ở tất cả các hệ thống biến nạp tỷ lệ cây tiếp nhận DNA bền vững thờng là rất thấp. Vì vậy, ngời ta phải có phơng pháp để phân biệt rất ít cây biến nạp từ một lợng lớn cây không biến nạp. Thực tế để xác định những cây đợc biến nạp ngời ta sử dụng hệ thống gen chọn lọc. Đặc biệt a thích là hệ thống chọn lọc trội, có nghĩa là chỉ những cây biến đổi gen có thể tái sinh và phát triển. Ngợc lại, ở một hệ thống chỉ thị đơn giản nh hệ thống chỉ thị gus, thì cả những cây không biến nạp cũng tái sinh (Phạm Thị Lý Thu, 2006)[11]. Dĩ nhiên phơng pháp này không hiệu quả, vì luôn luôn chỉ có một phần nhỏ tế bào thực vật đợc biến nạp. Một u điểm thứ hai quan trọng hơn là thao tác của hệ thống chọn lọc đơn giản để có thể phân tích nhanh một lợng lớn cây. Trong nhiều trờng hợp ngời ta sử dụng kháng sinh kanamycin cho chọn lọc trội. Tuy nhiên, ở nồng độ cao nó độc đối với phần lớn thực vật. Điển hình cho kháng sinh nhóm này là một aminoalcohol gắn với gốc đờng chứa nhóm amin. Bên cạnh kanamycin thu đợc từ Streptomyces kanamyceticus còn có gentamycin (từ
Micromonospora purpurea), neomycin (từ Streptomyces fradiae) và streptomycin (từ Streptomyces griseus) cũng thuộc nhóm này.
Bên cạnh kháng kanamycin cũng có một loạt các hệ thống chọn lọc khác đợc sử dụng. Có ý nghĩa là những gen kháng trội, ngoài neomycin phosphotransferase, còn có hygromycin B phosphotransferase và 3-enolpyruvyl shikimate 5- phosphatsynthetase (EPSP-synthetase).
Bên cạnh những gen chọn lọc cũng có những gen chỉ thị (reporter gene). Gen chỉ thị không chọn lọc trội, nhng sản phẩm gen của nó đợc chứng minh dễ dàng bằng phơng pháp hóa sinh, hóa học mô, kính hiển vi hoặc quang kế. Ví dụ: ngời ta có thể chứng minh chức năng của promoter đặc hiệu mô cũng nh sự biến nạp của những loại tế bào nhất định hoặc để kiểm tra một gen xác định có hoạt động hay không. Trong thực vật bậc cao đợc sử dụng nhiều nhất là β-D- glucuronidase, luciferase và mới đây là green fluorescent protein (GFP). Sự xác nhận do sự biến đổi của một chất đặc hiệu (glucuronid hoặc luciferin) và sự phát hiện ra sản phẩm xúc tác hoặc quang tử trong trờng hợp luciferse. Ngợc lại, ở GTP-protein có thể chứng minh đợc bằng kính hiển vi huỳnh quang của protein sau khi kích thích với ánh sáng có độ dài bớc sóng phù hợp. ở phơng pháp này không cần một cơ chất đặc hiệu.
Phần 3
VậT LIệU, NộI DUNG Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU