2.7.1. Tình hình sản xuất đậu tơng chuyển gen trên thế giới.
ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống đậu tơng là hớng mới và hiệu quả trong công tác chọn tạo giống cây trồng nói chung và cây đậu tơng nói riêng ở các quốc gia nông nghiệp trên thế giới. Trong đó, chọn tạo giống bằng công nghệ chuyển gen để tạo ra sản phẩm cây trồng chuyển gen đợc ứng dụng phổ biến và rộng rãi. Cây trồng đợc ứng dụng chuyển gen thành công đầu tiên là cây cà chua với gen tính trạng chín muộn để tăng hiệu quả kinh tế của sản phẩm.
Theo báo cáo của ISAAA, tính đến năm 2008- năm thứ 13 cây trồng CNSH đợc thơng mại hoá, trên thế giới đã có 25 quốc gia canh tác cây trồng CNSH tăng 3 quốc gia so với năm 2007 (từ năm 2007, ISAAA chính thức sử dụng thuật ngữ "Cây trồng CNSH" thay cho tên gọi cũ: "Cây trồng chuyển gen- hay cây trồng GMO" trong đó có 10 quốc gia thuộc nhóm các nớc phát triển và 15 quốc gia thuộc nhóm các nớc đang phát triển. Tổng diện tích cây trồng CNSH năm 2008 đạt 125 triệu ha tăng 15% so với năm 2007. Từ năm 1996 (năm đầu tiên cây trồng CNSH đợc thơng mại hoá) đến năm 2008, diện tích cây trồng CNSH tăng 74 lần, trở thành một công nghệ cây trồng đợc áp dụng nhanh nhất trong lịch sử nông nghiệp hiện đại thế giới. Tỷ lệ tăng nhanh cho thấy cây trồng CNSH đã phát triển tốt và mang lại lợi ích nhiều mặt về kinh tế, môi trờng, xã hội và xoá đói giảm nghèo. Tính đến thời điểm năm 2008, 8 quốc gia dẫn đầu có diện tích cây trồng CNSH đạt trên 1 triệu ha, sắp xếp theo thứ tự giảm dần là: Hoa Kỳ (62,5 triệu ha), Argentina (21 triệu ha), Braxin (15,8 triệu ha), ấn Độ (7,6 triệu ha), Canada (7,6 triệu ha), Trung Quốc (3,8 triệu ha), Paraguay (2,7 triệu ha), và Nam Phi (1,8 triệu ha). Các nớc đang phát triển đã từng bớc giữ vai trò quan trọng đối với phát triển của cây CNSH, điển hình là ấn Độ, từ vị trí thứ 23 (năm 2007), ấn Độ đã vơn lên trở thành quốc gia đứng thứ 4 (năm 2008) trên thế giới về diện tích cây trồng CNSH. 17 quốc gia còn lại, sắp xếp
theo diện tích cây trồng CNSH giảm dần là: Uruguay, Bolovia, Phillipin, Australia, Mexico, Tây Ban Nha, Chile, Colombia, Honduras, Burkina Faso, CH Séc, Rumani, Bồ Đào Nha, Đức, Ba Lan, Slovakia và Ai Cập. Theo thống kê của ISAAA, trong các loại cây trồng CNSH đang đợc thơng mại hoá trên thế giới tính đến năm 2008, cây đậu tơng CNSH có diện tích canh tác cao nhất đạt 65,8 triệu ha chiếm 53% diện tích cây trồng CNSH, tiếp theo là ngô CNSH chiếm 30%, bông CNSH chiếm 15%... Các quốc gia có tỷ lệ diện tích trồng cây đậu tơng CNSH cao nhất gồm: Mỹ, Argentina, Braxin, Paraguay, Uruguay, Bolovia, Tây Ban Nha,... Trong đó Mỹ có tới 80% diện tích đậu tơng đợc trồng đậu tơng CNSH (Clive Jame, 2008)[15].
