3.1.1. Vật liệu thực vật
Vật liệu thực vật trong nghiên cứu đợc sử dụng là giống đậu tơng ĐVN9 đợc lấy từ Viện Ngô. Mẫu đậu tơng hiện đang đợc lu giữ tại Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ tế bào thực vật-Viện Di truyền Nông nghiệp.
3.1.2. Vật liệu vi khuẩn
Để xây dựng đợc quy trình tối u cho việc biến nạp gen vào đậu tơng, ban đầu đề tài đã sử dụng các chủng khuẩn đợc lu giữ tại Viện Di Truyền: EHA105, AGL-1, GV3101, C58, LBA4404. Các chủng này mang vector trên nền vector pBI chứa gen chỉ thị là gus/gen chọn lọc thực vật hpt (kháng hygromycin) đợc điều khiển bởi đoạn khởi động pRD29.
Hình 3.1. Cấu trúc vector pBI
Sau khi xác định quy trình tối u hoá chuyển gen vào đậu tơng. Các thí nghiệm tiếp theo sử dụng chủng vi khuẩn A. tumefaciens AGL-1 mang vector dựa trên nền vector pBI (promoter RD29, gen chịu hạn - GmNAC và hpt - kháng hygromycin). Gen GmNAC đợc xác định là một nhân tố phiên mã quan trọng liên quan đến cây chịu hạn và cây chịu nhiệt độ cao, gen này đợc phân lập từ cây đậu t- ơng. Sự biểu hiện gen GmNAC có thể đợc gây ra bởi hạn hán, độ mặn cao và đặc biệt là nhiệt độ cao.
Cấu trúc vector nh sau :
Hình 3.2. Cấu trúc vector dựa trên nền vector pBI 3.1.3. Hoá chất và dụng cụ thí nghiệm
3.1.3.1. Hoá chất
Các muối đa lợng, vi lợng, vitamin là MS (Murashige & Skoog, 1962), N6 (Chu và cộng sự, 1975) và B5 (Gambor, 1968).
Các chất kháng sinh Genteticine, Paromomycine, Cefotaxine, Hygromycine..., chất dẫn dụ Acetosyringone (AS), chất bổ sung: yeast extract, beef extract, trytone, sucrose, agarose...
Và các hoá chất sử dụng trong sinh học phân tử...
3.1.3.2. Máy móc và thiết bị
Các máy móc và thiết bị thí nghiệm chính dùng cho nghiên cứu bao gồm: Tủ -800C, cân điện tử, tủ ổn nhiệt 280C, tủ cấy vô trùng cấp II, máy ly tâm lạnh, bể nớc ổn nhiệt, máy PCR, pipette, nồi khử trùng, bộ điện di, máy soi gel và các trang thiết bị khác của phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp.
3.1.4. Phạm vi nghiên cứu
Đề tài: "Bớc đầu khảo sát quy trình chuyển gen chịu hạn GmNAC vào giống đậu tơng ĐVN9 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens".
Các thí nghiệm chuyển gen vào giống đậu tơng ĐVN9 đợc duy trì trong điều kiện nhân tạo.
Phạm vi nghiên cứu của đề tài tập trung vào giống đậu tơng ĐVN9 với gen cần chuyển là GmNAC.
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành3.2.1. Địa điểm 3.2.1. Địa điểm
Đề tài đợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng điểm về Công nghệ Tế bào Thực vật thuộc Viện Di truyền Nông Nghiệp, Từ Liêm, Hà Nội.
3.2.2. Thời gian tiến hành
Từ tháng 12/2009 đến tháng 5/2010. pRD29 T RD29 RD29 GmNAC Tnos LB RB
3.3. Nội dung nghiên cứu
* Nội dung 1: Tối u hoá quá trình chuyển gen vào ĐVN9 sử dụng vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens.
* Nội dung 2: Xây dựng quy trình chuyển gen chịu hạn GmNAC vào đậu tơng sử
dụng vector dựa trên nền vector pBI.
* Nội dung 3: Phân tích, đánh giá các cây đậu tơng sau khi chuyển gen chịu hạn
GmNAC.
