ trong các tế bào cơ và không cơ Đối với bệnh tim mạch RyRs quan trọng ở chỗ nó kiểm soát chức năng ở cấp độ phân tử giải phóng Ca2+ từ các lưới cơ tương trong tế bào cơ tim [16-19]

Khi ion Ca2+ được giải phóng ra, tự nó làm bất hoạt kênh Ca2+, và đóng lại quá trình giải phóng Ca2+ Ngoài ra, dòng Ca2+ thông qua kênh Ca2+ đóng

một vai trò chính trong hoạt động đưa máu lên các khoang phía trên của tim, nhờ thế mà điều khiển được nhịp đập và công suất của tim

Chứng rung tâm nhĩ AF là triệu chứng rối loạn tim phổ biến nhất ở người [20] AF có liên quan đến sự thay đổi về điện sinh học, sự điều chỉnh giảm kênh K+ và kênh Ca2+ dạng L [21-23] AF liên quan đến sự mất thăng bằng về lưu lượng máu trong khoang tâm nhĩ, ví dụ những bệnh nhân bị bệnh liên quan đến van tim thì lưu lượng máu quá lớn vượt quá mức cho phép và xuất hiện dòng máu chảy ngược Tuy nhiên, cơ chế tế bào cho chứng rung tâm nhĩ AF vẫn chưa rõ ràng Trong trường hợp này, AF có liên quan đến sự gia tăng Ca2+ từ lưới cơ tương (SR) trong tế bào cơ tâm nhĩ người [24]

Vì những lý do trên kênh Ca2+ dạng L là một đích phân tử rất tiềm năng

để sàng lọc và phát hiện các loại thuốc điều trị các chứng rối loạn tim, cao huyết áp và bệnh tim mạch

1.4 Phép thử chống loãng xương

Bệnh loãng xương hay còn được gọi là thưa xương, xốp xương là tình trạng giảm khối lượng xương Nó là nguyên nhân chính gây nên hiện tượng gẫy xương hay lún các đốt sống Trong cơ thể luôn luôn tồn tại hai quá trình: quá trình tạo xương (do sự phát triển của các tế bào tạo xương osteoblast) và quá trình hủy xương (gây ra bởi các tế bào hủy xương osteoclast) Hai nhóm

tế bào này cạnh tranh nhau liên tục không ngừng nghỉ trong cơ thể động vật sống, kể cả con người [25-28] Sự phát triển của xương chia làm 3 giai đoạn chính: Ở trẻ em (dưới 25 tuổi) quá trình tạo xương chiếm ưu thế sẽ làm xương thay đổi kích thước và tăng trưởng Ở độ tuổi 25-35, quá trình tạo xương gần như cân bằng với quá trình hủy xương, lúc này xương được sửa chữa nhưng không thay đổi về kích thước và không tăng trưởng Ở độ tuổi trên 35, các tế bào sinh xương bị lão hoá quá trình hủy xương chiếm ưu thế, sự hấp thụ canci

và vitamin D ở ruột bị hạn chế, sự suy giảm tất yếu các hormon làm cho quá trinh tạo xương yếu hơn quá trình hủy xương Khi đó xương dần dần mất khối lượng và hình thành bệnh loãng xương Vì vậy, các yếu tố làm giảm quá trình tạo xương như chế độ dinh dưỡng không hợp lý (thiếu protit, thiếu calci hoặc

tỷ lệ calci/phospho không hợp lý, thiếu vitamin D), cao tuổi, ít hoạt động thể lực, phụ nữ sinh đẻ nhiều lần, mắc một số bệnh mãn tính (viêm khớp, thoái hóa khớp, đường ruột ) được coi là những nguyên nhân gây ra bệnh loãng xương Đồng thời các yếu tố có khả năng làm kích thích quá trình tạo xương hay hạn chế sự hủy xương được coi là có tác dụng chống loãng xương (đáng

kể đến là các dẫn chất tự nhiên hay tổng hợp dạng isoflavon)

Theo thống kê, năm 1990, toàn thế giới có khoảng 1,7 triệu trường hợp gãy cổ xương đùi do loãng xương trong đó 31% số này thuộc các nước châu

