Nghiên cứu quy trình chiết tách pectin từ lá sương sâm

Những nghiên cứu về thành phần pectin trong lá sương sâm, khả năng chiết tách và sử dụng pectin của lá sương sâm còn rất ít, đặc biệt là lá sương sâm của vùng MiềnTrung.. Xuất phát từ nh

MỞ ĐẦU 1.Tính cấp thiết của đề tài

Để đáp ứng sự phát triển và đa dạng hoá sản phẩm cho ngành công nghiệp thựcphẩm, chất phụ gia là thành phần chiếm một phần rất quan trọng Trong số đó, pectin

là loại phụ gia tạo cấu trúc hàng đầu trong thực phẩm Ngoài khả năng tạo gel nổi bật,pectin còn là một chất tạo đặc, tạo nhũ tương và ổn định rất hiệu quả Vì thế việcnghiên cứu về pectin từ các nguồn nguyên liệu mới sẽ tạo nên cơ sở dữ liệu quan trọngrất hữu ích phục vụ cho quá trình khai thác, ứng dụng pectin vào các ngành côngnghiệp, đặc biệt là công nghiệp thực phẩm

Pectin là một hợp chất tự nhiên có mặt trong thành phần cấu tạo màng tế bào củacác loài thực vật bậc cao, phân bố chủ yếu ở các bộ phận như quả, củ, lá, thân Trongmàng tế bào, pectin có mặt ở phiến giữa (với hàm lượng cao nhất) và ở vách tế bào sơcấp

Cây sương sâm (Cissampelos pareira L var hirsute) thuộc loại dây leo, có thân và

lá phủ lông mềm, phân bố nhiều ở các tỉnh Nam Bộ Người dân ở các vùng này thườngdùng lá sương sâm như là rau để ăn, hoặc chế biến ra thực phẩm dạng gel Thực phẩmdạng gel được chế biến từ lá sương sâm có tính mát, công năng nhuận tràng, hạ nhiệt

độ cơ thể, giải độc….mang lại sức khỏe tốt cho người sử dụng

Những nghiên cứu về thành phần pectin trong lá sương sâm, khả năng chiết tách và

sử dụng pectin của lá sương sâm còn rất ít, đặc biệt là lá sương sâm của vùng MiềnTrung Xuất phát từ những vấn đề trên, nhóm nghiên cứu chúng tôi đã chọn đề tàinghiên cứu của mình là:

“Tối ưu hóa quá trình chiết tách pectin từ lá sương sâm”

2.Mục đích nghiên cứu

Mục đích chính của nghiên cứu là tìm ra quy trình chiết tách pectin từ lá sươngsâm với hiệu quả cao nhất và xác định một số tính chất của pectin để từ đó làm cơ sởcho nghiên cứu và ứng dụng pectin trong thực tiễn

GVHD: TH.S Ngô Thị Minh Phương Trang 1 SVTH: Phạm Duy Phúc

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Lá sương sâm (Cissampelos pareira L var hirsuta) được thu hái ở huyện Đại Lộc,

tỉnh Quảng Nam

2.2 Phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu trên nguồn nguyên liệu tại huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam.

- Nghiên cứu chiết tách pectin từ lá sương sâm.

- Xác định các tính chất của pectin chiết tách.

3.Phương pháp nghiên cứu

Các phương pháp này được trình bày cụ thể trong chương 2 (Đối tượng và phương pháp nghiên cứu).

3.1 Phương pháp vật lý

Xác định hàm lượng nước trong lá sương sâm

3.2 Phương pháp hóa sinh

- Xác định hàm lượng đường khử trong lá sương sâm

- Xác định hàm lượng xơ trong lá sương sâm

- Xác định hàm lượng protein trong lá sương sâm

- Xác định hàm lượng pectin tổng trong lá sương sâm

- Xác định chỉ số DE của pectin thô

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

4.1 Ý nghĩa khoa học

- Xác định được một số thành phần hóa học của lá sương sâm

- Xác định một số yếu tố công nghệ trong quá trình chiết tách để thu nhận pectin vớihiệu suất cao

thực phẩm trên thị trường.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cây sương sâm

1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố

1.1.1.1 Đặc điểm thực vật của cây sương sâm

Cây sương sâm có tên khoa học là Cissampelos pareira L var hirsuta Tên dân gian là Dây sâm lông, thuộc họ Menispermaceae (Họ Tiết Dê).

Hình 1.1 Cây sương sâm [2].