2.7.2. Tình hình sản xuất đậu tơng chuyển gen ở Việt Nam.
Việc ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống đậu tơng ở Việt Nam vẫn còn rất hạn chế. Một số lợng nhỏ các nghiên cứu liên quan đến công nghệ sinh học cũng đã bắt đầu đợc triển khai ở Việt Nam. Nguyễn Thuý Điệp và cs, (2005) nghiên cứu về khả năng tái sinh của một số giống đậu tơng phục vụ cho kỹ thuật chuyển gen cho thấy môi trờng MS-B5 có bổ sung 10mg/l 2,4D cho tỷ lệ tạo callus cao nhất từ mẫu lá mầm, giống cho tỷ lệ tạo callus cao là DT96 (73%), DT90 (61,7%); DT84 (61,5%). Tỷ lệ tạo chồi cao nhất là ở môi trờng MS-B5 + 1mg/l zeatin +0,2mg/l GA3 + 30mg/l Glutamin saccaroza + 0,3% phytagel. (Trần Thị Cúc Hoà và cs, 2007) [8] công bố các kết quả nghiên cứu thử nghiệm về chuyển gen trên cây đậu tơng bao gồm: (i) Nghiên cứu khả năng đáp ứng chuyển gen của một số giống đậu tơng trồng tại Việt Nam, đa ra kết luận có 5 giống có thể sử dụng làm vật liệu chuyển gen; (ii) Đánh giá hiệu quả tạo dòng đậu tơng biến đổi gen bằng phơng pháp nốt lá mầm qua trung gian là Agrobacterium tumefaciens, hiệu quả chuyển gen của các dòng thử nghiệm đạt từ 1,5 đến 5%. Phòng thí nghiệm trọng điểm về Công nghệ Tế bào Thực vật thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp, Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn đã bắt đầu nghiên cứu chuyển gen chịu hạn từ cây lúa vào cây đậu tơng, đã bớc đầu thu đợc các kết quả khả quan. Các nghiên cứu trong nớc về chuyển gen trên cây đậu tơng tuy đã có những tiến bộ quan trọng, nhng cũng mới chỉ là bớc đầu, cho đến nay, cha có giống đậu tơng đợc đa ra đánh giá ở diện rộng trên đồng ruộng - giai đoạn cuối cùng trớc khi vào sản xuất.
Do hạn chế về thiết bị, kiến thức, và nguồn vật liệu,...việc nghiên cứu mới chỉ dừng ở mức độ phòng thí nghiệm và thử nghiệm trên diện hẹp, cha thể đa cây đậu t- ơng chuyển gen vào sản xuất thơng mại trong tơng lai gần.
2.8. Những nghiên cứu về gen GmNAC
Hạn hán là yếu tố bất lợi cho sự tăng trởng và phát triển của cây trồng và th- ờng dẫn đến thiệt hại đáng kể về năng suất kinh tế của cây, nh là cây đậu nành (glycine max.L). NAC là nhân tố phiên mã, gồm có một họ lớn TFs chuyên biệt của thực vật, cụ thể đã đợc thông báo để tăng cờng chịu hạn ở một số thực vật. Trong nghiên cứu này, 31 unigens có chứa đầy đủ các khung đọc mở mã hoá cho các protein GmNAC đã đợc xác định và sinh sản vô tính từ đậu tơng.
Phân tích trong vùng điều chỉnh có dấu hiệu kết thúc là "C" đã sử dụng nấm men, trong số 31 protein GmNAC, 28 có hoạt động kích hoạt phiên mã và sự biểu hiện những gen GmNAC này là khác nhau trong mỗi cơ quan khác nhau, và nó có chức năng đa dạng trong quá trình phát triển của cây trồng (Guo.Y. và cs, 2006)[19]. Lần đầu tiên, dòng đậu tơng biến đổi gen có khả năng kháng hạn rất cao đã đợc tạo ra khi chúng đợc biến nạp gen điều khiển- At DREB2A. Bộ gen của đậu tơng đã đợc giải mã hoàn toàn tạo điều kiện cho nghiên cứu toàn diện gen điều khiển (transcription factors) ở đậu tơng. ở đậu tơng có tổng số 208 gen điều khiển (translations factors) thuộc nhóm NAC/NAM chiếm 4% trong tổng số họ thực vật (Wang và cs, 2010)[30].
