chuyển gen chịu hạn ở đậu tương

ĐạI HọC THáI NGUYÊN TRƯờNG ĐạI HọC NÔNG LÂM nguyễn kim oanh Tên đề tài: Bớc đầu khảo sát quy trình chuyển gen chịu hạn GmNAC vào giống đậu tơng ĐVN9 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens khoá luận tốt nghiệp đại học Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm Khoá học : 2006 - 2010 Thái Nguyên - 2010 ĐạI HọC THáI NGUYÊN TRƯờNG ĐạI HọC NÔNG LÂM nguyễn kim oanh Tên đề tài: Bớc đầu khảo sát quy trình chuyển gen chịu hạn GmNAC vào giống đậu tơng ĐVN9 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens khoá luận tốt nghiệp đại học Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm Khoá học : 2006 - 2010 Ngời hớng dẫn : 1. TS. Nguyễn Văn Đồng (Phòng TNTĐ - CNTBTV - Viện Di Truyền Nông Nghiệp) 2. KS. Bùi Tri Thức (Khoa CNSH & CNTP - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên) Thái Nguyên - 2010 LờI CảM ƠN Trớc hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Văn Đồng đã tận tình giúp đỡ, hớng dẫn tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với sự giúp đỡ to lớn, những ý kiến đóng góp quý báu, sự hớng dẫn tận tình của ThS. Hà Văn Chiến, KS. Bùi Tri Thức và KS. Nguyễn Tiến Dũng trong quá trình tôi thực hiện và hoàn thành khóa luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật - Viện Di truyền nông nghiệp về sự giúp đỡ nhiệt tình trong suốt thời gian tôi thực hiện khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, trờng ĐH Nông Lâm Thái Nguyên đã giúp đỡ nhiệt tình và đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong thời gian học tập cũng nh khi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Cuối cùng, tôi xin gửi tới bố mẹ, anh chị cùng bạn bè, những ngời mà đã luôn quan tâm, ủng hộ và là chỗ dựa cho tôi trong suốt thời gian tôi làm khóa luận này, cũng nh trong cuộc sống. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với những giúp đỡ quý báu đó. Hà Nội, ngày 30 tháng 05 năm 2010 Sinh viên Nguyễn Kim Oanh danh mục bảng biểu Trang Bảng 2.1. Các quốc gia sản xuất đậu tơng nhiều nhất thế giới năm 2008 5 Bảng 2.2. Diện tích canh tác, năng suất và sản lợng của đậu tơng 6 ở Việt Nam từ năm 2004 2009 6 Bảng 2.3. Số liệu thống kê sản xuất đậu tơng qua các vùng khác nhau 6 ở Việt Nam năm 2008 6 Bảng 4.1. Biểu hiện tạm thời của gen gus khi biến nạp các chủng Agrobacterium khác nhau vào nốt lá mầm giống đậu tơng ĐVN9 38 Bảng 4.2. ảnh hởng của mật độ vi khuẩn tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở giống đậu tơng ĐVN9 40 Bảng 4.3. ảnh hởng của hàm lợng AS (Acetosyringone) tới sự biểu hiện tạm thời của gen gus 42 Bảng 4.4. ảnh hởng của thời gian đồng nuôi cấy đến sự biểu hiện tạm thời của gen gus 44 Bảng 4.5. Hiệu quả của việc gây tổn thơng nốt lá mầm đến sự biểu hiện tạm thời của gen gus 46 Bảng 4.6. Kết quả biến nạp, chọn lọc và tái sinh cây đậu tơng chuyển gen 47 danh mục các hình Trang Hình 2.1. Bản đồ Ti-plasmid 9 Hình 2.2. Cấu trúc T-DNA 10 Hình 2.3. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens 11 Hình 2.4. Sơ đồ cấu trúc vector hai nguồn 14 Hình 2.5. Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp 15 Hình 2.6. Phản ứng tạo ra sản phẩm 5,5-dibromo-4,4-dicloro-indigo có màu xanh 27 Hình 3.1. Cấu trúc vector pBI 29 Hình 3.2. Cấu trúc vector dựa trên nền vector pBI 30 Hình 4.1. Biểu hiện tạm thời của gen gus trên đậu tơng 39 sau lây khi nhiễm với các chủng khuẩn 39 Hình 4.2. ảnh hởng của mật độ vi khuẩn đến biểu hiện gen gus trên ĐVN9. .41 Hình 4.3. ảnh hởng của nồng độ AS đến biểu hiện tạm thời 43 của gen gus trên ĐVN9 43 Hình 4.4. ảnh hởng của thời gian đồng nuôi cấy lên biểu hiện tạm thời 45 của gen gus trên ĐVN9 45 Hình 4.5. ảnh hởng của việc gây tổn thơng nốt lá mầm đến 47 tỷ lệ sống và tần số chuyển gen 47 Hình 4.6. Một số hình ảnh quy trình chuyển gen GmNAC 48 vào giống đậu tơng ĐVN9 48 Hình 4.7. Mức độ kháng hygromycin sau 12 giờ. Lá của cây đối chứng (không chuyển gen) (1, 2). Lá của cây đã đợc chuyển gen hpt (3, 4) 49 Hình 4.8. Điện di DNA tổng số từ mẫu lá cây thí nghiệm qua xử lý RNase 49 Hình 4.9. ảnh điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen Hpt 50 (kháng hygromycin) 50 kÝ hiÖu viÕt t¾t AS : Acetosyringone (3,5-dimethoxy-4-hydrroxy Acetophenone) BAP : 6-benzylaminopurin Bar : Gen m· hãa tæng hîp phosphinothricin acetyl transferase CaMV : Cailiflower Mosaic Virus Car : Carbenicillin DNA : Deoxirionucleic Acid FAO : Food and Agriculture Organization GFP : Green Fluorescent Protein Gus : β-1,4-Glucuronidase HPT : Hygromycin Phosphotransferase IAA : β-indol acetic acid IBA : Indol-3-butyric acid ISAAA : International Services for the Acquisition of Agri-Biotech Ka : Kanamycin LB : Luria Bertani L-Cys : L-Cystein MS : Murashige and Skoog, 1962 NAA : Napthalene acetic acid NPT II : Neomycin Phosphotransferase II PCR : Polymerase Chain Reaction Ti-plasmid : Tumor-Including Plasmid T-DNA : Transfer-DNA Vir : virulence mục lục Trang Phần 1 1 Mở ĐầU 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài 1.2. Mục tiêu của đề tài 1.3. Yêu cầu của đề tài 1.4. ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Phần 2 3 TổNG QUAN TàI LIệU 3 2.1. Nguồn gốc, vai trò và vị trí của cây đậu tơng trong hệ thống cây trồng 2.1.1. Nguồn gốc và phân loại 3 2.1.2. Tầm quan trọng của cây đậu tơng 3 2.1.3. Tình hình sản xuất đậu tơng trên thế giới và Việt Nam 5 2.1.3.1. Tình hình sản xuất đậu tơng trên thế giới 5 2.1.3.2. Tình hình sản xuất đậu tơng ở Việt Nam 5 2.1.4. Giống đậu tơng ĐVN9 7 2.1.5. Khái quát tình hình chịu hạn ở thực vật và ở cây đậu tơng 7 2.1.5.1. Khái niệm về hạn 7 2.1.5.2. Đặc tính chịu nóng, chịu hạn của cây đậu tơng 7 2.2. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và hiện tợng biến nạp gen ở thực vật 2.2.1. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid 9 2.2.2. Cấu trúc và chức năng của đoạn T-DNA 10 2.2.3. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens10 2.2.4. Biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 11 2.2.4.1. Hệ thống chuyển gen in vitro 11 2.2.4.2. Hệ thống chuyển gen in vivo 12 2.3. Hệ thống vectơ chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 2.4. Các yếu tố ảnh hởng đến hiệu quả biến nạp gen thông qua A. tumefaciens 2.5. Tình hình về nuôi cấy mô và chuyển gen ở đậu tơng 2.5.1. Một số nghiên cứu môi trờng tái sinh ở thực vật và cây đậu tơng 17 2.5.2. Một số nghiên cứu về chuyển gen ở đậu tơng 19 2.6. Một số đặc tính đã đợc cải thiện ở cây đậu tơng bằng kỹ thuật di truyền 2.7. Tình hình sản xuất đậu tơng chuyển gen trên thế giới và trong nớc 2.7.1. Tình hình sản xuất đậu tơng chuyển gen trên thế giới 22 2.7.2. Tình hình sản xuất đậu tơng chuyển gen ở Việt Nam 23 2.8. Những nghiên cứu về gen GmNAC 2.9. Gen gus 2.10. Các gen chỉ thị chọn lọc và các gen thông báo trong hệ thống vectơ biến nạp Phần 3 29 VậT LIệU, NộI DUNG Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 29 3.1. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu 3.1.1. Vật liệu thực vật 29 3.1.2. Vật liệu vi khuẩn 29 3.1.3. Hoá chất và dụng cụ thí nghiệm 30 3.1.3.1. Hoá chất 30 3.1.3.2. Máy móc và thiết bị 30 3.1.4. Phạm vi nghiên cứu 30 3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành 3.2.1. Địa điểm 30 3.2.2. Thời gian tiến hành 30 3.3. Nội dung nghiên cứu 3.4. Phơng pháp nghiên cứu 3.4.1. Thí nghiệm 1: Lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho việc chuyển gen vào ĐVN9 31 3.4.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá ảnh hởng của mật độ vi khuẩn (OD600nm) lên khả năng biến nạp gen vào đậu tơng thông qua tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus vào ĐVN9 31 3.4.3. Thí nghiệm 3: Đánh giá ảnh hởng của hàm lợng chất dẫn dụ Acetosyringone (AS) lên khả năng biến nạp vào đậu tơng thông qua biểu hiện tạm thời của gen gus trên ĐVN9 31 3.4. 4. Thí nghiệm 4: Đánh giá ảnh hởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng biến nạp gen vào đậu tơng thông qua tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus trên ĐVN9 32 3.4.5. Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hởng của việc gây tổn thơng nốt lá mầm đến sự biểu hiện của gen gus trên ĐVN9 32 3.4.6. Thí nghiệm 6: Chuyển gen chịu hạn GmNAC vào đậu tơng ĐVN9 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (theo quy trình nêu trên) 34 * Phân tích các cây đậu tơng chuyển gen sau tái sinh bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen Hpt (kháng hygromycin) 35 3.5. Các chỉ tiêu đánh giá 3.6. Các phơng pháp đánh giá Phần 4 38 KếT QUả NGHIÊN CứU Và THảO LUậN 38 4.1. Kết quả lựa chọn chủng vi khuẩn A. tumefaciens thích hợp cho chuyển gen vào giống đậu tơng ĐVN9 thông qua biêu hiện tạm thời của gen gus 4.2. ảnh hởng của mật độ vi khuẩn (OD600nm) lên tỉ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus 4.3. ảnh hởng của hàm lợng Acetosyringone (AS) lên tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus Acetosyringon (AS) là một hợp chất của phenol đợc tiết ra tại vùng bị thơng của cây. AS đóng vai trò dẫn dụ vi khuẩn Agrobacterium tới mô lây nhiễm và kích hoạt các gen vùng vir hoạt động để hoạt hóa cơ chế chuyển T-DNA vào tế bào thực vật 4.4. ảnh hởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng biến nạp gen vào đậu tơng ĐVN9 thông qua tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus 4.5. ảnh hởng của việc gây tổn thơng nốt là mầm trên giống ĐVN9 đến sự biểu hiện tạm thời của gen gus 4.6. Kết quả chuyển gen GmNAC giống đậu tơng ĐVN9 sử dụng Agrobacterium tumefaciens 4.7. Kết quả phân tích, đánh giá các cây đậu tơng sau khi chuyển gen chịu hạn gmNAC * Kết quả khảo sát sự có mặt tạm thời của gen chọn lọc hpt (kháng hygromycin) * Tách DNA tổng số đậu tơng chuyển gen * Kết quả phân tích các cây đậu tơng chuyển gen bằng kỹ thuật PCR Phần 5 51 KếT LUậN Và Đề NGHị 51 5.1. Kết luận 5.2. Đề nghị TàI LIệU THAM KHảO 52 Phần 1 Mở ĐầU 1.1. Tính cấp thiết của đề tài Đậu tơng [Glycine max (L.) Merrill.] còn gọi là đậu nành là một cây trồng cạn ngắn ngày có giá trị kinh tế cao. Khó có thể tìm thấy một cây trồng nào có tác dụng nhiều mặt nh cây đậu tơng. Sản phẩm của nó làm thực phẩm cho con ngời, thức