Cây sương sâm là loài dây leo mảnh, dài 3-4 m

- Thân: thân mảnh, có tua cuốn, leo bám vào cây khô hoặc cây tươi

- Lá: Lá có phiến xoan dài 6-11cm, rộng 2-4cm, gân ở gốc 3-5, gân phụ 2-3 cặp, cuống dài 5-20 mm

- Hoa: Cụm hoa ở nách lá hay ở thân già, có lông mịn, hoa đực màu vàng, hoa cái có 6 cánh hoa, 8-9 lá noãn

- Quả: Quả hạch đỏ, dài 7-10mm, rộng 6-7mm Mùa hoa quả từ tháng 6 đến tháng 12

1.1.1.2 Đặc điểm phân bố

GVHD: TH.S Ngô Thị Minh Phương Trang 3 SVTH: Phạm Duy Phúc

Dây Sương sâm thường mọc trong rừng, trên núi đá vôi, tới độ cao 300m Ở TháiLan dây sương sâm được gọi là “bai ya nang”, “yanang” hoặc “ya nang” Ở Lào gọi là

“bai yanang”

Ở Việt Nam loài dây leo này mọc hoang dại hoặc được trồng ở khắp cả nước từNam ra Bắc và được dùng làm thạch giải khát gọi là “Sương sâm” Do dể trồng và chếbiến lá tươi dùng ngay nên được trồng và sử dụng ở khắp mọi vùng nông thôn, nhất là

ở Nam Bộ

Lưu ý! Ở Trung Quốc và vùng Đông Nam Á còn có một loài dây leo có tên khoahọc là Cyclea barbata (Wall.) được gọi là sương sâm rừng hay sương xâm lông có láhình quả tim cũng có tác dụng làm thức uống và làm thuốc như cây sương sâm trơn.Loài này phân bố rộng hơn loài xương sâm trơn

1.1.2 Tính dược lý của cây sương sâm

Lá sương sâm có tính mát, công năng nhuận tràng, hạ nhiệt độ cơ thể, có tính giảiđộc Người bệnh đái đường nên ăn loại này cho lợi tiểu Trong rễ sương sâm cóalcaloid tetrandrin, isochondrodendrin, homoaromalin, linacin, magnotlorin,protoquecitol, curin Rễ sương sâm có vị đắng, tính hàn, có tác dụng giải độc, giảmđau, tan ứ, lợi tiểu, giải nhiệt, nhuận trường nhẹ

1.1.3 Ứng dụng của cây sương sâm trong đời sống và công nghiệp

Trong dân gian lá cây sương sâm được dùng chế biến làm thạch giải khát Ở cácnước Đông Dương đều dùng lá sương sâm (kể cả lá non và lá già) vò nát, vắt lấy nước,lọc bỏ xác, nhựa của lá sẽ hút nước và trương lên thành một dạng thạch màu xanh lácây, được pha với đường và nước đá làm món uống giải khát khi trời nóng bức

Loại thức uống sương sâm này được người Thái gọi là “kaeng no mai som” hay

“kaeng Lao” Người Lào gọi là “nam yanang”

Ở Campuchia, người ta dùng lá để ăn với món lẩu bún Samlo Lá cây xương sâmđược sử dụng như là một thành phần trong món canh chua được gọi là samlar Machu.Người dân tộc ở Lào và Đông Bắc Thái Lan dùng lá sương sâm nấu món canh chuaGVHD: TH.S Ngô Thị Minh Phương Trang 4 SVTH: Phạm Duy Phúc

với măng, ớt, muối, giấm và đôi khi với nấm bào ngư, nấm rơm…

Trong y dược cây sương sâm với tác dụng chống sốt rét, chống viêm, lợi tiểu, giảinhiệt, nhuận trường nhẹ Ở Campuchia, người ta dùng lá sương sâm phối hợp với các

vị thuốc khác để chế biến thành thuốc để điều trị bệnh lỵ

1.2 Tổng quan về pectin

1.2.1 Khái niệm

Pectin là polysaccharide phức tạp có chứa ít nhất 65% acid galacturonic được liênkết với nhau bằng liên kết α-l,4-glycoside, trong đó một số gốc -COOH được methoxylhóa -CH30

Hình 1.2 Acid D –galactoronic đơn vị cấu tạo chủ yếu của pectin [2].

Hình 1.3 Cấu tạo pectin [2].

Những nghiên cứu mới về cấu trúc phân tử pectin cho thấy pectin có hai vùngcấu tạo chính là vùng suôn thẳng (smooth regions) chiếm khoảng 60 - 90% khối lượng,

và vùng rậm (hairy regions) chiếm 10 - 40% khối lượng

Pectin là một hợp chất tự nhiên có nhiều trong màng tế bào của các loài thực vật

GVHD: TH.S Ngô Thị Minh Phương Trang 5 SVTH: Phạm Duy Phúc

bậc cao, phân bố chủ yếu ở các bộ phận như quả, củ, thân.

Trong màng tế bào, pectin có mặt ở phiến giữa (với hàm lượng cao nhất) vàvách tế bào sơ cấp

Hình 1.4 Pectin trong cấu tạo của thành tế bào thực vật[2].