3.4. Phơng pháp nghiên cứu
* Nội dung 1: Tối u hoá quá trình chuyển gen vào ĐVN9 sử dụng vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens
3.4.1. Thí nghiệm 1: Lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho việc chuyển gen
vào ĐVN9
CT 1 2 3 4 5 6
Chủng vi khuẩn
Đối
chứng LBA4404 GV3101 EHA 105 C58 AGL-1
3.4.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá ảnh hởng của mật độ vi khuẩn (OD600nm) lên
khả năng biến nạp gen vào đậu tơng thông qua tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus vào ĐVN9
Mật độ vi khuẩn ảnh hởng tới số lợng vi khuẩn tiếp xúc với mẫu biến nạp do đó có thể ảnh hởng tới tỷ lệ số vi khuẩn chuyển đợc đoạn T-DNA vào tế bào thực vật.
CT 1 2 3 4 5 6
OD600 0 0,5 0,8 1 1,2 1,5
3.4.3. Thí nghiệm 3: Đánh giá ảnh hởng của hàm lợng chất dẫn dụ
Acetosyringone (AS) lên khả năng biến nạp vào đậu tơng thông qua biểu hiện tạm thời của gen gus trên ĐVN9
CT 1 2 3 4 5 6
3.4. 4. Thí nghiệm 4: Đánh giá ảnh hởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khảnăng biến nạp gen vào đậu tơng thông qua tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus năng biến nạp gen vào đậu tơng thông qua tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus trên ĐVN9
CT 1 2 3 4 5 6
Thời gian đồng nuôi cấy
(ngày) 0 2 3 4 5 7
3.4.5. Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hởng của việc gây tổn thơng
nốt lá mầm đến sự biểu hiện của gen gus trên ĐVN9
Quy trình tiến hành:
Quan sát biểu hiện tạm thời của gen gus
Mẫu đậu tơng sau khi đồng nuôi cấy 5 ngày đợc nhuộm để quan sát biểu hiện của gen gus theo phơng pháp của Jefferson và cộng sự (1987), hoá chất nhuộm là X- Gluc.
Tỷ lệ biệu hiện tạm thời ở đây đợc tính theo số đốm và vùng màu xanh chàm đặc trng.
* Nội dung 2: Xây dựng quy trình chuyển gen chịu hạn GmNAC vào đậu tơng ĐVN9 sử dụng vector trên nền vector pBI
Chuyển sang môi tr ờng kéo dài chồi SEM
Ra rễ trên RM (2-3 tuần)
Ra cây
Cảm ứng tạo chồi và chọn lọc trên SIM (4 tuần)
Gây tổn th ơng nách lá mầm trong dịch khuẩn (trong 60 phút) Đồng nuôi cấy trên môi tr ờng CCM
(5 ngày) Hạt đậu t ơng
Nảy mầm trên GM Khử trùng bề mặt
Chủng vi khuẩn A.tumefaciens
Nuôi lỏng tạo huyền phù
3 - 5 ngày
3.4.6. Thí nghiệm 6: Chuyển gen chịu hạn GmNAC vào đậu tơng ĐVN9 thôngqua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (theo quy trình nêu trên) qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (theo quy trình nêu trên)
* Nội dung 3: Phân tích các cây đậu tơng chuyển gen sau tái sinh
3.4.7. Thí nghiệm 7: Phân tích các cây đậu tơng chuyển gen sau tái sinh
* Khảo sát sự có mặt tạm thời của gen chọn lọc Hpt (kháng hygromycin)
Ta tiến hành lấy lá cây đậu tơng chuyển gen và cắt thành hình vuông cho vào dung dịch (nớc cất, hygromycin với nồng độ đã sử dụng chọn lọc trong quá trình tái sinh). Sau đó, cứ 2 giờ ta quan sát và chụp ảnh 1 lần (8-12 tiếng). Nếu lá có hiện t- ợng chuyển màu vàng chứng tỏ cây đậu tơng đó cha có gen quan tâm chuyển vào. Nếu lá vẫn còn xanh thì ta có thể kết luận lá cây đem phân tích đã có gen quan tâm.
