qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (theo quy trình nêu trên)
* Nội dung 3: Phân tích các cây đậu tơng chuyển gen sau tái sinh
3.4.7. Thí nghiệm 7: Phân tích các cây đậu tơng chuyển gen sau tái sinh
* Khảo sát sự có mặt tạm thời của gen chọn lọc Hpt (kháng hygromycin)
Ta tiến hành lấy lá cây đậu tơng chuyển gen và cắt thành hình vuông cho vào dung dịch (nớc cất, hygromycin với nồng độ đã sử dụng chọn lọc trong quá trình tái sinh). Sau đó, cứ 2 giờ ta quan sát và chụp ảnh 1 lần (8-12 tiếng). Nếu lá có hiện t- ợng chuyển màu vàng chứng tỏ cây đậu tơng đó cha có gen quan tâm chuyển vào. Nếu lá vẫn còn xanh thì ta có thể kết luận lá cây đem phân tích đã có gen quan tâm.
* Tách DNA tổng số đậu tơng chuyển gen
Các cây tái sinh đợc đa ra đất. Khi cây có lá thứ 7 thì tiến hành thu mẫu lá để tách chiết DNA. DNA đợc tách chiết và tinh sạch bằng phơng pháp CTAB của Saghai Maroof (1984) có cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.
Hóa chất đợc sử dụng để tách chiết DNA nh sau:
1) Đệm CTAB 100 ml gồm:
- CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) : 2,25 gam
- β-Mercapto ethanol : 250 àl
- EDTA (Ethylenediamine tetraacetate) : 4,5 ml
- NaCl 5M : 30 ml - Tris HCl 8,0 : 15 ml - H2O : 55 ml 2) Đệm TE EDTA pH 8,0 gồm: - Tris HCl 8,0 : 10 mM - EDTA 8,0 : 1 mM 3) Enzyme Rnase : 10 àg/ml 4) Cồn tuyệt đối lạnh 5) NaCl 5 M
7) Dung dịch (25:24:1) gồm Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol pha theo tỷ lệ 25/24/1.
8) Dung dịch rửa là cồn 75%.
Tách chiết DNA từ lá đậu tơng
- Bớc 1: Nghiền 0,3-0,5 gam lá đậu tơng trong nitơ lỏng thành bột mịn. - Bớc 2: Chuyển bột lá vào ống ly tâm 1,5 ml. Thêm 0,8 ml đệm CTAB đã ủ ở 650C trong 10 phút.
- Bớc 3: ủ các ống ly tâm ở 650C trong 90 phút, lắc nhẹ nhàng nhng dứt khoát 20 phút một lần để việc tách có hiệu quả.
- Bớc 4: Ly tâm 12.000 vòng/phút, hút lớp dịch nổi sang ống mới rồi bổ sung 0,7 ml dung dịch 24:1, lắc nhẹ nhàng trong 10 phút rồi tiến hành ly tâm trong 10 phút ở tốc độ 10.000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (lặp lại bớc 4 2 lần).
- Bớc 5: Hút lớp dịch nổi sang ống mới rồi bổ sung (25:24:1) tỷ lệ (1:1) lắc nhẹ rồi 20 trong 20 phút. Rồi tiến hành ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 10 phút.
- Bớc 6: Hút lớp dịch nổi sang ống mới bổ sung Isopropanol vào tỷ lệ 1:1 với mẫu, bổ sung thêm 3-5 àl NaCl 5M. Lắc nhẹ trong 10 phút. Để trong tủ -200C qua đêm.
- Bớc 7: Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 15 phút thu kết tủa.
- Bớc 8: Rửa với Ethanol 70% sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 20 phút (thực hiện 2 lần).
- Bớc 9: Loại bỏ dịch lỏng làm khô bằng máy ly tâm hút chân không (20 phút). - Bớc 10: Bốn sung 30 àl H2O + 1 àl RNAse sau đó ủ ở 370C trong 30 phút. Đem cất giữ ở -200C.