Trong thực vật, pectin tồn tại ở hai dạng:

- Protopectin: Là dạng không tan, chủ yếu ở thành tế bào

- Pectin hòa tan: tồn tại chủ yếu ở dịch tế bào

- Phân tử lượng của các loại pectin tách từ các nguồn quả khác nhau thay đổi trong giớihạn rộng 25000 – 50000 Dvc

Pectin được đặc trưng bởi các chỉ số:

- Chỉ số methoxyl (MI): biểu hiện mức độ methyl hóa, là phần trăm khối lượng nhóm

methoxyl (-OCH3) trên tống khối lượng phân tử

- Chỉ số ester hóa (DE): thể hiện mức độ ester hóa của pectin, là tỉ lệ phần trăm về số

lượng của các gốc acid galactoronic được ester hóa trên tổng số lượng gốc acidgalacturonic có trong phân tử

1.2.2 Phân loại Pectin

Hiệp hội hóa học Mỹ (American Chemical Society) phân loại các hợp chất pectinthành 3 loại: Acid pectic, Acid pectinic, Pectin (Polygalacturonate)

Dựa trên mức độ este hóa, trong thương mại chia pectin thành 2 loại:

- Pectin methoxyl hóa cao (High Methoxyl Pectin - HMP): DE > 50%

- Pectin methoxyl hóa thấp (Low Methoxyl Pectin - LMP): DE < 50 %

GVHD: TH.S Ngô Thị Minh Phương Trang 6 SVTH: Phạm Duy Phúc

- Mã hiệu quốc tế của pectin là E440.

- Pectin tinh chế có dạng bột màu trắng, màu xám nhạt.

- Là chất tạo keo hút nước và rất dễ tan trong nước, không tan trong ethanol.

- Khả năng tạo gel và tạo đông, khi có mặt acid và đường.

- Pectin tự do mất khả năng tạo đông khi có mặt đường Vì vậy để duy trì khả năng tạo gel của pectin hòa tan cần chú ý tránh môi trường kiềm hoặc tác dụng thủy phân của enzyme pectinase để thủy phân pectin, giảm độ nhớt.

- Còn đối với pectin hòa tan thì dưới tác dụng của enzyme pectinase sẽ biến thành acid pectinic (thường dưới dạng muối Ca và Mg) và các chất đơn giản khác như rượu methylic, acid acetic, arabinose, galactose.

- Pectin hòa tan khi bị tác dụng của chất kiềm loãng hoặc enzyme pectinase sẽ giải phóng nhóm methyl dưới dạng rượu methylic, polysaccharide còn lại khi đó gọi là acid pectin tự do, nghĩa là chứa acid polygalacturonic Acid pectin có thể tạo nên dạng muối canxi pectat, chất này chuyển thành dạng kết tủa dễ dàng, do đó được dùng để định lượng các chất pectin.

- Pectin lấy từ nguồn gốc khác nhau thì khả năng tạo gel cũng khác nhau.

1.2.4 Sự phân bố của Pectin trong tự nhiên

Pectin có nhiều trong củ, quả, lá và thân cây Hàm lượng pectin trong các loại rauquả là khác nhau

Pectin có nhiều trong các loại trái cây, loại quả có múi như chanh, cam, bưởi Theonghiên cứu của Aehle (2004) thì hàm lượng pectin và mức độ ester hóa trong một sốGVHD: TH.S Ngô Thị Minh Phương Trang 7 SVTH: Phạm Duy Phúc

loại trái cây như sau:

Bảng 1.1 Thành phần pectin và mức độ ester hóa của pectin ở một số loại trái cây[1].

1.3 Tổng quan về các phương pháp chiết tách pectin

Hiện nay có 3 phương pháp chiết tách pectin được sử dụng phổ biến: chiết pectinbằng nước, axit và enzyme Chiết pectin bằng nước và axit được sử dụng hơn cả vềmặt kinh tế, còn phương pháp sử dụng enzyme để chiết tách pectin ít được sử dụng vìgiá thành enzyme rất đắt, không khả thi về mặt kinh tế nên ít được sử dụng trong khaithác pectin từ các nguồn nguyên liệu thực vật

1.3.1 Chiết tách pectin bằng axit

Quá trình chiết tách pectin được thực thiện ở nhiệt độ 500C , trong thời gian 60phút Nguyên liệu thực vật được nghiền nhỏ Tỉ lệ giữa nguyên liệu và dung môi theo

tỉ lệ 1:6 Dung môi sử dụng cho quá trình chiết tách là axit citric 1% (pH =2,20 ± 0,01)

và hỗn hợp có pH=2,80 ± 0,01 Nước khử ion đã được sử dụng trong suốt quá trìnhchiết tách pectin

Hỗn hợp nguyên liệu và dung môi (axit citric 1%) được gia nhiệt tới 500C trong 60phút Sau đó hỗn hợp được làm lạnh tới 200C trong bể nước đá Tiến hành ly tâm đểloại bỏ bã Nhiệt độ cho quá trình ly tâm là 40C Sau khi tiến hành loại bỏ bã dịch tríchGVHD: TH.S Ngô Thị Minh Phương Trang 8 SVTH: Phạm Duy Phúc

ly pectin sẽ được đem đi kết tủa để thu nhận pectin Sử dụng cồn lớn hơn 800 để kết tủapectin Chú ý thời gian để kết tủa pectin 30 phút Sau đó lọc chân không để thu nhậnpectin ướt đem sấy và nghiền thành bột ta thu được pectin thô [1][5].

Hình 1.5 Sử dụng cồn để kết tủa pectin [4].

1.3.2 Chiết pectin bằng nước

Dung môi được sử dụng ở đây là nước Việc khai thác được thực hiện trong mộtcốc nước với nhiệt độ 25ºC trong 30 phút Tỉ lệ giữa nguyên liệu/nước là 1: 4 (tức là

200 g nguyên liệu nghiền trộn với 800 mL nước pH hỗn hợp là 3,60 ± 0,01 Quá tŕnhthu nhận pectin giống như phương pháp sử dụng axit để chiết tách pectin Đều sử dụngcồn lớn hơn 800 để kết tủa pectin [1][5]

1.3.3 Chiết tách pectin bằng enzym

Việc khai thác pectin từ các nguồn nguyên liệu được tiến hành tại 25ºC trong thờigian 30 phút Với một nồng độ Celluclast trung bình (1,05 ml enzym / kg nguyên liệu).Khác với phương pháp sử dụng axit và nước, chiết tách pectin bằng enzym không

sử dụng nước để pha loãng trong suốt quá trình Hỗn hợp có pH =3,50 ± 0,05[1][5]

1.4 Tình hình nghiên cứu pectin và cây sương sâm trên thế giới và trong nước

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới về pectin và cây sương sâm

Các nghiên cứu trên thế giới về quá trình chiết tách và xác định tính chất của pectinGVHD: TH.S Ngô Thị Minh Phương Trang 9 SVTH: Phạm Duy Phúc

từ các loại nguyên liệu khá phổ biến nhưng từ nguyên liệu lá còn rất hạn chế Cácnghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc khai thác tính dược lý của cây sương sâm.Trên thế giới có nhiều nghiên cứu về pectin như:

- Công trình nghiên cứu về chỉ số pectin do ông Padivalet al (năm 1979), nghiên

cứu này được hỗ trợ bởi CONICET (Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas

y Tecnologicas) và Universidad Nacional del Sur, Argentina (Planta Piloto deIngenieria Quimica (UNS-CONICET) Camino “La-Carrindanga” Km 7.CC 717.(8000) Bahia Blanca Argentina)

- Các nhà khoa học thuộc Viện Nghiên cứu Thực phẩm Anh mới đây phát hiện ra

một loại sợi gọi là pectin trong phần lớn rau quả tươi, có thể ngăn chặn nguy cơ pháttriển ung thư Sau khi nghiên cứu tác dụng của pectin trong phòng thí nghiệm, nhómchuyên gia, do giáo sư Vic Morris dẫn đầu

- Hội thảo quốc tế lần thứ hai về Pectins và Pectinaza được tổ chức bởi Đại học

Wageningen và Trung tâm nghiên cứu và được tổ chức tại Rotterdam, ngày 06-10tháng 5 năm 2011

- Nghiên cứu công nghệ chiết xuất pectin từ Artocarpus heterophyllus lam Được

nghiên cứu bởi Guo Fei-yan, JI Ming-hui, SHU Huo-ming, Chen Jing, Chen Yi-nan(Khoa Hóa, Đại học Hải Nam bình thường, chính Lab của Hert Hóa Dược phẩm nhiệtđới của tỉnh Hải Nam, Trung Quốc)

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước về pectin

- Công trình nghiên cứu thu nhận pectin từ phế liệu quả bưởi và ứng dụng để sản

xuất mứt xoài đông do hai sinh viên Võ Thị Xuân Hạ - Trương Thị Thu Hà TrườngCao đẳng công nghệ, năm 2010

- Nghiên cứu thu nhận pectin từ vỏ cà phê do tác giả Bùi Anh Võ và Nguyễn Đức

Lượng, trường Đại học Tôn Đức Thắng và trường Đại học Bách khoa, ĐHQG-HCM,năm 2009

- Nghiên cứu pectin và quy trình sản xuất bột thạch từ lá sương sâm do tác giả

GVHD: TH.S Ngô Thị Minh Phương Trang 10 SVTH: Phạm Duy Phúc

Trình Liên Vy, Đại học Đà Nẵng thực hiện, kết quả đã xác định được các thành phầncủa lá sương sâm và xây dựng được quy trình sản xuất bột thạch từ lá sương sâm.