Á Với tốc độ lan tràn được ví như dịch hiện nay, dự tính đến năm 2050, toàn thế giới sẽ có tới 6,3 triệu trường hợp gãy cổ xương đùi do loãng xương, và

51% số này thuộc các nước châu Á Hàng năm, chi phí cho điều trị loãng xương ở các nước phát triển không ngừng tăng lên Chỉ trong vòng 12 năm, chi phí này đã tăng gấp 3,5 lần (5,1 tỷ USD năm 1986 và 18 tỷ USD năm 1998) Theo thông báo của Liên đoàn chống bệnh loãng xương thế giới (IOF), hiện nay, chi phí cho bệnh loãng xương tương đương với chi phí cho bệnh tiểu đường và lớn hơn chi phí cho cả hai bệnh ung thư thường gặp nhất ở phụ

nữ cộng lại (ung thư vú và ung thư tử cung) Chi phí lớn nhất là để điều trị biến chứng gãy xương, đặc biệt là gãy cổ xương đùi Do đó, bệnh loãng xương đang được coi là một trong những bệnh lan rộng khắp thế giới, ngày càng có xu hướng gia tăng và trở thành gánh nặng cho y tế cộng đồng

Hiện nay thuốc điều trị loãng xương có thể chia làm hai nhóm theo cơ chế tác dụng của chúng:

• Các thuốc chống hủy xương (các thuốc ngăn chặn sự hủy xương bằng cách ức chế hoạt tính của hủy cốt bào- anti-resorptive)

• Các thuốc tăng đồng hóa (các thuốc kích thích sự tạo xương bằng

cách tác động chủ yếu lên tạo cốt – anabolic agents)

Các thuốc điều trị loãng xương hiện tại như Vitamin D (Calciferol, Calderol), Ibandronate (Boniva), HRT (Premarin, Estriol), Fluoride (Neutracare), Strotium (Metastron) có các công năng hoặc là chống hủy xương, tăng biphophonate, hoặc tăng tạo xương Trong đó nhóm dược chất tăng tạo xương số lượng còn rất khiêm tốn và đang được đẩy mạnh nghiên cứu hiện nay

Y học hiện đại đã chứng minh loãng xương liên quan đến sự thiếu hụt estrogen là nguyên nhân quan trọng gây ra bệnh loãng xương ở người cao tuổi Phương pháp hocmon trị liệu (HRT) có thể chữa được nhiều rối loạn sau mãn kinh, bao gồm cả loãng xương Tuy vậy, hocmon trị liệu (HRT) khi dùng lâu dài có thể gây ra ung thư vú và tử cung

Việc nghiên cứu quá trình tạo xương được đánh giá qua các chỉ số sinh hóa phản ánh mức độ tạo xương (bone formatrion makers) như mật độ xương (calcium deposition), alkaline phosphatase (ALP), mật độ collagen (collagen content)

Nghiên cứu tác dụng tạo xương trên in vitro hiện nay người ta sử dụng

tế bào tiền tạo xương MC3T3-E1 Tế bào này có thể biệt hóa thành tế bào tạo xương (osteoblast), làm tăng mức độ chuyển hóa xương Đánh giá tác dụng của hoạt chất lên tế bào tiền tạo xương MC3T3-E1 được thực hiện qua việc đánh giá khả năng làm tăng hoạt độ của enzym alkaline phosphatase (ALP activity), khả năng tạo khoáng (mineraliration) qua đo mật độ canxi (calcium deposition) [29]

Nhiều cây thuốc dân gian có tác dụng chống loãng xương như cây Cẩu

tích (Cibotium baromet J Sm., họ Kim mao Dicksoniaceae) Những nghiên

cứu gần đây cho thấy, một số dịch chiết thực vật như dịch chiết etanol của cây đậu tương (E.M., Phytochem 2001, 56, 733), dịch chiết củ của cây

Atractylodes japonica Koidz [30], hay các hợp chất phân lập thiên nhiên như

các flavonoit Apigenin, Luteonin [31] có khả năng sử dụng trong hỗ trợ

điều trị bệnh loãng xương Các nghiên cứu invitro cho thấy một số dịch chiết

hay hợp chất có tác dụng kích thích sự phát triển của các tế bào sinh xương, cũng như kích thích một số quá trình phát triển trong chu trình tạo xương chẳng hạn như kích thích sự tổng hợp collagen, tăng quá trình hấp thụ photpho, calxi và do đó có tác dụng ngăn ngừa bệnh loãng xương