* Tách DNA tổng số đậu tơng chuyển gen
Các cây tái sinh đợc đa ra đất. Khi cây có lá thứ 7 thì tiến hành thu mẫu lá để tách chiết DNA. DNA đợc tách chiết và tinh sạch bằng phơng pháp CTAB của Saghai Maroof (1984) có cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.
Hóa chất đợc sử dụng để tách chiết DNA nh sau:
1) Đệm CTAB 100 ml gồm:
- CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) : 2,25 gam
- β-Mercapto ethanol : 250 àl
- EDTA (Ethylenediamine tetraacetate) : 4,5 ml
- NaCl 5M : 30 ml - Tris HCl 8,0 : 15 ml - H2O : 55 ml 2) Đệm TE EDTA pH 8,0 gồm: - Tris HCl 8,0 : 10 mM - EDTA 8,0 : 1 mM 3) Enzyme Rnase : 10 àg/ml 4) Cồn tuyệt đối lạnh 5) NaCl 5 M
7) Dung dịch (25:24:1) gồm Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol pha theo tỷ lệ 25/24/1.
8) Dung dịch rửa là cồn 75%.
Tách chiết DNA từ lá đậu tơng
- Bớc 1: Nghiền 0,3-0,5 gam lá đậu tơng trong nitơ lỏng thành bột mịn. - Bớc 2: Chuyển bột lá vào ống ly tâm 1,5 ml. Thêm 0,8 ml đệm CTAB đã ủ ở 650C trong 10 phút.
- Bớc 3: ủ các ống ly tâm ở 650C trong 90 phút, lắc nhẹ nhàng nhng dứt khoát 20 phút một lần để việc tách có hiệu quả.
- Bớc 4: Ly tâm 12.000 vòng/phút, hút lớp dịch nổi sang ống mới rồi bổ sung 0,7 ml dung dịch 24:1, lắc nhẹ nhàng trong 10 phút rồi tiến hành ly tâm trong 10 phút ở tốc độ 10.000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (lặp lại bớc 4 2 lần).
- Bớc 5: Hút lớp dịch nổi sang ống mới rồi bổ sung (25:24:1) tỷ lệ (1:1) lắc nhẹ rồi 20 trong 20 phút. Rồi tiến hành ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 10 phút.
- Bớc 6: Hút lớp dịch nổi sang ống mới bổ sung Isopropanol vào tỷ lệ 1:1 với mẫu, bổ sung thêm 3-5 àl NaCl 5M. Lắc nhẹ trong 10 phút. Để trong tủ -200C qua đêm.
- Bớc 7: Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 15 phút thu kết tủa.
- Bớc 8: Rửa với Ethanol 70% sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 20 phút (thực hiện 2 lần).
- Bớc 9: Loại bỏ dịch lỏng làm khô bằng máy ly tâm hút chân không (20 phút). - Bớc 10: Bốn sung 30 àl H2O + 1 àl RNAse sau đó ủ ở 370C trong 30 phút. Đem cất giữ ở -200C.
DNA sau khi tinh sạch theo phơng pháp trên đợc đo nồng độ nhờ máy quang phổ Nanodrop và dựa vào đó để pha loãng DNA ra nồng độ 50ng/àl bằng nớc cất khử ion để chuẩn bị cho các nghiên cứu tiếp theo.
* Phân tích các cây đậu tơng chuyển gen sau tái sinh bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen Hpt (kháng hygromycin)
Nguyên tắc của PCR là dựa vào sự phối hợp khả năng lai đặc hiệu của DNA và khả năng tổng hợp DNA in vitro của DNA polymerase để nhân bản in vitro các
đoạn gen khác nhau lên hàng triệu lần so với ban đầu. Do DNA polymerase hoạt động theo nguyên tắc cần phức hợp khuôn mồi, trong môi trờng thích hợp có các dNTP thì sẽ kéo dài thành sợi bổ sung với sợi khuôn. Vì vậy, để nhân bản đợc đoạn DNA đích, ngời ta cần phải biết đợc trình tự nucleotide ở hai đầu DNA cần nhân bản để từ đó thiết kế cặp mồi đặc hiệu. Mồi dùng trong phản ứng PCR thờng có chiều dài từ 10 đến 40 nucleotide, tuỳ thuộc vào mức độ khuyếch đại đặc hiệu đối với trình tự đích và tuỳ thuộc vào mục đích của các nhà nghiên cứu. Sau khi tiến hành chạy PCR với các mẫu phân tích, sự sai khác của DNA đợc kiểm tra dựa vào phơng pháp điện di.