ăn cho gia súc nguyên liệu cho công nghiệp và hàng xuất khẩu. Vì thế cây đậu tơng đợc gọi là "Ông Hoàng trong các loại cây họ đậu". Ngoài ra, đậu tơng là cây trồng lý tởng trong hệ thống luân canh do khả năng cải tạo đất tốt (Ngô Thế Dân và cs, 1999)[2], (Trần Văn Điền, 2007)[4]. Diện tích đậu tơng ở nớc ta hiện nay đạt khoảng 200.000 ha với năng suất bình quân 1,5 tấn/ha (Clive James, 2008)[15], (FAO Statistic Database, 2007)[16]. Để tăng sản lợng đậu tơng, ngoài mở rộng thêm diện tích trong cơ cấu luân canh thì tăng năng suất là giải pháp chính. Sử dụng đậu tơng biến đổi gen là một tiến bộ quan trọng trong nghành trồng đậu tơng của trên toàn thế giới hiện nay. Hiện diện tích trồng đậu tơng biến đổi gen trên thế giới năm 2008 lên đến 125 triệu ha (Clive Jame, 2008)[15]. Vì vậy, ở nớc ta, cần thiết nhanh chóng tiếp cận và ứng dụng công nghệ này để tăng năng suất đậu t- ơng. Việc tạo giống đậu tơng biến đổi gen từ các giống đậu tơng trồng ở Việt Nam đòi hỏi các nghiên cứu tiến hành có hệ thống. ở Việt Nam đã xây dựng thành công hệ thống tái sinh và bớc đầu nghiên cứu đánh giá khả năng đáp ứng chuyển nạp gen của các giống đậu tơng địa phơng (Trần Thị Cúc Hoà, 2007)[8], (Trần Thị Cúc Hoà, 2008)[9]. Mặt khác, đậu tơng là một cây trồng cạn, ngắn ngày có giá trị kinh tế cao. Là một nguồn quan trọng của dầu thực vật và protein. Những yêu cầu dành cho dầu đậu tơng và protein đợc tăng lên, sự cải thiện về chất lợng và sản xuất đậu tơng thông qua sự biến nạp gen và chức năng di truyền học đã trở thành một vấn đề quan trọng trên khắp thế giới. Để nâng cao năng suất đậu tơng, vấn đề đặt ra là phải nhanh chóng tạo đợc bộ giống đậu tơng năng suất cao, chống chịu tốt với sâu bệnh và các yếu tố bất thuận của môi trờng, trong đó tạo giống đậu tơng chịu hạn là mục tiêu hàng đầu của giai đoạn 2007-2011, đồng thời đó cũng là yêu cầu bức xúc hiện nay của sản xuất. 1 [...]... trình chuyển gen vào đậu tơng nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens - Xây dựng quy trình chuyển gen vào một số giống đậu tơng và phân tích các cây chuyển gen chịu hạn GmNAC sau tái sinh - Trên cơ sở đó xác định đợc phơng pháp chuyển gen thích hợp vào đậu tơng, góp phần phát triển lĩnh vực chọn tạo giống đậu tơng bằng công nghệ sinh học 1.3 Yêu cầu của đề tài - Tối u hoá quá trình chuyển gen vào giống đậu. .. đáng kể ở Việt Nam đã có một số tác giả nghiên cứu khả năng chịu nóng, chịụ hạn của cây đậu tơng, tiêu biểu là công trình đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tơng nhập nội, nghiên cứu phân lập, xác định trình tự gen chaperonin tế bào chất từ giống đậu tơng đột biến M103 (Trần Thị Cúc Hoà, 2007)[8], phân lập gen dehydrin liên quan đến khả năng chịu hạn của cây đậu tơng, nâng cao tính chịu hạn của... năng chuyển gen bền vững cao Mặc dù vậy, trong nhiều điều kiện quá trình chuyển T-DNA tăng đã không có kết quả trong chuyển gen bền vững Nguyên nhân có thể là do thiếu sự tơng tác giữa quá trình chuyển T-DNA và chuyển gen bền vững Để có đợc sự phối hợp giữa chuyển T-DNA và chuyển gen bền vững thì các điều kiện lây nhiễm, đồng nuôi cấy phải thích hợp cho việc chuyển T-DNA và tái sinh cây chuyển gen Ngoài... xuất đậu tơng chuyển gen trên thế giới và trong nớc 2.7.1 Tình hình sản xuất đậu tơng chuyển gen trên thế giới ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống đậu tơng là hớng