1.5 Phép thử với enzym Rnase H phát hiện chất kháng virut

Virus HIV-1 là virus gây suy giảm miễn dịch gây lên hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) ở người Các đích lý tưởng cho việc điều trị AIDS là ức chế sự phiên mã của HIV bao gồm hai loại enzym chính, phiên

mã ngược (reverse trancriptase – RT) và protease [32] Enzym phiên mã ngược (reverse trancriptase – RT) của HIV có vai trò quan trọng trong chu trình sống của virut và hiện nay là một đích tác dụng quan trọng của các biện pháp hóa trị liệu bệnh AIDS Enzym này là enzym đa chức năng, điều khiển không chỉ phiên mã ngược RT (polymerase DNA phụ thuộc DNA, RDDP)

mà còn hoạt tính của các polymerase DNA (DDDP) và đến hoạt động của ribonucleic H (RNase H) Chức năng polyme hóa DNA cùng với chức năng của enzym RNase H có liên quan đến sự chuyển hóa từ RNA đến trạng thái DNA của virut Các hoạt chất ức chế mỗi loại chức năng này có tác dụng ngăn chặn sự phát triển của virut

Nhiều dược chất trị HIV hiện nay có cơ chế tác dụng ức chế Rnase H, đến quá trình phiên mã ngược, ví dụ như zidovudine (AZT), zalcitabin (ddC)

và các dẫn xuất nucleosit Các hợp chất các tác dụng kháng enzym Rnase H

có thể phát triển thành thuốc chống virut HIV và trị bệnh AIDS

Cơ sở của phương pháp: các tế bào nhiễm virut (ví dụ tế bào MT-4 nhiễm virut HIV-1) được nuôi cấy và đo mức độ ức chế suy giảm RNA của

tế bào và được so sánh với chất đối chứng dương [33] Do đối tượng thử là các tế bào nhiễm virut nên việc thử nghiệm đòi hỏi có các phòng thí nghiệm

có độ an toàn cao, tránh tuyệt đối lây nhiễm môi trường xung quanh

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Phương pháp thu thập mẫu, giám định tên phân loại, xử lý mẫu và

tạo dịch chiết

2.1.1 Phương pháp thu thập mẫu, giám định tên phân loại

ƒ Phương pháp thu thập mẫu thực vật tuân thủ theo các phương pháp, yêu cầu về thực vật học để tiện cho lưu trữ, phân loại và giám định thực vật Các mâu đều có các thông tin về địa điểm, tên thông thường, sử dụng dân gian, bộ phận thu, ảnh mẫu….)

ƒ Các mẫu thực vật thu được giám định tên phân loài theo các tiêu chuẩn phân loại thực vật

ƒ Tạo tiêu bản mẫu Các tiêu bản được lưu giữ trong kho bảo quản, để đảm bảo mẫu không bị hỏng và mất tiêu bản, tiện cho việc tra cứu và tìm thông tin sau này

ƒ Lập bảng lý lịch mẫu, gồm số thứ tự: ví dụ C-389, họ, tên khoa học, lá, khối lượng khô, Tỉnh, Xã, ngày thu, ghi chú

Bước 1: Chuẩn bị mẫu, phơi khô và sấy khô

Bước 2: Cân mẫu và xay mẫu

Bước 3: lựa chọn dung môi chiết mẫu

Bước 4: Mẫu được chiết bằng dung môi lựa chọn Trên thiết bị siêu âm Powersonic (405, 220W) ở nhiệt độ 400C, thời gian 30 phút

Bước 5: Dịch chiết được lọc qua giấy lọc (Whatman, d=240 nm,

No 1) gộp lại và tiến hành cất loại dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ

400C, thu được dịch cao

2.2 Phương pháp hóa học

2.2.1 Phương pháp phân lập

+ Sắc ký lớp mỏng (TLC) Sắc ký lớp mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merch, 1,05715), RP18 F254s (Merck)

+ Sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột được tiến hành với các chât hấp phụ khác nhau: silica gel pha thuận (0.04-0.063 mm, Merk), silica gel pha đảo YMC, dianion HP-20, Sephadex-LH-20

2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học

Cấu trúc hoá học của các hợp chất phân lập ra được xác định bằng cách kết hợp các phương pháp vật lý và hoá học, sử dụng các phương pháp phổ như: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều

• Phổ khối lượng APCI-MS

Phổ khối lượng được ghi trên máy LC-MSD-Trap-SL Agilent 1100 series của Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR): 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT 135, DEPT 90 và phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D - NMR): HMQC, HMBC, COSY, NOESY được đo trên máy Bruker AVANCE 500 hoặc 400 MHz Dùng TMS làm chất chuẩn nội

2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học in vitro tại Hàn Quốc

2.3.1 Phương pháp thử hoạt tính chống ung thư

2.3.1.1 Phương pháp thử chống ung thư trên hai dòng tế bào ung thư phổi SK-Hep-1 và dòng ung thư vú MCF-7

Phương pháp cho kết quả được biểu diễn bằng giá trị CI (%) đánh giá khả năng chống ung thư của hoạt chất Phương pháp được miêu tả như sau:

• Pha mẫu

Các chất thử được pha trong DMSO ở 3 nồng độ 0.3, 3, 30 µg/ml

• Nuôi cấy tế bào

Hai dòng tế bào SK-Hep-1 và MCF-7 được nuôi cấy trong môi trường RPMI

640 và được bổ sung 10% huyết thanh bê non (GIBCO, Grand Island, NY), natri bicacbonat, penicillin G và streptomycin ở nhiệt độ 370Ctrong môi trường không khí ẩm chứa 5% CO2

• Thử nghiệm

Tế bào ung thư ( nồng độ 4x104 tế bào/mL) được đưa vào bản 96 giếng, mỗi giếng 180 µL và được để qua đêm Mẫu thử được đưa vào giếng Sau 72 h, loại bỏ môi trường và giữ nguyên các tế bào trong mỗi giếng, cố định dùng 10% trichloroacetic acid (TAC) trong 1h ở 4oC Tế bào đã loại TAC được rửa

với nước và sau làm khô trong không khí Tiếp theo, dung dịch SRB 50µM (0.4% axit acetic) được cho thêm vào trong điều kiện nhiệt độ phòng Sau 1h được phun rửa 3-4 lần với axit acetic 1% và để khô trong không khí Chất nhuộm phân cực được hòa tan trong bazo Tris (100 µL của 10mL) Các bản được đọc mật độ quang ở bước sóng 520 nm.OD được sử dụng làm chất đối chứng chuẩn

• Chỉ số độc tính (CI%) được tính toán theo phương trình:

% 100 1

% = ⎢⎣ ⎡ − ⎥⎦⎤⋅

C

T CI

Trong đó: T, C là mật độ quang của mẫu thử và mẫu trắng tương ứng

2.3.1.1 Phép thử sàng lọc chất ức chế ‘Wnt/β-catenin signaling pathway’

• Nguyên liệu và hóa chất:

Các tế bào HEK293, HCT-116, SW480, DDL-1, LS174T và Wnt3a được mua

từ hãng American Type Culture Collection và duy trì trong DMEM chứa 10% FBS huyết tương bò (fetal bovine serum), 120µg/ml penisilin, và 200µg/ml streptomycin Việc các tế bào HEK293 (TOPFlash), chất chuẩn (FOPFlash),

và tế bào chỉ thị HEK293 (SEAP) được chuẩn bị như tài liệu đã được công bố [19, 20] Môi trường nuôi cấy Wnt3a (Wnt3a-CM) được chuẩn bị như tài liệu [21] Phép thử Luciferase được thực hiện với kít thử Dual Luciferase Assay Kit (promega) Phép thử sự tiết của enzym alkaline phosphatase được thực hiện với kít sinh học Phospha-Light Assay của hãng Applied Biosystems LiCl và MG-132 được mua từ Sigma-Aldrich

• Thực hiện:

Tế bào HEK293 (TOPFlash) trong môi trường nuôi cấy được cho vào bản 96 giếng với nồng độ 15,000 tế bào/giếng và để phát triển trong 24 h (lặp lại hai lần) Sau đó, Wnt3a-CM được thêm vào Cuối cùng các hợp chất tự nhiên đã pha sẵn được cho vào mỗi giếng