Phân tích PCR tiến hành với cặp mồi đặc hiệu cho gen Hpt:
Hpt – F – 5’ – AGAAGAAGATGTTGGCGACCT– 3’
Hpt – R – 5’ – GTCCTGCGGGTAAATAGCTG – 3’
Để nhân đoạn có trình tự 514 bp của gen Hpt.
Hỗn hợp phản ứng bao gồm: - H2O 13,1 àl - Dung dịch đệm 10xPCR 2,0 àl - MgCl (50 mM) 1,0 àl - dNTP (1 mM) 2 àl - Mồi xuôi (50 ng/àl) 0,2 àl - Mồi ngợc (50 ng/àl) 0,2 àl - Tag-polymerase (5UI/àl) 0,5 àl - DNA (25 ng/àl) 1 àl
Phản ứng đợc chạy trên máy PCR với chu trình: 940C trong 10 phút, (940C trong 20 giây; 600C trong 20 giây; 720C trong 90 giây) x 10 chu kỳ, (940C trong 20 giây; 520C trong 20 giây; 720C trong 90 giây) x 25 chu kỳ, 720C trong 10 phút, 40C ở +∞. Sản phẩm PCR sau đó đợc điện di trên gel agarose nồng độ 1%.
Chuẩn bị bản gel:
- Chuẩn bị khay điện di, lau khô, cài lợc, chỉnh cho cân bằng.
- Chuẩn bị gel agarose 1%, đa vào lò vi sóng khoảng 2 phút cho agarose tan hoàn toàn trong dung dịch 1xTBE. Để hỗn hợp giảm nhiệt độ xuống còn 50-600C, bổ sung ethidium bromide rồi đổ vào khay điện di.
- Sau khoảng 15 phút gel đông lại, rút lợc khỏi bản gel. Đặt khay vào bể điện di, bổ sung thêm dung dịch 1xTBE cho ngập mặt gel.
Tra mẫu DNA:
- lấy 2àl đệm tra mẫu, thêm vào 8àl DNA sản phẩm, trộn đều rồi tra vào các giếng. Tra thêm DNA marker 1 kb vào giếng đầu tiên để xác định độ dài của các băng DNA.
- Lắp nguồn điện vào bể điện di, chỉnh điện thế từ 85-100V trong khoảng 45 phút đến 1 giờ. DNA sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dơng của điện trờng. Dựa vào vị trí của các vạch màu để dừng quá trình điện di.
- Nhuộm bản gel và chụp ảnh: Gel đợc soi dới ánh sáng tử ngoại ở bớc sóng 245-260 nm của máy soi và chụp ảnh bản gel bằng máy CLS-Microdoc (Clever Scientific Ltd,)
3.5. Các chỉ tiêu đánh giá
* Tỷ lệ mẫu sống đợc tính nh sau:
Tỷ lệ mẫu sống (%) = Tổng số mẫu sống x 100%
Tổng số mẫu ban đầu * Tỉ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus đợc tính nh sau:
TEE =
TDS TES
x100 (%)
Trong đó: TEE (transient expression efficiency) – tỉ lệ biểu hiện tạm thời TES (Total of Expression Samples) – tổng mẫu biểu hiện TDS (Total of Dying Samples) – tổng mẫu nhuộm
* Tần số chuyển gen bền vững
Tần số chuyển gen (STF) = x 100%
3.6. Các phơng pháp đánh giá
Số liệu thô sau khi thu thập đợc thống kê và xử lý trên phần mềm Microsolf Excel 2003.