- Nghiên cứu thu nhận pectin từ vỏ cà phê do tác giả Bùi Anh Võ-Trường ĐH

Tôn Đức Thắng và Nguyễn Đức Lượng- ĐH Bách Khoa, ĐHQG-HCM thực hiện, kếtquả đã xác định được thành phần trong vỏ cà phê và xây dựng được quy trình chiếttách pectin từ vỏ cà phê với hiệu suất cao nhất

Việc xác định thành phần hóa học cũng như nghiên cứu quá trình chiết tách pectin

từ lá sương sâm vẫn còn khá hạn chế ở nước ta

Với những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu pectin trong lá sương sâm để

từ đó ứng dụng những tính chất của pectin vào thực tiễn cuộc sống

GVHD: TH.S Ngô Thị Minh Phương Trang 11 SVTH: Phạm Duy Phúc

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị dùng trong nghiên cứu

Tủ sấy, lò nung, máy đo độ ẩm bột, máy xác định hàm lượng protein, Bx kế và cácthiết bị, dụng cụ thủy tinh trong phòng thí nghiệm thuộc trường cao đẳng công nghệ

Đà Nẵng

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp vật lý

Xác định hàm lượng nước trong lá sương sâm tươi

Nguyên tắc: Phương pháp này dựa vào việc loại bỏ các phân tử nước ở trạng thái tự dotrong nguyên liệu lá sương sâm bằng cách cho tiếp xúc với nhiệt độ cao lúc đó quátrình bay hơi nước trong nguyên liệu sẽ diễn ra, để từ đó tính ra được hàm lượng nướctrong nguyên liệu lá sương sâm tươi

2.2.1.1 Chuẩn bị

GVHD: TH.S Ngô Thị Minh Phương Trang 12 SVTH: Phạm Duy Phúc

Lá sương sâm tươi được thu hái tại xã Đại Hưng, huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam

và được bảo quản trong ngăn lạnh để đảm bảo giữ nguyên các tính chất của lá sươngsâm

Cân chính xác 100g lá sương sâm tươi, sai số cho phép 0,01 gam Nguyên liệu lásau khi cân, được trải thành những lớp mỏng trên khung lưới sắt để cho vào tủ sấy

Trong đó: W(%) là hàm lượng nước có trong lá sương sâm tươi

GVHD: TH.S Ngô Thị Minh Phương Trang 13 SVTH: Phạm Duy Phúc

m0 là khối lượng lá sương sâm trước khi sấy (gam).

m là khối lượng lá sương sâm sau khi sấy đến khối lượng không đổi (gam).Kết quả xác định hàm lượng nước trong lá sương sâm tươi xem ở mục 1.1 mục phụ lục

2.2.2 Phương pháp hóa sinh

2.2.2.1 Xác định hàm lượng đường khử trong lá sương sâm

Hàm lượng đường khử được xác định theo phương pháp Bectoren-Luxixun.Phương pháp này xác định đường khử chính xác trong khoảng từ 1-4 mg

Nguyên tắc chung của phương pháp Bectoren-Luxixun: trong môi trường kiềm cácđường khử glucoza, fructoza, mantoza có thể dễ dàng khử oxit đồng (II) thành oxitđồng (I) dưới dạng kết tủa màu đỏ và qua đó tính được lượng đường khử Để địnhlượng đường khử thường dùng thuốc thử Folin (dung dịch) Thuốc thử này là hỗn hợp(1:1) của hai dung dịch: sulfat đồng (Folin I); kiềm của muối secnhet-muối kalinatritactrat kép (Folin II)

Khi trộn 2 dung dịch với nhau thì xảy ra phản ứng giữa chúng theo hai giai đoạn,đầu tiên tạo thành kết tủa hydroxit đồng xanh da trời:

CuSO4 + 2 NaOH Cu(OH)2 + Na2SO4

Sau đó, Cu(OH) tác dụng với muối secnhet tạo thành muối phức hòa tan và dungdịch có màu xanh thẫm

Như vậy là muối secnhet có tác dụng giữ cho ion Cu2+ trong môi trường kiềm không

bị kết tủa dưới dạng Cu(OH)2 Muối phức trên là một hợp chất không bền vì thế, cácđường có chứa nhóm chức andehyt hoặc xeton dễ dàng khử Cu2+ thành Cu1+ tạo ra kếttủa oxit đồng (I) màu đỏ và bản thân đường bị oxy hóa khi cho dung dịch đường tácdụng với dung dịch Folin

Để định lượng oxit đồng (I) tạo thành, trước hết oxy hóa nó bằng sulfat sắt ba (III)hoặc bằng sulfat kép sắt-amôn trong môi trường axit sulfuric Khi ấy đồng một sẽ bịoxy hóa trở lại đồng hai (II) còn sắt ba (III) bị khử thành sắt hai (II):