2.3.2 Phương pháp thử hoạt tính chống oxi hóa

2.3.2.1 Cơ sở của phương pháp:

Phương pháp thử hoạt tính chống oxi hóa dựa trên phép thử xác định

khả năng trung hòa gốc oxi tự do tổng số (Total Oxyradical Scavenging Capacity – TOSC) Phương pháp thử TOSC là phương pháp mới, được nghiên cứu và phát triển bởi nhóm tác giả Regoli và Winston từ năm 1998

2.3.2.2 Hóa chất thiết bị

• Hóa chất (áp dụng với gốc peroxyl, hydroxyl và peroxynitrite)

α-keto-γ-methiolbutyric acid (KMBA); diethylenetriamine-pentaacetic

acid (DTPA); 3-morpholinosydnonimine N-ethylcarbamide (SIN-1);

2,2’-azobis(2-metylpropionamidin)diclorua (ABAP); FeSO4.(NH4)2SO4.6H2O, axit ascorbic, Etylendiamintetraaxetatic (EDTA), chất chuẩn Trolox sử dụng như một positive control

ABAP(M=271.19) 0.2712 g + nước cất -> 5 ml

- 700 uM SIN-1

SIN-1(M=206.6) 0.0014462 g + nước cất -> 10 ml

- 30 uM Fe

Ferrous ammonium sulfate 0.0118 g + nước cất -> 10 ml

Pha loãng 100 lần (100µl + nước cất 9900µl)

- 60 uM EDTA

EDTA(M=372.24, hydrate) 0.0223344 g + nước cất -> 10 ml

Pha loãng 100 lần (100µl + nước cất 9900µl)

2.3.2.4 Xử lý số liệu và tính toán giá trị TOSC

Giá trị TOSC được tính theo công thức:

100 CA

SA 100

Với SA: diện tích píc etylen nhận được trong trường hợp có mẫu thử

CA: diện tích píc etylen nhận được trong trường hợp mẫu trắng

Giá trị specific TOSC được tính theo công thức:

nt]

[antioxida

TOSC al experiment TOSC

specific =Giá trị so sánh TOSC được tính theo công thức:

(Trolox) TOSC

Specific

(sample) TOSC

Specific cTOSC =

2.3.3 Phương pháp thử hoạt tính chống bệnh tim mạch

Phép thử sàng lọc các hoạt chất điều trị tim mạch được đánh giá khá đắt tiền và hiện đại Bao gồm phép thử trên kênh Ca2+ và phép thử chống co thắt (contraction)

Các dịch chiết thực vật và hoạt chất được đánh giá tác động lên kênh ICa và sự co bóp của cơ tim chuột Đồng thời, cơ chế gây lên chứng rung tâm nhĩ cũng được nghiên cứu cả ở mức độ phân tử và tế bào Ở đây đã sử dụng một hệ thiết bị tinh vi được thiết kế để nghiên cứu tác động lên từng tế bào tâm nhĩ Thiết bị như một động cơ tạo áp lực máu với các tùy chọn như áp

suất, lưu lượng, thời gian, điển hình, đặc trưng cho nhiều triệu chứng trong bệnh tim nhằm nghiên cứu tác dụng của các dịch chiết, hoạt chất lên tế bào cơ tim Kết hợp phương pháp mô phỏng này cùng với hình ảnh các điểm Ca2+ gây ra bởi sự đập tự phát của các tế bào tâm nhĩ trưởng thành HL-1 để xác định tác dụng đến kênh Ca2+

2.3.4 Phương pháp thử hoạt tính chống loãng xương

2.3.4.1 Cơ sở của phương pháp

Phép thử sàng lọc các hoạt chất chống loãng xương dựa trên việc đánh giá tác dụng của các dịch chiết, hoạt chất đến tế bào tạo xương MC3T3-E1 của chuột được dùng làm đích nghiên cứu Trong đó khả năng sống của tế bào, quá trình tạo collagen, quá trình tạo khoáng và hoạt tính phosphoryl hóa của

tế bào được thử nghiệm, đánh giá Phép thử cho kết quả giá trị % điều chỉnh với chất chuẩn (% of control) ở các nồng độ 0.3µg/ml, 3µg/ml và 30µg/ml dùng đánh giá khả năng trong điều trị bệnh loãng xương