mới và hiệu quả trong công tác chọn tạo giống cây trồng nói chung và cây đậu tơng nói riêng ở các quốc gia nông nghiệp trên thế giới Trong đó, chọn tạo giống bằng công nghệ chuyển gen để tạo ra sản phẩm cây trồng chuyển gen đợc... trên đoạn điều khiển gen của nhiều gen chức năng tham gia điều khiển tính chịu stress và hoạt hoá sự biểu hiện của các gen này, kết quả là thực vật tăng cờng tính chống chịu với môi trờng Điều này giải thích vì sao tính trạng chống lại các điều kiện bất lợi (stress) là tính trạng đa gen nhng chỉ cần chuyển một gen điều khiển tính chịu hạn có thể làm tăng sức chống hạn của cây chuyển gen Các trình tự điều... giống cây trồng chuyển gen thì việc xây dựng quy trình biến nạp thuận lợi và có hiệu quả là một trong những đòi hỏi cần thiết Do phạm vi nghiên cứu của đề tài quá rộng và đậu tơng là đối tợng khó nuôi cấy, vì vậy với mong muốn góp phần hoàn thiện quy trình chuyển gen ở đậu tơng nên chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: "Bớc đầu khảo sát quy trình chuyển gen chịu hạn GmNAC vào giống đậu tơng ĐVN9... tổng số gen trong mỗi hệ gen, ví dụ ở Arabidopsis có 2057 gen điều khiển đợc phát hiện trên tổng số 26.000 gen trong hệ gen Rất nhiều nghiên cứu về đặc tính của gen điều khiển trên cây mô hình Arabidopsis và lúa đã chứng minh nhóm gen này đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong việc tăng cờng khả năng chống chịu ở thực vật Vì vậy, việc phân lập và nghiên cứu đặc tính của các gen điều khiển đang trở thành... giống đậu tơng chuyển gen hoàn toàn tơng tự nh các giống đậu tơng mẹ về dinh dỡng, cấu tạo và phơng thức chế biến thành thực phẩm và thức ăn gia súc (Clive Jame, 2008)[15] Chuyển gen kháng sâu hại và chịu hạn (gen Bt) Cũng nh tính trạng kháng thuốc diệt cỏ, gen kháng sâu hại đợc nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trên các đối tợng cây trồng theo thứ tự giảm dần là: bông, ngô, đậu tơng, cải dầu, gen Bt... với các giống đậu tơng mới đợc chuyển gen thành phần axit oleic lên tới trên 80% Các giống đậu tơng đợc chuyển gen đợc trồng tại Australia, Canada, Mỹ và Trung Quốc (Clive Jame, 2008)[15] .Chuyển gen tạo cây CNSH đa tính trạng Hớng nghiên cứu ứng dụng CNSH trong chọn tạo giống cây trồng nói chung và cây đậu tơng nói riêng là việc tạo ra cây trồng CNSH đa tính trạng bằng việc chuyển nhiều gen cho một... cộng sinh trong chuyển gen vào lúa Môi trờng MS hay MS cải tiến cũng thích hợp cho lây nhiễm và đồng nuôi cấy trong chuyển gen ở một số kiểu gen lúa khác Môi trờng với hàm lợng khoáng giảm đã kích thích khả năng chuyển T-DNA trong biến nạp gen vào mô sẹo phôi hoá ở lúa mỳ, phôi non ở ngô (Phạm Thị Lý Thu, 2006)[11] Việc bổ sung acetosyringone (AS) chất kích thích sự hình thành các gen vir, đã có trong . tơng chuyển gen trên thế giới và trong nớc 2.7.1. Tình hình sản xuất đậu tơng chuyển gen trên thế giới 22 2.7.2. Tình hình sản xuất đậu tơng chuyển gen ở Việt Nam 23 2.8. Những nghiên cứu về gen. khảo sát quy trình chuyển gen vào đậu tơng nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. - Xây dựng quy trình chuyển gen vào một số giống đậu tơng và phân tích các cây chuyển gen chịu hạn GmNAC sau tái. Tình hình sản xuất đậu tơng trên thế giới 5 2.1.3.2. Tình hình sản xuất đậu tơng ở Việt Nam 5 2.1.4. Giống đậu tơng ĐVN9 7 2.1.5. Khái quát tình hình chịu hạn ở thực vật và ở cây đậu tơng 7 2.1.5.1.