Nghiên cứu quy trình tách chiết hesperidin từ quả phật thủ làm nguyên liệu sản xuất thuốc

ii TÓM TẮT Flavonoid glycosid Hesperidin một loại nguyên liệu thuốc kháng viêm, chống ôxy hóa, chống dị ứng, chống ung thư, làm bền thành mạch và giảm tính thấm của mao mạch được sử dụn

BỘ CÔNG THƯƠNG VIỆN HÓA HỌC CÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHCN CẤP BỘ:

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT HESPERIDIN TỪ QUẢ PHẬT THỦ LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT THUỐC

7449

15/7/2009

HÀ NỘI – 2008

BỘ CÔNG THƯƠNG VIỆN HÓA HỌC CÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHCN CẤP BỘ:

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT HESPERIDIN TỪ QUẢ PHẬT THỦ LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT THUỐC

Chủ nhiệm Đề tài: Ths Nguyễn Văn Chính Những người tham gia:

Ths Trương T Tố Trinh

CN Nguyễn Quốc Đạt

HÀ NỘI – 2008

ii

TÓM TẮT

Flavonoid glycosid Hesperidin một loại nguyên liệu thuốc kháng viêm, chống ôxy hóa, chống dị ứng, chống ung thư, làm bền thành mạch và giảm tính thấm của mao mạch được sử dụng nhiều trong điều trị bệnh cao huyết áp

và bệnh trĩ đã được tách chiết từ quả Phật thủ với năng suất chiết là 1,04% so với nguyên liệu khô

Quy trình tách chiết flavonoid hesperidin đạt tiêu chuẩn làm nguyên liệu sản xuất thuốc quy mô phòng thí nghiệm từ nguyên liệu có chứa hesperidin đã được xây dựng trên cơ sở các kết quả khảo sát các thông số công nghệ về nhiệt độ, pH môi trường chiết và môi trường kết tinh, tỷ lệ dung môi vv Việc chiết tách hesperidin ở quy mô lớn hơn 10 lần quy mô khảo sát

đã được nghiên cứu nhằm hoàn chỉnh cơ sở dữ liệu phục vụ cho việc phát triển sản xuất ở quy mô lớn hơn

Hesperidin tách chiết được đã được xác định cấu trúc, phân tích định tính, định lượng bằng các phương pháp phổ: IR, UV, MS, 1H-NMR, 13C-NMR, HPLC và kiểm nghiệm các chỉ tiêu cơ bản

Các kết quả nghiên cứu thu được có thể áp dụng vào sản xuất hesperidin từ nguồn nguyên liệu tự nhiên sẵn có và rất phong phú trong nước

ở quy mô pilot nhằm đáp ứng nguyên liệu sản xuất thuốc cho công nghiệp bào chế dược phẩm trong nước

Nghiên cứ quy tr̀n ách chiết he pe idin ừ quả phật h àm nguy n ệu sản xuất h ốc

MỤC LỤC

TÓM TẮT ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG, BIỂU, HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

MỞ ĐẦU 1

I TỔNG QUAN 3

I.1 Cây Phật thủ 3

I.1.1 Cây phật thủ và tác dụng chữa bệnh của Phật thủ 3

I.1.2 Thành phần hóa học của quả Phật thủ 4

I.2 Flavonoid, các hợp chất flavonoid trong cây họ Cam 6

I.2.1 Flavonoid 6

I.2.2 Flavonoid trong quả cây họ Cam 7

I.3 Hesperidin 11

I.3.1 Tính chất của Hesperidin 12

I.3.2 Tác dụng dược lý của Hesperidin 12

I.3.3 Tổng quan về tình hình nghiên cứu tách chiết hesperidin 17

I.4 Phân tích hesperidin 19

I.4.1 Phổ tử ngoại của hesperidin 20

I.4.2 Phổ khối MS của hesperidin 20

I.4.3 Phân tích hesperidin bằng HPLC 20

II PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 21

II.1 Phương pháp tiếp cận 21

II.2 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị 22

II.2.1 Nguyên liệu, hóa chất 22

II.2.2 Dụng cụ, thiết bị 22

II.3 Phương pháp chiết tách hesperidin 23

II.3.1 Phương pháp chiết flavonoid toàn phần 23

II.3.2 Phương pháp tách chiết Hesperidin 24

II.4 Phân tích sản phẩm 24

III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25

iv

III.1 Tách chiết flavonoid toàn phần từ quả Phật thủ 25

III.2 Tách chiết và tinh chế Hesperidin 25

III.3 Khảo sát các thông số ảnh hưởng đến quá trình tách chiết hesperidin từ quả Phật thủ 27