2.3.4.2 Thực nghiệm

• Nuôi cấy tế bào

Các tế bào sinh xương của chuột (MC3T3-E1) được nuôi cấy ở 37oC, trong điều kiện không khí chứa 5% CO2, môi trường nuôi cấy tối thiểu α (α-MEM)

có chứa 10% huyết thanh bào thai bê (FBS), penicilin (100 U/ml) và streptomicin (100 µg/ml) Sau khi đông tụ, các tế bào tiếp tục được nuôi cấy

trong môi trường 0,02% EDTA-0.05% trypsin

• Khảo sát khả năng sống, tăng trưởng của tế bào

Thêm môi trường 10% FBS vào trong các dịch tế bào MC3T3-E1 sau khi đã nuôi cấy để được huyền phù tế bào Chia huyền phù tế bào nhận được vào các giếng thử trên đĩa ELISA 48 giếng (mỗi giếng chứa khoảng 5x103 tế bào), cho mẫu nghiên cứu vào và ủ ở 37oC, trong điều kiện không khí chứa CO2 trong 48 giờ Gạn bỏ môi trường nuôi cấy và rửa tế bào bằng dung dịch đệm phosphat (độ pH= 7,4) Tiếp tục đưa các giếng thử vào buồng ủ ở 37oC,

độ ẩm 5%, không khí chứa CO2 trong vòng 48 giờ Cuối cùng, các tế bào sống sót được đếm theo phương pháp MTT

Thêm vào mỗi giếng 20 µl dung dịch MTT (5mg/mL) trong dung dịch đệm phosphat, độ pH=6,5 (7,2 mM) và đem ủ thêm 2 giờ Loại bỏ môi trường

và bổ sung dimetyl sulfoxit vào mỗi giếng, lắc 5 phút để hòa tan sản phẩm formazan Đo độ hấp thụ của mỗi giếng trên máy đo quang Microplate Spectrophotometer tại bước sóng 570 nm

• Xác định khả năng tổng hợp collagen

Các tế bào (có độ đông tụ 90%) được nuôi cấy trong môi trường có chứa

10 mM β-glyxerophosphat và 50 µg/ml axit ascorbic Trong thời gian 8 ngày nuôi cấy, môi trường liên tục được thay mới 2-3 ngày/lần Sau đó, các tế bào tiếp tục được nuôi cấy trong môi trường có chứa 0,3% BSA và mẫu thử nghiệm trong 2 ngày Cuối cùng, gạn bỏ môi trường nhận được các tế bào đơn

lớp Các tế bào sinh xương sau khi nuôi cấy, rửa với PBS được hãm trong chất lưu Bouin trong 1 giờ Sau đó, loại bỏ chất lưu, rửa đĩa nuôi cấy dưới vòi nước chảy trong 15 phút và để khô ngoài không khí Tiếp đó, các đĩa nuôi cấy được nhuộm bằng cách lắc nhẹ với chất nhuộm Sirius Red trong 1 giờ Gạn

bỏ phần dịch, rửa tiếp bằng dung dịch HCl 0,01N để loại bỏ phần không bắt màu Phần đã được nhuộm màu sau đó được hòa tan trong NaOH 0,1N và đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 550 nm

• Xác định hoạt tính của enzym phosphat kiềm (ALP activity)

Các tế bào (có độ đông tụ 90%) được nuôi cấy trong môi trường có chứa

10 mM β-glycerophosphate và 50 µg/ml axit ascorbic Trong thời gian 8 ngày nuôi cấy, môi trường liên tục được thay mới 2-3 ngày/lần Rửa các tế bào 2 lần bằng PBS và đếm, tính số lượng các tế bào sống sót trên kính hiển vi Các

tế bào sau đó được xử lý với 0,2% Triton X-100 và đem li tâm với tốc độ

14000 vòng/phút trong 5 phút Gạn lấy phần lớp phía trên đem đo hoạt độ ALP trên máy đo hoạt độ ALP (Asan Co Korea)

• Đánh giá độ tạo khoáng Canxi

Các tế bào (có độ đông tụ 90%) được xử lý với môi trường nuôi cấy có chứa 10 mM β-glycerophosphat và 50 µg/ml axit ascorbic Sau 12 ngày, các

tế bào tiếp tục được nuôi cấy với môi trường có chứa 0,3% BSA và mẫu nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau trong 2 ngày Cuối cùng, các tế bào được hãm với etanol 70% trong 1 giờ, nhuộm bằng Alizarin Red S 40mM trong 10 phút Phần tế bào bắt chất nhuộm màu được hòa tan trong cetylpyridinum chloride 10% bằng cách lắc nhẹ trong 15 phút Đo độ hấp thụ ở bước sóng

–Alu-Ala-Nle-2.3.5.3 Enzym

Enzym phiên mã ngược HIV-1 được mua từ Eiken Chemical Co.Lld (Osaka, Japan) Enzym HIV-1 PR được tổ hợp theo phương pháp Kusumoto (1992)

2.3.5.4 Tế bào

Virut HIV-1 được tiêm vào dòng tế bào MT-4 được duy trì ở 370C dưới điều kiện 5% CO2 trong môi trường RPMI-1640 (Flow Laboratories, Irvine, Scotland) được bổ sung 10% tế bào thai (FCS, Flow laboratories, North Ryde, Australia) và 100µg/mL enzym streptomycin (Meiji Seika, Tokyo, Japan) và 100µg/mL của enzym penicillin G (Banyu Pharmaceutical, Tokyo, Japan)

2.3.5.5 Phương pháp thử RNase H

Đối với phép thử trên enzym HIV-1-RT-liên kết với RNase H (Loya và Hizi 1993) enzym phiên mã ngược HIV-1 được điều chỉnh ở mức 2.5 unit/µL với mỗi một dung dịch 50mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5mM KCl, 8mM MgCl2 and 2.5 mM DTT, 7.2 nM of [3H] poly (rA) poly(rA)poly(dT)(370 KBq/mL) được giữ ở điều kiện 370C trong 5 phút Hỗn hợp phản ứng được ủ trong 2h ở nhiệt độ 370 C Phản ứng đối chứng được tiến hành trong cùng điều kiện, thêm các enzym và điều chỉnh phản ứng chạy với mẫu Phản ứng kết thúc xong, được cho thêm 20 µL dung dịch EDTA0.02 M Hỗn hợp được rửa với cách thức giống như được mô tả bên trên Đĩa giấy sau khi làm khô và tiến hành các hoạt động đo khả năng ức chế enzym suy giảm của RNA trong một lai hóa có sự tính toán thực nghiệm như sau:

Khả năng ức chế (%)=[1-(dpm blank-dpm comp)]/(dpm blank-dpm cont).100%

Illiaquinone được sử dụng như một chuẩn dương, chất này ức chế enzym RNase H ở giá trị IC50 = 50 µM

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THU, TẠO DỊCH CHIẾT THỰC VẬT 3.1 Thu mẫu thực vật

Việc định hướng mẫu thực vật cần thu để nghiên cứu hóa học và sàng lọc hoạt tính sinh học được dựa trên các căn cứ sau: sự sẵn có của thực vật tại thời điểm, địa điểm thu hái, kinh nghiêm sử dụng thuốc dân gian, các điều tra

tư liệu về hóa học và dược học, tính đặc hữu và các yếu tố sinh thái thực vật Tổng cộng nhiệm vụ đã tổ chức 12 lượt đi thực địa tại các địa phương: Sapa, Lào Cai, Tam Đảo, Hòa Bình, Cát Bà, Hải Dương và các tỉnh khác, nhằm khảo sát và thu thập các mẫu thực vật quan tâm

Chúng tôi đã thu được 481 mẫu bộ phận thực vật của 413 cây thực vật tại các thời điểm khác nhau, đã xác định được tên khoa học của 400 mẫu thực vật Các mẫu thực vật đã thu thuộc 103 họ, 232 chi, 339 loài Phân loại các mẫu thực vật đã thu được trình bày trong bảng 3.1 dưới đây:

Bảng 3.1: Kết quả thu mẫu thực vật theo họ, chi