số cây chuyển gen bền vững Tổng số mẫu biến nạp
Phần 4
KếT QUả NGHIÊN CứU Và THảO LUậN
4.1. Kết quả lựa chọn chủng vi khuẩn A. tumefaciens thích hợp cho chuyển gen
vào giống đậu tơng ĐVN9 thông qua biêu hiện tạm thời của gen gus
Trong thí nghiệm đã sử dụng các chủng vi khuẩn: EHA105, LBA4404, AGL- 1, GV3101 để lây nhiễm với mẫu ĐVN9 nảy mầm 3 ngày tuổi. Sau đó đồng nuôi cấy trên môi trờng CCM trong 5 ngày rồi đem nhuộm X-gluc ở 370C trong 48h. Kết quả thí nghiệm đợc trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Biểu hiện tạm thời của gen gus khi biến nạp các chủng
Agrobacterium khác nhau vào nốt lá mầm giống đậu tơng ĐVN9
CT Chủng khuẩn ĐVN9 Tổng số mẫu Số mẫu biểu hiện gus Tần số biểu hiện tạm thời (%) 1(Đ/C) - 100 0 0 2 GV3101 87 2 2,30 3 LBA4404 155 26 16,77 4 C58 70 3 4,29 5 EHA105 120 21 17,50 6 AGL-1 195 37 18,97
Ghi chú: (-) Không có chủng khuẩn
Các nghiên cứu trớc đây đã đa ra một số chủng Agrobacterium có khả năng xâm nhiễm hiệu quả vào nốt lá mầm của các giống đậu tơng khác nhau: Olhoft P.M. và cs, (2003)[24] đã thành công khi biến nạp chủng LBA4404 mang vector nhị thể pTOK233 với nốt lá mầm giống đậu tơng ‘Bert’; Xinping YI & Deyue YU (2006) đã thu đợc hiệu quả biến nạp cao khi kết hợp lây nhiễm chủng EHA105 mang vector pBI121 với nốt lá mầm giống đậu tơng Nannong88-1; Trần Thị Cúc Hòa và cs,
(2007)[8] cũng đã thu đợc cây chuyển gen tái sinh khi biến nạp chủng EHA101 mang vetor pZY102 vào nốt lá mầm giống đậu tơng PC19. Nhng cho tới nay hiệu quả biến nạp gen thông qua Agrobacterium ở đậu tơng còn tơng đối thấp, ngời ta vẫn cha tìm ra đợc một chủng hay một vector nào thích hợp có thể sử dụng để biến nạp vào tất cả các giống đậu tơng. Điều này phản ánh tính phức tạp trong mối tơng tác giữa Agrobacterium và thực vật.
ở công thức đối chứng (Đ/C) không có vi khuẩn mà thay vào đó là dịch LB không cho biểu hiện màu xanh chàm của gen gus sau khi nhuộm X-gluc ở giống đậu tơng ĐVN9, dịch nhuộm trong suốt, nh vậy kết quả thí nghiệm hoàn toàn đáng tin cậy.
Kết quả nghiên cứu bớc đầu của đề tài đã lựa chọn đợc các chủng LBA4404, EHA105 và AGL-1 để lây nhiễm với giống đậu tơng ĐVN9 cho hiệu quả biến nạp gen tạm thời tơng đối cao.
Đ/C GV3101 C58
AGL-1 LBA4404 EHA105
Hình 4.1. Biểu hiện tạm thời của gen gus trên đậu tơng
Trong số 5 chủng vi khuẩn sử dụng trong thí nghiệm thì chủng vi khuẩn AGL-1 cho tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở giống ĐVN9 đạt cao nhất 18,97%. Tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở hai chủng LBA4404 và EHA105 sai khác không nhiều (lần lợt là 16,77% và 17,50%).
Chủng GV3101 cho tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus thấp 2,3% và cây biểu hiện kém so với các chủng vi khuẩn còn lại. Do đó lựa chọn chủng thích hợp dùng để biến nạp vào giống đậu tơng ĐVN9 là AGL-1 đợc sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.2. ảnh hởng của mật độ vi khuẩn (OD600nm) lên tỉ lệ biểu hiện tạm thời của
gen gus
Mật độ vi khuẩn thể hiện số tế bào vi khuẩn trong một đơn vị thể tích và nó