III.3.1 Ảnh hưởng của pH dung môi chiết đến hiệu suất tách chiết hesperidin 27

III.3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi chiết 29

III.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ 30

III.3.4 Ảnh hưởng của thời gian chiết mẫu 32

III.3.5 Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu 34

III.3.6 Ảnh hưởng của pH môi trường kết tinh 35

III.4 Kết quả tách chiết hesperidin lượng lớn từ Phật thủ, vỏ Cam và vỏ Quýt 38

III.5 Phân tích và kiểm nghiệm sản phẩm 39

III.5.1 Phổ hồng ngoại và UV của sản phẩm 39

III.5.2 Khối phổ MS của hesperidin 40

III.5.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của hesperidin 40

III.5.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của hesperidin 41

III.5.5 Kết quả kiểm nghiệm 41

III.6 Đề xuất công nghệ sản xuất Hesperidin 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

CÁC PHỤ LUC 50

Nghiên cứ quy tr̀n ách chiết he pe idin ừ quả phật h àm nguy n ệu sản xuất h ốc

DANH MỤC BẢNG, BIỂU, HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ

Bảng 1: Các hợp chất flavanone dưới dạng aglycone 8

Bảng 2: Các hợp chất flavone dưới dạng aglycone 8

Bảng 3: Các hợp chất polymethoxyflavone 9

Bảng 4: Các hợp chất flavanone-O-glycosid 9

Bảng 5: Flavone-C-glucosid và flavone-O-glucosid 10

Bảng 6: Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất tách chiết hesperidin 27

Bảng 7: Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi chiết đến hiệu suất chiết hesperidin 29 Bảng 8: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất chiết hesperidin 31

Bảng 9: Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất chiết hesperidin 33

Bảng 10: Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hiệu suất chiết hesperidin 34

Bảng 11: Ảnh hưởng của pH môi trường kết tinh 36

Bảng 12: Hiệu suất chiết hesperidin ở quy mô và nguồn nguyên liệu khác nhau 38

Biểu đồ 1: Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất quá trình chiết 28

Biểu đồ 2: Hiệu suất tách chiết hesperidin từ flavonoid toàn phần ở pH khác nhau 28

Biểu đồ 3: Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi chiết đến hiệu suất chiết hesperidin 30

Biểu đồ 4: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất chiết hesperidin 32

Biểu đồ 5: Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất chiết hesperidin 33

Biểu đồ 6: Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu 35

Biểu đồ 7: Ảnh hưởng của pH môi trường kết tinh 36

Hình 1: Cây, hoa và quả Phật thủ 3

Hình 2: Các hợp chất polyphenol chính trong phật thủ 5

Hình 3: Khung flavone và flavanone 6

Hình 4: Cấu trúc phân tử của các nhóm flavonoid 7

Hình 5: Rutinose và neohesperidose 10

Hình 6: Sơ đồ phân mảnh qua bước chuyển vị nội phân tử của hesperidin 40

Hình 7: Sơ đồ công nghệ sản xuất Hesperidin 44

Nghiên cứ quy tr̀n ách chiết he pe idin ừ quả phật h àm nguy n ệu sản xuất h ốc

MỞ ĐẦU

Hesperidin là một Flavonoid có tác dụng kháng viêm, chống ôxy hóa, chống dị ứng, chống ung thư nhờ khả năng hấp thụ tác nhân gây ung thư Hesperidin có tác dụng làm bền thành mạch và giảm tính thấm của mao mạch nên được sử dụng trong điều trị bệnh cao huyết áp và bệnh trĩ Tác dụng chữa

ho của hesperidin là do khả năng chống dị ứng nhờ tính chất ức chế việc giải phóng histamine từ các tế bào lớn Hesperidin khi dùng phối hợp với vitamin

C có tác dụng cộng hưởng và hỗ trợ hấp thụ vitamin C

Hesperidin là hợp chất flavonoid chủ yếu trong vỏ quả cây họ Cửu lý

hương (Rutaceace) thường được gọi là họ Cam như: Cam, Quýt, Chanh, Phật

thủ, Thanh yên, Bưởi vv Nhiều bộ phận của cây họ này được sử dụng làm thuốc trong y học cổ truyền để điều trị bệnh đặc biệt là để chữa ho Đặc biệt thuốc ho đông dược từ Phật thủ có thể dùng được cho trẻ em Tuy nhiên, việc nghiên cứu tách chiết các hoạt chất có trong các loại dược liệu này để làm nguyên liệu sản xuất thuốc ở nước ta còn được quan tâm chưa nhiều

Năm 2007 Viện Hóa học công nghiệp Việt Nam hợp tác với Công ty

CP Vimedimex nghiên cứu phát triển thuốc ho từ quả Phật thủ Trong quá trình triển khai nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy phần bã thải còn chứa một lượng lớn flavonoid glycosid mà chủ yếu là hesperidin Vì vậy chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu chiết hesperidin từ quả Phật thủ nhằm tận dụng và nâng cao hiệu quả kinh tế

Với những lý do đề cập ở trên, việc nghiên cứu chiết xuất Hesperidin từ nguồn nguyên liệu thiên nhiên sẵn có trong nước trên cơ sở công nghệ tự nghiên cứu là hết sức cần thiết Hơn nữa, việc tự sản xuất hesperidin trong nước vừa góp phần đa dạng hóa sản phẩm, vừa góp phần tự chủ, đa dạng hóa nguồn nguyên liệu sản xuất thuốc phù hợp với mục tiêu, chiến lược xây dựng

và phát triển ngành công nghiệp hóa dược

2

Mục tiêu của đề tài:

• Xây dựng quy trình tách chiết, phân lập Hesperidin làm nguyên liệu sản xuất thuốc từ quả phật thủ

Đề tài đã tiến hành các nội dung nghiên cứu sau:

• Xác định điều kiện chiết tách flavonoid toàn phần từ quả phật thủ

• Phân lập và tinh chế Hesperidin đạt tiêu chuẩn nguyên lieu thuốc

• Xây dựng quy trình tách chiết Hesperidin từ quả phật thủ

• Phân tích kiểm nghiệm một số chỉ tiêu cơ bản của sản phẩm

Nghiên cứ quy tr̀n ách chiết he pe idin ừ quả phật h àm nguy n ệu sản xuất h ốc

I TỔNG QUAN

I.1 Cây Phật thủ

I.1.1 Cây phật thủ và tác dụng chữa bệnh của Phật thủ

Cây Phật thủ có tên khoa học là Citrus medica L var Sarcodactylis

Swingle thuộc chi Cam quýt (Citrus) họ Cửu lý hương (Rutaceace) thường

được gọi là họ Cam; tên thường gọi là Buddha's Hand citron, Finger citrom

frenit, Phật thủ [5]

Cây Phật thủ là dạng cây nhỏ xanh tốt quanh năm, lá mọc so le, hình trứng, mép có răng cưa nhỏ, gai ngắn mọc ở dưới lá Vào đầu mùa hạ ra hoa màu trắng, cánh hoa trên trắng dưới đỏ, quả chín vào mùa đông, vỏ ngoài màu vàng, trên một số những múi chạy dài dọc quả phía dưới tách ra trông như ngón tay nên có tên là phật thủ.[5], [4] (Hình 1)

Hình 1: Cây, hoa và quả Phật thủ

4

Phật thủ được trồng tại nhiều nơi trong nước ta, thường để lấy quả ăn, làm mứt và làm thuốc Phật thủ còn được trồng ở Trung Quốc, Ấn độ, các nước vùng Địa Trung Hải, Úc, Nam Mỹ, Trung Đông Y học cổ tryuền

thường dùng quả phơi khô (Fructus Citri sarcodactyli)

Quả phật thủ hiện mới chỉ được dùng để chữa ho đặc biệt là chữa ho cho trẻ em, chữa bụng đầy, đau, biếng ăn, nôn mửa tại Trung Quốc và Việt Nam theo kinh nghiệm của Y học cổ truyền.[5] Gần đây do thành phần phong phú các hợp chất polyphenol và đặc biệt là sự có mặt với hàm lượng đáng kể của các hợp chất flavonoid trong quả phật thủ nên phật thủ được sử dụng trong phòng ngừa và điều trị huyết áp, loãng xương, chống oxy hóa… [20] Ở Trung Quốc hiện cao chiết flavonoid toàn phần của quả Phật thủ đã được bào chế thành dạng thực phẩm chức năng

I.1.2 Thành phần hóa học của quả Phật thủ

Trong quả Phật thủ ngoài tinh dầu, các hợp chất đường còn có các hợp

chất polyphenol như: Hesperidin (1); diosmetin (2); eriocitrin(3); diosmin(4); 5-methoxyfurfural(5); 5-hydroxy-2-hydroxymethyl-4H-pyran-4-one(6); vanillic acid(7); 3-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)-acrylic acid(8); 3,4- dihydroxy-benzoic acid(9); limettin(10); obacunone(11).[5],[4] (Hình 2)

Trong đó các hợp chất 1, 2, 3, 4 là các flavonoid

Trong quả Phật thủ nói riêng, quả của các cây họ Cam nói chung các hợp chất flavonoid tập trung chủ yếu ở lớp vỏ cùi (Albedo) và ở lớp vỏ dầu (Flavedo) Trong đó hesperidin tập trung chủ yếu ở lớp vỏ cùi dưới dạng kết tinh.[2], [7]

và chuyển hóa phenylpropanoid Flavonoid là một trong những nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học quan trọng nhất và đáng chú ý nhất Cho đến nay, hơn 4.000 hợp chất flavonoid đã được phân lập và xác định cấu trúc Chúng xuất hiện cả ở dạng tự do (aglycone) cũng như dạng glucosid Flavonoid có trong hầu hết các phần của thực vật bao gồm: trong quả, thân, lá, rễ và hoa [2], [19]

Khung flavonoid được tạo thành từ hai vòng thơm (thường ký hiệu là A

và B), được gắn với nhau qua một vòng pyrone (C) trong trường hợp các hợp chất flavone, hoặc là một vòng dihydropyrone trong trường hợp các hợp chất flavanone, như trong hình 3