DNA sau khi tinh sạch theo phơng pháp trên đợc đo nồng độ nhờ máy quang phổ Nanodrop và dựa vào đó để pha loãng DNA ra nồng độ 50ng/àl bằng nớc cất khử ion để chuẩn bị cho các nghiên cứu tiếp theo.
* Phân tích các cây đậu tơng chuyển gen sau tái sinh bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen Hpt (kháng hygromycin)
Nguyên tắc của PCR là dựa vào sự phối hợp khả năng lai đặc hiệu của DNA và khả năng tổng hợp DNA in vitro của DNA polymerase để nhân bản in vitro các
đoạn gen khác nhau lên hàng triệu lần so với ban đầu. Do DNA polymerase hoạt động theo nguyên tắc cần phức hợp khuôn mồi, trong môi trờng thích hợp có các dNTP thì sẽ kéo dài thành sợi bổ sung với sợi khuôn. Vì vậy, để nhân bản đợc đoạn DNA đích, ngời ta cần phải biết đợc trình tự nucleotide ở hai đầu DNA cần nhân bản để từ đó thiết kế cặp mồi đặc hiệu. Mồi dùng trong phản ứng PCR thờng có chiều dài từ 10 đến 40 nucleotide, tuỳ thuộc vào mức độ khuyếch đại đặc hiệu đối với trình tự đích và tuỳ thuộc vào mục đích của các nhà nghiên cứu. Sau khi tiến hành chạy PCR với các mẫu phân tích, sự sai khác của DNA đợc kiểm tra dựa vào phơng pháp điện di.
Phân tích PCR tiến hành với cặp mồi đặc hiệu cho gen Hpt:
Hpt – F – 5’ – AGAAGAAGATGTTGGCGACCT– 3’
Hpt – R – 5’ – GTCCTGCGGGTAAATAGCTG – 3’
Để nhân đoạn có trình tự 514 bp của gen Hpt.
Hỗn hợp phản ứng bao gồm: - H2O 13,1 àl - Dung dịch đệm 10xPCR 2,0 àl - MgCl (50 mM) 1,0 àl - dNTP (1 mM) 2 àl - Mồi xuôi (50 ng/àl) 0,2 àl - Mồi ngợc (50 ng/àl) 0,2 àl - Tag-polymerase (5UI/àl) 0,5 àl - DNA (25 ng/àl) 1 àl
Phản ứng đợc chạy trên máy PCR với chu trình: 940C trong 10 phút, (940C trong 20 giây; 600C trong 20 giây; 720C trong 90 giây) x 10 chu kỳ, (940C trong 20 giây; 520C trong 20 giây; 720C trong 90 giây) x 25 chu kỳ, 720C trong 10 phút, 40C ở +∞. Sản phẩm PCR sau đó đợc điện di trên gel agarose nồng độ 1%.
Chuẩn bị bản gel:
- Chuẩn bị khay điện di, lau khô, cài lợc, chỉnh cho cân bằng.
- Chuẩn bị gel agarose 1%, đa vào lò vi sóng khoảng 2 phút cho agarose tan hoàn toàn trong dung dịch 1xTBE. Để hỗn hợp giảm nhiệt độ xuống còn 50-600C, bổ sung ethidium bromide rồi đổ vào khay điện di.
- Sau khoảng 15 phút gel đông lại, rút lợc khỏi bản gel. Đặt khay vào bể điện di, bổ sung thêm dung dịch 1xTBE cho ngập mặt gel.
Tra mẫu DNA:
- lấy 2àl đệm tra mẫu, thêm vào 8àl DNA sản phẩm, trộn đều rồi tra vào các giếng. Tra thêm DNA marker 1 kb vào giếng đầu tiên để xác định độ dài của các băng DNA.
- Lắp nguồn điện vào bể điện di, chỉnh điện thế từ 85-100V trong khoảng 45 phút đến 1 giờ. DNA sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dơng của điện trờng. Dựa vào vị trí của các vạch màu để dừng quá trình điện di.
- Nhuộm bản gel và chụp ảnh: Gel đợc soi dới ánh sáng tử ngoại ở bớc sóng 245-260 nm của máy soi và chụp ảnh bản gel bằng máy CLS-Microdoc (Clever Scientific Ltd,)