Cu2O + Fe2(SO4)3 + 4H2SO4 2CuSO4 + 2FeSO4 +H2O

GVHD: TH.S Ngô Thị Minh Phương Trang 14 SVTH: Phạm Duy Phúc

Tiếp đó, lượng sắt hai tạo thành được xác định bằng cách oxy hóa nó nhờ dung dịchKMnO4 chuẩn độ trong môi trường axit:

10 FeSO4 + 2 KMnO4 + 8 H2SO4 5 Fe2(SO4)3 + 2MnSO4 + K2SO4 + 8H2OTheo lượng pecmanganat tiêu tốn trong định phân tính lượng oxit đồng một và từ

đó, tính hàm lượng trong dung dịch bằng cách tra bảng tỷ lệ giữa lượng đồng và đườngkhử của Bectơran

a) Chuẩn bị

Hóa chất cần dùng:

(1) dung dịch Na2CO3 bão hòa

(2) dung dịch Pb(NO3)2 hoặc Pb(CH3OO)2-10%

(3) dung dịch Na2SO4 bão hòa

(4) dung dịch Folin I : CuSO4.5H2O-40% (40 gam CuSO4.5H2O trong 1000 gam nướccất)

(5) dung dịch Folin II: cân 53 gam glyxerin hòa tan trong 1 lít dung dịch KOH 15%,lắc đều

(6) dung dịch Fe2(SO4)3 trong axit sunfuric: Hòa tan 50gam Fe2(SO4)3 và 200g H2SO4

đậm đặc ( d= 1,84) trong nước cất cho tới 1lít dung dịch

(7) dung dịch KMnO4 N : cân 1.06gam KMnO4, hòa tan trong 1 lít nước cất đun sôi.Nồng độ của KMnO4 xác định bằng axit oxalic ít nhất sau một ngày

b) Cách tiến hành

- Chuẩn bị dung dịch thí nghiệm:

Nguyên liệu sử dụng ở đây là lá sương sâm đã được nghiền nhỏ Cân 2gam bột lásương sâm cho vào bình tam giác 250ml, thêm vào đó 100ml nước cất, đun cách thủy ở75-800C trong 35-40 phút Kết tủa protein và các tạp chất bằng dung dịch chì nitrat10% (2-5 ml) Sau đó loại bỏ chì nitrat bằng dung dịch Na2SO4 bão hòa (3-5ml), thêmvới lượng vừa đủ để kết tủa hoàn toàn chì nitrat dư Đun cách thủy hỗn hợp ở 600C

GVHD: TH.S Ngô Thị Minh Phương Trang 15 SVTH: Phạm Duy Phúc

trong 10 phút Sau đó lọc hỗn hợp vào bình định mức 100ml thu được dung dịch đườngphân tích.

- Tiến hành thí nghiệm:

Lấy vào bình nón dung tích 250ml một lượng 10ml dung dịch thí nghiệm Thêm10ml dung dịch Folin (5ml dung dịch Folin I và 5ml dung dịch Folin II) Đun sôi hỗnhợp đúng 3 phút- tính từ khi xuất hiện bọt nước đầu tiên Sau khi đun sôi, dung dịchvẫn phải có màu xanh biếc đặc trưng

Sau đó lọc chất lỏng màu xanh bằng phếu lọc xốp chuyên dùng để định lượngđường, rửa bình và phếu lọc bằng nước nóng 3-4 lần Cần chú ý giữ sau cho phần lớnkết tủa 0xit đồng (I) nằm lại trong bình nón và sao cho kết tủa Oxit đồng trên phễu lọccũng như ở trong bình nón luôn luôn phủ bởi một lớp nước nóng tránh cho Cu2O bị oxihóa bởi oxi không khí Hòa tan kết tủa Oxit đồng I bằng cách cho lượng nhỏ 5ml dungdịch Sắt III Sunfat trong môi trường H2SO4 vào bình nón có chứa kết tủa Cu2O và

chuyển sang phễu lọc Sau đó định phân dung dịch bằng KMnO4 N cho đến khi xuất

hiện màu hồng nhạt không mất trong 20-30 giây Biết được lượng KMnO4 N dùngtrong định phân, tra bảng suy ra lượng đường có trong mẫu dung dịch thí nghiệm Songsong làm một thí nghiệm kiểm chứng, thay dung dịch đường bằng nước cất [1]

Hàm lượng đường khử tính theo công thức sau:

V: dung tích bình định mức (ml)

V1: lượng dung dịch thử lấy để xác định đường khử (ml)

m: lượng mẫu vật (gam)

2.2.2.2 Xác định hàm lượng xơ trong lá sương sâm

Nguyên tắc: Phương pháp này dựa vào việc loại bỏ các thành phần có mặt trongmẫu chất xơ bằng các phản ứng thủy phân với axit và kiềm Phần dư còn lại của mẫukhông bị thủy phân sau khi rửa sạch sẽ được cân lại để xác định hàm lượng chất xơ.a) Chuẩn bị