Hình 3: Khung flavone và flavanone Theo cấu trúc phân tử, flavonoid được chia thành sáu nhóm chính sau: flavone, flavanone, flavonol, isoflavone, anthocyanidin và flavanol [17] Cấu trúc phân tử của chúng được biểu diễn như trong hình 4

5' 4'

3' 2' A

B C

Nghiên cứ quy tr̀n ách chiết he pe idin ừ quả phật h àm nguy n ệu sản xuất h ốc

Bảng 3: Các hợp chất polymethoxyflavone

26 3,3’,4’,5,6,7,8-Heptamethoxyflavone OMe OMe OMe

2 3 4 O 5 6 7

2' 3' 4' 5' 6'

a O-Rutinose; b O-Neohesperidose

Các flavanone O-glycosid có trong cây họ Cam được giới thiệu trong bảng 4 Các dẫn xuất này có một nhóm thế glycosyl ở vị trí C7 (trong vòng A) Cho đến nay, trong nhóm hợp chất này chỉ có hai nhóm disaccharid được xác định mà cả hai đều là dẫn xuất L-rhamnosyl-D-glucosyl : Nhóm rutinose,

có một liên kết α-1,6 interglycosid; còn nhóm neohesperidose thì hai phân tử đường liên kết với nhau qua liên kết α-1,2 interglycosid (Hình 5)

10

Hình 5:Rutinose và neohesperidose Bảng 5: Flavone-C-glucosid và flavone-O-glucosid

4 Diosmetin 7-O-rutinoside (Diosmin) H H O-Ru a H OH OMe

a O-Rutinose; b O-Neohesperidose

Nghiên cứ quy tr̀n ách chiết he pe idin ừ quả phật h àm nguy n ệu sản xuất h ốc

Các hợp chất flavone-O-glycosid tìm thấy trong cây họ cam thường là 7-O-rutinoside hoặc 7-O-neohesperidoside (Bảng 5) Cho đến nay, người ta mới chỉ tìm thấy duy nhất Rutin (48) là dẫn xuất 3-O-rutinoside Trong cây

họ cam cũng còn chứa một số lớn dẫn xuất di-C-glycosid cũng như một số lượng nhỏ hơn dẫn xuất mono-C-glycosid Với những hợp chất này, sự thế thường ở vị trí C6 hay C8 hoặc cả hai Hiện mới chỉ có dẫn xuất D-glucosyl được tìm thấy.[17]

I.3 Hesperidin

Hesperidin (1) là một hợp chất flavonoid chủ yếu trong vỏ quả cây họ

Cam (Citrus Rutaceae) được Lebrton tách chiết vào năm 1827 từ vỏ quả cây

Hesperides, sau đó nó được tìm thấy trong rất nhiều cây họ Cam (họ Cửu lý hương) [2], [9] Hesperidin có công thức phân tử: C28H34O15 Khối lượng phân tử: 610,56 Công thức cấu tạo của Hesperidin như sau:

OH

O O

(2S)-7-[[6-O-(6-Deoxy-α-L-mannopyranosyl)-β-D-Tên khác: hesperetin 7-rhamnoglucoside; cirantin; rutinoside

12

Theo cấu trúc phân tử hesperidin thuộc về nhóm flavanone Phân tử hesperidin gồm một phân tử aglycone hesperetin (12) liên kết với một phân tử disaccharid (rutinose) Do đó có thể coi hesperidin là dẫn xuất β-7-rutinoside của hesperetin Rutinose (6-O-(6-deoxy-α-L-mannopyranosyl)-D-glucose) là một disaccharid tạo nên bởi một phân tử rhamnose và một phân tử glucose bằng liên kết α-1,6 Trong phân tử hesperidin, glucose gắn với hesperetin còn rhamnose gắn với phân tử glucose.[2], [7]

Khi thủy phân hesperidin bằng kiềm thu được phloroglucinol và hesperetenic axít [9] Khi thủy phân hesperidin bằng axít thu được hesperetin, D-glucose, L-rhamnose

I.3.1 Tính chất của Hesperidin

Hesperidin là bột màu trắng hay nâu nhạt, không mùi, không vị Khó tan trong nước (1 gam trong 50 lít nước) Tan trong formamid, DMF ở 60 oC Tan ít trong metanol, axít axetic nóng Hầu như không tan trong acetone, benzene, chloroform Tan tự do trong kiềm loãng, pyridine tạo ra một dung dịch có màu vàng sáng.[20]

Nhiệt độ nóng chẩy: 258-262 °C

Độ quay cực: [α]D20 = -76° (c = 2 trong pyridine)

I.3.2 Tác dụng dược lý của Hesperidin

Tác dụng chữa bệnh của hesperidin được các nhà nghiên cứu đặc biệt quan tâm trong hai thập kỷ vừa qua và đã có một số lượng lớn ấn phẩm được công bố về ứng dụng hesperidin trong điều trị bệnh.[2], [6], [19]