Thực vật thờng xuyên phải chịu đựng những tác động xấu của môi trờng. Theo các kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng, khả năng đáp ứng lại với các điều kiện bất lợi của môi trờng (stress) ở thực vật là tính trạng đa gen. Các gen trong nhóm gen đáp ứng ở các mức độ khác nhau và ở từng mô cơ quan khác nhau. Trong các nhân tố ảnh hởng lớn tới các thực vật đất, chủ yếu là tác động của nhiệt độ và sự thấm lọc, bao gồm hạn hán và nồng độ muối cao. Ví dụ nh hạn hán hiện đang đợc coi là một trong những nguyên nhân chính ảnh hởng đến năng suất cây trồng. Điều kiện hạn hán sẽ làm cho thực vật tạo ra hàng loạt phản ứng sinh hóa và sinh lý để tồn tại và thích nghi. Cụ thể, hạn hán sẽ dẫn đến việc thực vật đóng các khí khổng,
giảm hô hấp và quang hợp, giảm thể tích nớc trong các mô thực vật, quá trình sinh trởng chậm lại, tích luỹ và gia tăng mức độ biểu hiện của các protein: kinase, transcription factor (nhân tố phiên mã), phosphatases, proteases, late embryogenesis abundant (LEA), các protein sinh tổng hợp Abscisic acid (ABA), các protein sinh tổng hợp đờng (proline, mannitol, sorbitol) và hàng loạt các protein chức năng khác tham gia vào quá trình chịu hạn ở thực vật. Các protein tham gia vào quá trình chống hạn của thực vật đợc phân thành hai nhóm: nhóm protein chức năng trực tiếp chống lại điều kiện hạn (ABA, LEA, proline, mannitol, sorbitol...) và nhóm protein điều khiển sự biểu hiện của các gen chức năng tham gia vào quá trình chịu hạn (transcription factor, kinase...). Rất nhiều protein điều khiển quá trình phiên mã (transcription factor) đợc phát hiện trong điều kiện hạn. Thực nghiệm đã chứng tỏ rằng nhóm protein này đóng vai trò quan trọng trong cơ chế điều hòa và tăng cờng tính kháng hạn ở thực vật (Wang và cs, 2010)[30].
Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, sự biểu hiện của một hoặc một nhóm gen điều khiển sẽ dẫn tới sự hoạt động và tăng cờng của các gen trong một nhóm gen quy định tính trạng đa gen. Nghiên cứu về hệ gen đã đa ra kết luận gen điều khiển chiếm 6-9% tổng số gen trong mỗi hệ gen, ví dụ ở Arabidopsis có 2057 gen điều khiển đợc phát hiện trên tổng số 26.000 gen trong hệ gen. Rất nhiều nghiên cứu về đặc tính của gen điều khiển trên cây mô hình Arabidopsis và lúa đã chứng minh nhóm gen này đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong việc tăng cờng khả năng chống chịu ở thực vật. Vì vậy, việc phân lập và nghiên cứu đặc tính của các gen điều khiển đang trở thành vấn đề thời sự mang tính toàn cầu cả về nghiên cứu cơ bản lẫn nghiên cứu ứng dụng. Những sự kiện sớm trong phản ứng thích nghi của thực vật chống lại các stress là sự tiếp nhận và xuất hiện sự truyền các tín hiệu stress, dẫn tới hoạt hóa hàng loạt các phản ứng trao đổi chất và sinh lý khác nhau. Nghiên cứu trên thực vật mô hình Arabidopsis đã mang lại kết quả ngoạn mục về cơ chế phòng vệ bên trong ở thực vật, giúp chúng chống chịu tốt hơn các điều kiện stress khắc nghiệt. Hơn 30 họ các nhân tố phiên mã đợc dự đoán ở Arabidopsis có tham gia vào phản ứng chống chịu stress. Các thành viên của họ protein DREB hay CBF, MYB, bZIP và zinc-finger đã đợc phát hiện với vai trò điều hòa trong phản ứng phòng vệ chống
lại các stress. Gần đây thêm một họ khác là NAC (NAM, ATAF và CUC) cũng có chức năng tơng tự. Hầu hết các nhân tố phiên mã này điều khiển biểu hiện gen đích thông qua việc bám vào các cis-element trong promoter của các gen liên quan tới stress. Hai nhóm cis-element chính liên quan tới stress hạn đợc bám bởi các nhân tố phiên mã là DRE (drought-responsible element) bám bởi nhân tố DREB hoặc CBF và ABRE (abscisic acid-responsive element) đợc nhận dạng bởi nhân tố phiên mã bZIP. Nhiều báo cáo cho thấy rằng, tăng cờng biểu hiện các nhân tố phiên mã cảm ứng bởi stress nh DREB1A, DREB2A, SNAC1, CBF4, OSISAP1 làm tăng khả năng chống chịu lên điều kiện hạn hán, muối và nhiệt độ thấp ở
Arabidopsis và các loài khác.
Nhóm gen điều khiển quá trình phiên mã (gene transcription factor) đang là trọng tâm chú ý trong các nghiên cứu tăng cờng tính chống chịu với điều kiện thời tiết bất lợi (stress) ở thực vật. Khi cây bị stress, gen điều khiển hoạt động. Các protein điều khiển quá trình phiên mã đợc tổng hợp và bám vào trật tự DNA đặc hiệu (cis
acting element) trong đoạn điều khiển gen (promoter) của các gen chức năng tham gia điều khiển tính chịu stress và cùng với enzym sinh tổng hợp RNA (RNA polymerase) thực hiện quá trình phiên mã (biểu hiện) các gen chức năng này. Các nghiên cứu đoạn điều khiển gen đã phát hiện rất nhiều gen chức năng tham gia điều khiển tính chịu stress chứa trật tự DNA đặc hiệu. Vì vậy, khi một gen điều khiển biểu hiện sẽ sản sinh ra các protein bám vào trật tự DNA đặc hiệu trên đoạn điều khiển gen của nhiều gen chức năng tham gia điều khiển tính chịu stress và hoạt hoá sự biểu hiện của các gen này, kết quả là thực vật tăng cờng tính chống chịu với môi trờng. Điều này giải thích vì sao tính trạng chống lại các điều kiện bất lợi (stress) là tính trạng đa gen nhng chỉ cần chuyển một gen điều khiển tính chịu hạn có thể làm tăng sức chống hạn của cây chuyển gen. Các trình tự điều khiển nằm phía trớc các gen này cũng đang đợc đặc biệt quan tâm và nghiên cứu (Guo.Y. và cs, 2006)[19].
2.9. Gen gus
Gen gus là gen mã hóa cho sinh tổng β-glucuronidase. β-glucuronidase là một hydrolase xúc tác cho sự phân giải các β- glucuronide, sản phẩm phân giải có màu xanh chàm đặc trng dễ nhận biết. β- glucuronide thờng dùng nhất trong phản
ứng để nhận biết sự tồn tại của gen gus A (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D- glucuronide). Dung dịch X-Gluc không màu dới tác động của enzym β- glucuronidase sẽ chuyển sang màu xanh chàm đặc trng.
Hình 2.6. Phản ứng tạo ra sản phẩm 5,5’-dibromo-4,4’-dicloro-indigo có màu xanh
2.10. Các gen chỉ thị chọn lọc và các gen thông báo trong hệ thống vectơ biến nạp
ở tất cả các hệ thống biến nạp tỷ lệ cây tiếp nhận DNA bền vững thờng là rất thấp. Vì vậy, ngời ta phải có phơng pháp để phân biệt rất ít cây biến nạp từ một lợng lớn cây không biến nạp. Thực tế để xác định những cây đợc biến nạp ngời ta sử dụng hệ thống gen chọn lọc. Đặc biệt a thích là hệ thống chọn lọc trội, có nghĩa là chỉ những cây biến đổi gen có thể tái sinh và phát triển. Ngợc lại, ở một hệ thống chỉ thị đơn giản nh hệ thống chỉ thị gus, thì cả những cây không biến nạp cũng tái sinh (Phạm Thị Lý Thu, 2006)[11]. Dĩ nhiên phơng pháp này không hiệu quả, vì luôn luôn chỉ có một phần nhỏ tế bào thực vật đợc biến nạp. Một u điểm thứ hai quan trọng hơn là thao tác của hệ thống chọn lọc đơn giản để có thể phân tích nhanh một lợng lớn cây. Trong nhiều trờng hợp ngời ta sử dụng kháng sinh kanamycin cho chọn lọc trội. Tuy nhiên, ở nồng độ cao nó độc đối với phần lớn thực vật. Điển hình cho kháng sinh nhóm này là một aminoalcohol gắn với gốc đờng chứa nhóm amin. Bên cạnh kanamycin thu đợc từ Streptomyces kanamyceticus còn có gentamycin (từ
Micromonospora purpurea), neomycin (từ Streptomyces fradiae) và streptomycin (từ Streptomyces griseus) cũng thuộc nhóm này.
Bên cạnh kháng kanamycin cũng có một loạt các hệ thống chọn lọc khác đợc sử dụng. Có ý nghĩa là những gen kháng trội, ngoài neomycin phosphotransferase, còn có hygromycin B phosphotransferase và 3-enolpyruvyl shikimate 5- phosphatsynthetase (EPSP-synthetase).
Bên cạnh những gen chọn lọc cũng có những gen chỉ thị (reporter gene). Gen chỉ thị không chọn lọc trội, nhng sản phẩm gen của nó đợc chứng minh dễ dàng bằng phơng pháp hóa sinh, hóa học mô, kính hiển vi hoặc quang kế. Ví dụ: ngời ta có thể chứng minh chức năng của promoter đặc hiệu mô cũng nh sự biến nạp của những loại tế bào nhất định hoặc để kiểm tra một gen xác định có hoạt động hay không. Trong thực vật bậc cao đợc sử dụng nhiều nhất là β-D- glucuronidase, luciferase và mới đây là green fluorescent protein (GFP). Sự xác nhận do sự biến đổi của một chất đặc hiệu (glucuronid hoặc luciferin) và sự phát hiện ra sản phẩm xúc tác hoặc quang tử trong trờng hợp luciferse. Ngợc lại, ở GTP-protein có thể chứng minh đợc bằng kính hiển vi huỳnh quang của protein sau khi kích thích với ánh sáng có độ dài bớc sóng phù hợp. ở phơng pháp này không cần một cơ chất đặc hiệu.
Phần 3
VậT LIệU, NộI DUNG Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU
3.1. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu3.1.1. Vật liệu thực vật 3.1.1. Vật liệu thực vật
Vật liệu thực vật trong nghiên cứu đợc sử dụng là giống đậu tơng ĐVN9 đợc lấy từ Viện Ngô. Mẫu đậu tơng hiện đang đợc lu giữ tại Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ tế bào thực vật-Viện Di truyền Nông nghiệp.
3.1.2. Vật liệu vi khuẩn
Để xây dựng đợc quy trình tối u cho việc biến nạp gen vào đậu tơng, ban đầu đề tài đã sử dụng các chủng khuẩn đợc lu giữ tại Viện Di Truyền: EHA105, AGL-1, GV3101, C58, LBA4404. Các chủng này mang vector trên nền vector pBI chứa gen chỉ thị là gus/gen chọn lọc thực vật hpt (kháng hygromycin) đợc điều khiển bởi đoạn khởi động pRD29.
Hình 3.1. Cấu trúc vector pBI
Sau khi xác định quy trình tối u hoá chuyển gen vào đậu tơng. Các thí nghiệm tiếp theo sử dụng chủng vi khuẩn A. tumefaciens AGL-1 mang vector dựa trên nền vector pBI (promoter RD29, gen chịu hạn - GmNAC và hpt - kháng hygromycin). Gen GmNAC đợc xác định là một nhân tố phiên mã quan trọng liên quan đến cây chịu hạn và cây chịu nhiệt độ cao, gen này đợc phân lập từ cây đậu t-