Sau khi lọc và rửa xong, tiếp tục đun sôi phần dư 30 phút trong dung dịch KOH1,25% với các điều kiện tương tự như quá trình thủy phân bằng axit Phần bay hơi

GVHD: TH.S Ngô Thị Minh Phương Trang 17 SVTH: Phạm Duy Phúc

được làm đầy trở lại bằng nước cất nóng và lọc lấy phần chất xơ không tan bằng máylọc chân không, rửa lại 2-3 lần bằn nước cất nóng Dùng nước cất có bổ sung 2-3 giọtdung dịch HCl loãng trán chất xơ vào giấy lọc đã được cân trước Chất xơ trên giấy lọc

sẽ được rửa lại bằng nước nóng, etanol và ethyl ether

Sau đó sấy khô ở 1050C đến khối lượng không đổi Sau khi làm nguội ở bình hút

ẩm cân lượng xơ thu được (m1)

Sau khi sấy xong đem cặn nung ở nhiệt độ 5250C cho đến khối lượng không đổi.Quá trình nung kết thúc khi chêch lệch khối lượng giữa hai lần nung liên tiếp khôngquá 0,001g Làm nguội ở bình hút ẩm cân lượng tro còn lại (m2)[1]

Hàm lượng chất xơ được xác định theo công thức:

Trong đó: X(%) là hàm lượng chất xơ

m0 là mẫu vật (gam)

m1 là khối lượng cặn sau khi sấy (gam)

m2 là khối lượng tro sau khi nung (gam)

Kết quả xác định hàm lượng xơ trong lá sương sâm xem ở mục 1.4 mục phụ lục

2.2.2.3 Xác định hàm lượng protein trong lá sương sâm [1].

Hàm lượng Nito tổng trong lá sương sâm được xác định theo phương pháp Ken-dan(Kjeldahl)

Nguyên tắc: Khi đốt nóng vật phẩm đem phân tích với H2SO4 đậm đặc, các hợpchất hữu cơ đều bị oxi hóa, cacbon và hiro tạo thành CO2 và H2O Còn nitơ, sau khiđược giải phóng ra dưới dạng NH3, kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 tan trongdung dịch:

GVHD: TH.S Ngô Thị Minh Phương Trang 18 SVTH: Phạm Duy Phúc

(8) Hỗn hợp xúc tác: 0,2gam CuSO4.5H2O + 1,8gam K2SO4.

(9) Selen kim loại

(10) Metyl đỏ 0,2% trong rượu 600

dung dịch hoàn toàn mất màu và chỉ đun mạnh khi hỗn hợp đã hoàn toàn chuyển sangthể dịch lỏng Đung cho đến khi dung dịch trong bình ken-dan hoàn toàn trắng Đểnguội, pha loãng bằng 30-50ml nước cất.

- Tiến hành thí nghiệm:

Tiến hành theo phương pháp “lượng nhỏ”: amoniac được cất bằng thiết bị “microken-dan”.Chuyển toàn bộ dung dịch sau khi đã vô cơ hóa xong ở bình ken-dan vàobình định mức 100ml thêm nước cất cho đến vach, lắc đều Dụng cụ để cất trước khi sửdụng phải rửa sạch Lấy vào bình tam giác (1) 20ml dung dịch H3BO3- 30%, thêm vàigiọt chỉ thị ta-xi-rô và lắp vào thiết bị Đun sôi nước trong bình tạo hơi nước (2), mởnước vào ống sinh hàn.Sau đó, qua phễu (3) cho vào bình cất (4) 10ml dung dịch thínghiệm trên và tiếp đó 8-10ml dung dịch NaOH-40% (sau khi đã đóng các khóa (5),(6) Tráng phễu bằng 1 lượng nhỏ nước cất rồi đóng khóa (8) lại Hơi nước rong bình(2) sục qua bình (4) và kéo theo NH3 sang bình hấp thụ (1) Qúa trình cất kết thúc sau

15 phút Đinh phân lượng tetraborat amon tạo thành bằng dung dịch H2SO4 – 0.01N.Sau khi đã lấy bình (1), đóng khóa(7) đồng thời mở khóa (5) Dung dịch chuyển từbình chưng cất (4) sang bầu (9), mở khóa (6) tháo bỏ dung dịch bẩn đi Thí nghiệmxong phải rửa sạch thiết bị cất vi lượng một lần bằng HCl loãng và nhiều lần bằngnước cất

Cất 1 mẫu trắng để kiểm chứng với các thuốc thử và thao tác như trên- nhưng thay10ml dung dịch đã vô cơ hóa bằng 10ml nước cất

GVHD: TH.S Ngô Thị Minh Phương Trang 20 SVTH: Phạm Duy Phúc

Hình 2.2 Thiết bị Micro-kendan[4].

Hàm lượng Nitơ tổng số được tính bằng công thức sau:

Dựa vào tỷ lệ Nitơ tương đối ổn định trong thành phần cấu tạo của protein để xácđịnh hệ số protein Thông thường, hàm lượng Nitơ toàn phần trong protein được xemnhư 16%, khi đó hệ số protein H: H=100/16= 6,25

Hệ số protein=6,25 hay còn gọi là hệ số trung bình thô

Hàm lượng protein x’(%)=x (%).H

Trong đó:

x : hàm lượng Nito tổng số tính bằng (%)

x’: hàm lượng protein có trong mẫu lá sương sâm (%)

a : số ml H2SO4-0,01 N dùng định phân mẫu thí nghiệm (ml)

b : số ml H2SO4-0,01 N dùng định phân mẫu kiểm chứng (ml)

m : lượng mẫu cân tính bằng (mg)

Kết quả xác định hàm lượng protein trong lá sương sâm xem ở mục 1.5 mục phụlục

2.2.2.4 Xác định hàm lượng pectin tổng trong lá sương sâm

Nguyên tắc: Trong môi trường kiềm loãng, pectin hòa tan sẽ giải phóng ra nhómmethoxyl thành rượu methylic và acid pectin tự do Acid pectin tự do trong môi trường

có mặt acid acetic sẽ kết hợp với CaCl2 thành dạng muối kết tủa calcium pectate Từhàm lượng muối kết tủa có, thể tính được hàm lượng pectin có trong mẫu phân tích.a) Chuẩn bị

Hóa chất: Dung dịch NaOH 0,1N; CH3COOH 0,1N; CaCl2 1N; AgNO3 1%

b) Tiến hành

Lấy 5gam lá sương sâm tươi đã được làm nhỏ cho vào bình tam giác dung tích250ml, cho thêm 100ml NaOH 0,1N, để hỗn hợp trong 7 giờ cho pectin xà phòng hóahoàn toàn thành acid pectin Sau đó, thêm vào 50ml dung dịch acid acetic 0,1N và đểyên 5 phút, thêm 50ml CaCl2 1N để 1 giờ Sau đó đun sôi hỗn hợp trong 5 phút rồi lọcqua giấy lọc đã được sấy khô đến khối lượng không đổi, rửa kết tủa calcium pectatebằng nước cất nóng cho đến khi không còn ion Cl- nữa (thử nước rửa với dung dịchAgNO3 1%) Sau khi rửa xong, đặt giấy lọc có kết tủa vào cốc, cân và sấy ở 1050 C đếnkhối lượng không đổi [1][6]

Hàm lượng pectin tổng trong lá sương sâm tươi được tính theo công thức sau:

Trong đó: P: là hàm lượng pectin có trong mẫu lá sương sâm tươi (%)

m1: khối lượng cặn calcium pectate thu được (gam)

0,92: hệ số chuyển từ calcium pectate sang pectin

m: khối lượng mẫu cần phân tích (gam)

GVHD: TH.S Ngô Thị Minh Phương Trang 22 SVTH: Phạm Duy Phúc

Kết quả xác định hàm lượng pectin trong lá sương sâm xem ở mục 1.6 mục phụ lục.

2.2.2.5 Xác định chỉ số DE của mẫu pectin thô

Phương pháp xác định mức độ ester hóa (DE) (theo Food Chemical Codex, FCC,

1981; trích dẫn bởi Singthong et al, 2005) [1].

Cách tiến hành: Cân 500 mg mẫu pectin khô cho vào bình tam giác 250 mL,

thêm 2 mL ethanol và pha loãng bằng 100 mL nước cất Sau khi mẫu được hòa tanhoàn toàn, thêm 5 giọt phenolphtalein, mẫu được chuẩn độ với dung dịch NaOH0,5N cho đến khi dung dịch có màu hồng nhạt và ghi nhận kết quả và ghi nhận kếtquả Vbđ Sau đó thêm vào 10 mL NaOH 0,5 N và lắc thật mạnh rồi để yên khoảng

15 phút 10 mL HCl được thêm tiếp vào và lắc cho đến khi màu hồng biến mất.Thêm vào 5 giọt phenolphtalein và chuẩn độ với NaOH 0,5N cho đến khi dung dịch

có màu hồng nhạt bền trong 30 giây Ghi lại kết quả Vs

Tính toán kết quả:

Kết quả xác định chỉ số DE trong lá sương sâm tươi xem ở mục 1.7 mục phụ lục

GVHD: TH.S Ngô Thị Minh Phương Trang 23 SVTH: Phạm Duy Phúc

Hình 2.3 Mẫu được chuẩn độ với dung dịch NaOH 0,5N

GVHD: TH.S Ngô Thị Minh Phương Trang 24 SVTH: Phạm Duy Phúc