Hesperidin cũng như các flavonoid khác có tác dụng kháng viêm, chống ôxy hóa, chống dị ứng, chống ung thư Hesperidin có tác dụng làm bền thành mạch và giảm tính thấm của mao mạch nên được sử dụng trong điều trị bệnh cao huyết áp và bệnh trĩ Tác dụng chữa ho của hesperidin là do khả năng chống dị ứng nhờ tính chất ức chế việc giải phóng histamine từ các tế

Nghiên cứ quy tr̀n ách chiết he pe idin ừ quả phật h àm nguy n ệu sản xuất h ốc

Tính thẩm thấu của các mao mạch gia tăng là đặc điểm điển hình của một số trạng thái bệnh tật và được biểu lộ dưới các triệu chứng như: phù thũng, chẩy máu và tăng huyết áp Các bệnh của cơ thể thường đi kèm với việc tăng tính thẩm thấu của các mao mạch bao gồm: bệnh đái đường, chứng thiếu tĩnh mạch mãn tính, xuất huyết, bệnh sco-bút, nhiều loại lở loét và bầm tím Các nghiên cứu trước đây về flavonoid chiết xuất từ thực vật chỉ ra rằng chúng làm giảm tính thẩm thấu và tính dễ vỡ của các thành mạch Hesperidin nói riêng, các hợp chất flavonoid nói chung đã được rất nhiều công trình nghiên cứu chứng tỏ khả năng ngăn chặn, hạn chế sự gia tăng tính thẩm thấu của các mao mạch [2],[6],[8],[9] Năm 1939 Morii chỉ ra rằng với liều sử dụng 30 mg một ngày hesperidin làm giảm tính thẩm thấu của các mao mạch

và gia tăng sức đề kháng của các mao mạch trong nhiều ca điều trị lâm sàng các bệnh viêm màng phổi, lao phổi, bệnh Grave, bệnh tê phù Từ đó, hesperidin được sử dụng làm thuốc tăng sức đề kháng của hệ mao mạch

Năm 1940 Scarborough sử dụng hesperidin trong điều trị chứng xuất huyết do sử dụng thạch tín và bệnh giang mai Kết quả thực nghiệm của ông cho thấy hesperidin có tác dụng tăng độ bền và khả năng chụi đựng của các mao mạch Năm 1941 Higby sử dụng hesperidin trong điều trị lâm sàng bệnh xuất huyết và những rối loạn gây ra bởi chứng dòn thành mạch Vai trò của hesperidin trong việc gia tăng độ bền thành mạch là do nó ức chế ảnh hưởng của các emzyme tác động đến tính thấm và tính dễ vỡ của các mao mạch.[19]

Hesperidin khi sử dụng phối hợp với diosmin có tác dụng chống lại các

bệnh viêm nhiễm cả trong thử nghiệm in vivo và in vitro.[19]

I.3.2.3 Tác dụng chống ôxy hóa

Hesperidin nói riêng, các flavonoid nói chung là các hợp chất chống ôxy hóa mạnh Chúng hoạt động như là các chất dọn dẹp các gốc tự do (radical-scavengers) nhờ khả năng cho nhận nguyên tử hydro của các nhóm chức phenolic và khả năng giải tỏa điện tử của gốc tự do trong toàn bộ khung cấu trúc flavonoid: flavonoid(OH) + R. → flavonoid(O.) + RH [19]

Rất nhiều nghiên cứu thực nghiệm về hoạt tính chống oxy hóa của hesperidin đã được tiến hành Kết quả cho thấy khả năng chống oxy hóa của hesperidin là tương đối yếu nếu so sánh với các flavonoid khác [6]

Tuy nhiên, năm 2005 người ta đã chứng minh được khả năng chống

oxy hóa rất tốt của Hesperidin trên chuột (BMC Pharmacol 2005 Jan

31;5(1):2.).

I.3.2.4 Tác dụng kháng vi sinh vật

Các nghiên cứu thử nghiệm sinh học thực nghiệm cho thấy hesperidin

có tác dụng kháng một số vi khuẩn, nấm và virút [2]

cộng sự cho thấy hesperidin có khả năng ức chế sự phát triển của

Nghiên cứ quy tr̀n ách chiết he pe idin ừ quả phật h àm nguy n ệu sản xuất h ốc

Helicobacter pylori (HP) Trong những bệnh nhân viêm dạ dầy mãn tính, HP

thúc đẩy sự biến đổi từ viêm dạ dầy thành ung thư dạ dầy Tuy nhiên, Islam

và Ahsan, trong thử nghiệm in vitro hesperidin trên đĩa thạch cho thấy nó

không có hoạt tính kháng khuẩn với các chủng: Bacillus subtilis,

Staphylococus aureus, Streptococous hemolyticus, Escherichia coli, chủng Klebsiella, Pseudomonas aerugisnosa, Salmonella typhi, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri và Vibrio cholera

nhận ở liều từ 1 đến 10 µg đối với chủng Botrytis cenerea, Trichoderma

glaucum và Aspergillus fumigatus Tuy nhiên, hesperidin không có hoạt tính

kháng nấm với chủng Aspergillus niger

của Wacker và Eilmes tiến hành vào các năm 1975 và 1978 cho thấy

hesperidin có hoạt tính kháng virút gây viêm miệng có mụn nước ở các nồng

độ khác nhau và có hoạt tính kháng virút cúm Năm 1999, Lee và CS phát hiện thấy hesperidin có hoạt tính kháng virút yếu đối với virút herpes đơn hình (HSV) Milddleton chứng minh hoạt tính kháng virút của hesperidin đối với virút herpes type-I, para influenza -3, poliovirus type-I, virút hỗn bào hô hấp (RSV) trên mô tế bào đơn lớp Mucsi và Pragai chứng minh tác dụng ức chế virút của hesperidin đối với virút herpes đơn hình type-I ở người (HSV-I)

và virút suid herpes type-I (Pseudorabies virus) Tuy nhiên, thực nghiệm cho

thấy hesperidin không có hoạt tính đối với virút HIV [2]

I.3.2.5 Tác dụng chống ung thư

Tác dụng chống ung thư của hesperidin bao gồm: bảo vệ DNA khỏi bị

hư hại; ức chế sự phát triển của các khối u và ức chế sự phân chia của các tế bào ung thư [19]

16

Trong hai thập niên gần đây, một số lượng lớn nghiên cứu về hoạt tính chống ung thư của hesperidin và dạng aglycone của nó (hesperetin) được tiến hành Kết quả cho thấy hesperidin ức chế các tác nhân gây ung thư trên mô hình thực nghiệm trên chuột ở nồng độ 500ppm / kg thể trọng Yang và CS

sử dụng hesperidin kết hợp với diosmin trong 8 tuần đầu trên chuột thực nghiệm gây ung thư bởi tác nhân N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine; kết quả cho thấy hỗn hợp ức chế giai đoạn đầu hình thành các khối u Tanaka

và CS thử nghiệm hoạt tính chống ung thư của hesperidin bằng đường uống kết quả cho thấy hesperidin ức chế tác nhân gây ung thư 4-nitroquinoline-1-oxid, làm giảm số lượng các thương tổn và mức polyamide trong tế bào lưỡi [2], [6]

Hesperidin còn có khả năng bảo vệ DNA nhờ khả năng hấp phụ tia tử ngoại cũng như khả năng trung hòa các gốc tự do vốn là tác nhân gây nên sự biến đổi gen khi chúng được giải phóng gần các DNA [19]

I.3.2.6 Tác dụng giảm đau và hạ sốt của hesperidin

Hesperidin thể hiện hoạt tính giảm đau, hạ sốt trên chuột thực nghiệm qua đường tiêm dưới da và đường uống Ngoài ra hesperidin còn có tác dụng

ức chế sự giải phóng histamin và prostaglandin vì vậy mà được sử dụng trong điều trị đau dạ dầy và ung thư dạ dầy [2]

I.3.2.7 Một số tác dụng dược lý khác của hesperidin

Ngoài các tác dụng nêu trên hesperidin còn có tác dụng chống độc, chống loãng xương, chống tia tử ngoại…

Năm 2004 lần đầu tiên người ta chứng minh được khả năng chống độc Asen (III) của Hesperidin trên chuột (Toxicol Pathol 2004 Sep-Oct;32(5):527-35.) Năm 2003 người ta đã chứng minh được khả năng chống loãng xương của Hesperidin (J Nutr 2003 Jun;133(6):1892-7.)

Nghiên cứ quy tr̀n ách chiết he pe idin ừ quả phật h àm nguy n ệu sản xuất h ốc

I.3.3 Tổng quan về tình hình nghiên cứu tách chiết hesperidin

I.3.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Như đã đề cập ở trên, Hesperidin được Lebrton tách chiết vào năm

1827 từ vỏ quả cây Hesperides, sau đó nó được tìm thấy trong rất nhiều cây

họ Cam (họ Cửu lý hương) [2], [9]

Năm 1931, S Gyorgyi và CS chiết hesperidin từ vỏ chanh bằng etanol 95%, sau đó tách hesperidin thô bằng cách tạo phức với chì axêtat, phá phức

và kết tinh lại trong axit axêtic ở nhiệt độ sôi [6], [21]

R H Higby và CS chiết tách hesperidin từ vỏ cam vào năm 1942 bằng dung dich NaOH ở pH 11-12, sau đó axit hóa dịch chiết thu được bằng HCl đến pH 4-5, thu được hesperidin thô, đem hòa tan trong dung dich NaOH 0,02N, tủa pectin bằng isopropanol và tách loại pectin, dịch lọc được chỉnh về

pH bằng 6 để kết tủa hesperidin, sau đó tách hesperidin ra khỏi dung dịch [22]

Trong US patent 2,421,061, các tác giả mô tả công nghệ chiết flavanone glycosid bao gồm các bước sau: làm cứng nguyên liệu bằng vôi, sau đó chiết bằng dung dịch kiềm (NaOH hoặc NH4OH), lọc ép thu dịch lọc

và điều chỉnh pH bằng HCl đến pH bằng 4-5, để kết tinh trong 24 giờ, lọc thu kết tinh flavanone glycosid Kết tinh lại nếu cần bằng ancol [23]

W E Baier mô tả công nghệ chiết hesperidin từ vỏ cam bằng dung dịch CaOH, sau đó kết tinh hesperidin trong môi trường axit (pH >2,5) ở nhiệt độ 50oC Điểm cải tiến duy nhất của các tác giả là thúc đẩy quá trình kết tinh ở nhiệt độ cao để rút ngắn thời gian kết tinh và hạn chế sự lên men của dịch chiết [24]

S H Wender và CS đưa ra quy trình tách và phân lập flavonoid bằng cột trao đổi cation, dung môi rửa giải là etanol 90% Phương pháp này cho

Trong USP 7,015,339, B E Khare và CS mô tả một quá trình chiết flavone từ thực vật bao gồm giai đoạn loại chất béo bằng n-hexan, chiết bằng ancol và cô đặc dịch chiết Chiết dịch thu được bằng nước ở pH 11,4 Tách pha nước và chỉnh pH về 6-6,5 Sử lý tiếp bằng các phương pháp tách loại thông thường [27]

Yaqin Ma, Xingqian Ye và cộng sự sử dụng phương pháp chiết hesperidin bằng alcol C1 – C3 có sự hỗ trợ của siêu âm giúp giảm thời gian và tăng hiệu suất quá trình chiết [29] Tuy nhiên phương pháp này mới chỉ được tiến hành trong phòng thí nghiệm

A Di Mauro, B Fallico và cộng sự phát triển một công nghệ chiết hesperidin trên cơ sở công nghệ chiết bằng dung dịch kiềm, sau đó trung hòa dịch chiết và hấp phụ hesperidin bằng nhựa styrene-divinylbenzene (SDVB) Rửa giải bằng dụng dịch NaOH 0,5 N sau đó kết tinh ở pH = 5 [1]

I.3.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Trong nước hiện chưa sản xuất được Hesperidin Tuy có một số nghiên cứu về hesperidin nhưng hầu hết mới chỉ dừng ở phạm vi nghiên cứu cơ bản Quả Phật thủ cũng mới chỉ được dùng để chữa ho cho trẻ em, chữa đau bụng,

Nghiên cứ quy tr̀n ách chiết he pe idin ừ quả phật h àm nguy n ệu sản xuất h ốc

đầy hơi, biếng ăn… trong phạm vi kinh nghiệm dân gian hoặc theo các bài thuốc cổ phương trong y học cổ truyền

Năm 2001, Nguyễn Hương Thảo và CS tiến hành khảo sát flavonoid từ

vỏ quýt sử dụng phương pháp chiết bằng ete dầu hỏa sau đó bằng metanol và phân lập flavonoid , kết tinh hesperidin trong metanol [16]

Năm 2006, Hoàng Thị Kim Dung và CS công bố nghiên cứu về khả năng chống oxy hóa của Rutin và Hesperin chiết xuất từ hoa hòe và vỏ quýt việt nam [11] Trong nghiên cứu này, các tác giả sử dụng phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ bao gồm việc loại bỏ chất béo bằng ete dầu hỏa sau đó chiết bằng metanol, chiết phân lập và kết tinh hesperidin trong metanol

Tóm lại: hầu hết nghiên cứu chiết tách hesperidin trên thế giới sử dụng

hai phương pháp chủ yếu sau:

1 Phương pháp thứ nhất người ta sử dụng kiềm trong dung môi nước để chiết hesperidin sau đó kết tinh và tinh chế Ưu điểm của phương pháp này

là chi phí sản xuất tương đối thấp, sử dụng dung môi là nước nên thân thiện với môi trường Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là sản phẩm thu được có độ tinh khiết không cao, đòi hỏi phải tách, kết tinh và phân lập bằng dung môi hữu cơ

2 Phương pháp thứ hai sử dụng dung môi hữu cơ hoặc hỗn hợp dung môi hữu cơ và nước để chiết tách hesperidin sau đó phân lập và kết tinh Phương pháp này thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm, còn khi

áp dụng trong sản xuất thì chi phí dung môi và chi phí sản xuất và đặc biệt

là suất đầu tư đắt hơn

I.4 Phân tích hesperidin

Hesperidin được phân tích bằng các phương pháp phân tích hóa lý như: Phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), khối phổ (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), LC-MS HPLC-MS

20

I.4.1 Phổ tử ngoại của hesperidin

Phổ UV của hesperidin có hai pic hấp phụ tử ngoại cực đại tương ứng: pic I với cường đọ yếu hơn ở 326-330 nm, pic II với cường độ mạnh hơn ở

284 -286 nm Trong đó, pic I gắn với sự hiện diện của nhóm cinamoyl từ vòng B, còn pic II gắn với sự hiện diện của nhóm benzoyl từ vòng A trong khung cấu trúc của hesperidin

I.4.2 Phổ khối MS của hesperidin

Phổ MS của hesperidin được ghi cả ở chế độ ion âm (negative mode)

và dương (positive mode) Phổ MS của hesperidin ghi ở dạng negative mode

có các pic đặc trưng tương ứng với số m/z của các ion: [M-H]- = 609, ion tạo thành do mất một đơn vị rhamnose có [M-H-146]- = 463, mất tiếp một đơn vị glucô có [M-H-146-162]- = 301 Ở chế độ ion dương phổ MS tương ứng có [M+H]+ = 611, ion tạo thành do mất một đơn vị rhamnose có [M+H-146]+ =

465, mất tiếp một đơn vị glucô có [M+H-146-162]+ = 303 và một pic đặc thù cho lớp chất này hình thành do sự chuyển vị nội phân tử của ion [M+H]+ tạo thành ion [M+H-162]+ = 449 do mất một đơn vị glucô

I.4.3 Phân tích hesperidin bằng HPLC

Phương pháp HPLC thường được sử dụng để phân tích định lượng hesperidin Thường người ta sử dụng cột pha đảo C-18 hoặc C-8 với hệ pha động gồm hỗn hợp nước, axetonitril, metanol và THF cùng với một lượng nhỏ axit Đêtectơ thường dùng là đêtectơ UV ở 280nm hoặc đêtectơ DAD [3], [9], [30]

Nghiên cứ quy tr̀n ách chiết he pe idin ừ quả phật h àm nguy n ệu sản xuất h ốc

II PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

II.1 Phương pháp tiếp cận

Như đã trình bầy trong phần tổng quan có hai phương pháp chiết hesperidin gồm:

Phương pháp 1: Chiết hesperidin và các flavonoid khác bằng nước ở

pH 11-12 Dịch lọc thu được được điều chỉnh về môi trường axit để kết tủa (hoặc kết tinh) các flavonoid Sau đó phân lập hesperidin khỏi hỗn hợp flavonoid toàn phần dựa trên tính kém hoặc không tan của nó trong các dung môi hữu cơ

Phương pháp 2: Chiết flavonoid toàn phần bằng dung môi hữu cơ

hoặc hỗn hợp dung môi hữu cơ Cất loại dung môi Sau đó phân lập hesperidin

Do những ưu điểm về chi phí sản xuất thấp và tính thân thiện với môi trường nên trong công nghiệp, Hesperidin thường được sản xuất bằng công nghệ chiết bằng nước (phương pháp 1) dựa trên cơ sở phương pháp chiết của

R H Higby và W E Baier Theo đó, nguyên liệu chứa hesperidin được chiết bằng kiềm ở pH 11-12, lọc bỏ bã, dịch lọc thu được được đưa về PH 4-5 sau

đó kết tinh thu được hỗn hợp flavonoid Tiến hành phân tách để thu hesperidin, tinh chế, sấy khô và bảo quản

Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành tách chiết flavonoid toàn phần từ quả phật thủ bằng dung dịch kiềm Hesperidin được tách chiết, phân lập bằng phương pháp chiết rắn – lỏng sử dụng các dung môi hữu cơ sau đó kết tinh lại trong metanol

Trên cơ sở kết quả nghiên cứu thu được, chúng tôi tến hành chiết hesperidin từ các nguyên liệu chứa hesperidin khác như vỏ Quýt, vỏ Cam để hoàn thiện cơ sở số liệu phục vụ cho việc phát trển sản xuất ở quy mô lớn hơn sau này

22

II.2 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị

II.2.1 Nguyên liệu, hóa chất

Chúng tôi sử dụng nguyên liệu là quả Phật thủ thu mua tại chợ Long Biên được sơ chế như mô tả dưới đây và Phật thủ khô, vỏ Cam, vỏ Quýt mua tai phố Lãn Ông, Hà Nội

Sơ chế nguyên liệu: Quả Phật thủ tươi được thái lát mỏng sau đó đem

sấy ở 50 oC trong 72 giờ thu được Phật thủ khô với hàm ẩm khoảng 10% đem đóng gói bảo quản sử dụng cho nghiên cứu, khảo sát công nghệ

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu tách chiết Hesperidin như sau:

- Metanol (CH3OH), P, KT(TQ);

- Isopropanol, P (TQ);

- Axeton, P (TQ);

- Etylaxetat, P (TQ);

- Etanol (C2H5OH), P (Việt nam);

- Natri hydroxit (NaOH), P (Việt Nam);

- Máy khuấy từ JENWAY 1000 (Anh);

- Máy khuấy đũa IKA, (Đức);

- Thiết bị cô quay Buchi R-14 (Thụy sỹ);

- Thiết bị đo hồng ngoại Shimazu FTIR 8900 (Nhật);

- Thiết bị đo điểm chảy Buchi B-540 (Thụy sỹ);

- Cân phân tích Satorius TE 214S (Đức)