Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc aspergillus niger

Enzyme glucose oxidase (GOD: βDglucose:oxygen 1oxidoreductase, EC 1.1.3.4) là enzyme xúc tác quá trình oxi hóa của βDglucose thành axit gluconic với sự tham gia của phân tử oxi như chất nhận điện tử, đồng thời giải phóng ra hydroperoxide (H2O2). GOD được biết đến từ những năm 1950, ngày nay được ứng dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm và các lĩnh vực khác như: y dược, hóa học lâm sàng, công nghệ sinh học, trong công nghiệp dệt… 10.

LỜI MỞ ĐẦU

Trong vài thập kỷ trở lại đây, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệsinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụnghầu hết trong các lĩnh vực kinh tế Enzyme đã dần từng bước làm thay đổi và nângcao một số các quá trình công nghệ trong chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chănnuôi, y tế…đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của xã hội

Enzyme glucose oxidase (GOD: β-D-glucose:oxygen 1-oxidoreductase, EC1.1.3.4) là enzyme xúc tác quá trình oxi hóa của β-D-glucose thành axit gluconicvới sự tham gia của phân tử oxi như chất nhận điện tử, đồng thời giải phóng rahydroperoxide (H2O2) GOD được biết đến từ những năm 1950, ngày nay được ứngdụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm và các lĩnh vực khác như: y dược, hóa họclâm sàng, công nghệ sinh học, trong công nghiệp dệt… [10]

Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu nhằm mục đích thu nhận

và ứng dụng GOD vào thực tế sản xuất nhưng ở nước ta thì việc nghiên cứu này cònrất hạn chế và chưa thể sản xuất được chế phẩm GOD Và đây đang là vấn đề thuhút sự quan tâm của các nhà khoa học trong và ngoài nước, nắm bắt tình hình đó tôi

đã chọn đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc Aspergillus niger”

Mục đích của đề tài:

- Xác định đơn biến ảnh hưởng của nồng độ các nguồn dinh dưỡng carbon,nitơ và muối canxi cacbonat trong môi trường nuôi cấy, để khả năng sinh

tổng hợp enzyme GOD ngoại bào từ nấm mốc Aspergillus niger là cao nhất.

- Xác định nồng độ muối (NH4)2SO4 và pH của môi trường nghiên cứu để hiệusuất thu nhận chế phẩm enzyme GOD ngoại bào thô là tốt nhất

- Thu nhận chế phẩm enzyme ngoại bào thô

Nội dung nghiên cứu của đề tài:

- Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của saccharose, peptone và CaCO3 đến quá

trình sinh tổng hợp enzyme GOD ngoại bào từ nấm mốc Aspergilus Niger.

- Sử dụng phương pháp đo độ hấp thụ quang phổ để đánh giá hoạt lực củaenzyme GOD ngoại bào

- Khảo sát nồng độ bão hòa của muối (NH4)2SO4 và sự ảnh hưởng của pH củaMTNC đến khả năng kết tủa enzyme GOD ngoại bào

- Thu nhận và xác định hoạt độ riêng của chế phẩm enzyme thô

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài:

- Đóng góp dẫn liệu nghiên cứu điều tra sự ảnh hưởng của một số nguồn dinhdinh dưỡng, tạo tiền đề cho quá trình tối ưu hóa môi trường nuôi cấy cho quá

trình sinh tổng hợp enzyme GOD ngoại bào từ nấm mốc Aspergillus niger,

- Kiểm định và khả năng sinh tổng hợp enzyme GOD ngoại từ nấm mốcAspergillus niger,

- Lựa chọn được điều kiện thích hợp cho khả năng kết tủa enzyme GOD ngoạibào Tạo tiền đề bước đầu xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm enzymeGOD tinh khiết

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về nấm mốc

Nấm mốc là vi sinh vật chân hạch, ở thể tản, tế bào không có diệp lục tố, sống

dị dưỡng (hoại sinh, ký sinh, cộng sinh), vách tế bào cấu tạo chủ yếu là chitin, cóhay không có cellulose và một số thành phần khác có hàm lượng thấp TheoElizabeth Tootyll (1984) nấm mốc có khoảng 5.100 giống và 50.000 loài được mô

tả, tuy nhiên, ước tính có trên 100.000 đến 250.000 loài nấm hiện diện trên trái đất[23]

1.1.1. Hình dạng, kích thước, cấu tạo của nấm mốc [23]

Một số ít nấm ở thể đơn bào có hình trứng, đa số có hình sợi, sợi có ngănvách (đa bào) hay không có ngăn vách (đơn bào) Sợi nấm thường là một ống hìnhtrụ dài có kích thước lớn nhỏ khác nhau tùy loài Đường kính của sợi nấm thường từ3÷5 µm, có khi đến 10 µm, thậm chí đến 1 mm Chiều dài của sợi nấm có thể tới vàichục centimet Các sợi nấm phát triển chiều dài theo kiểu tăng trưởng ở ngọn Cácsợi nấm có thể phân nhánh và các nhánh có thể lại phân nhánh liên tiếp tạo thành hệsợi nấm khí sinh xù xì như bông Trên môi trường đặc và trên một số cơ chất trong

tự nhiên, bào tử nấm, tế bào nấm hoặc một đoạn sợi nấm có thể phát triển thành một

hệ sợi nấm có hình dạng nhất định gọi là khuẩn lạc nấm

Tế bào nấm có cấu trúc tương tự như những tế bào vi sinh vật chân hạchkhác Vách tế bào nấm cấu tạo bởi vi sợi chitin và có hoặc không có cellulose.Chitin là thành phần chính của vách tế bào ở hầu hết các loài nấm trừ nhómOomycetina Những vi sợi chitin được hình thành nhờ vào enzyme chitinsyntase Tế

Hình 1.1 Sợi nấm và cấu tạo vách tế bào sợi nấm (theo Samson v ctv., 1995)

bào chất của tế bào nấm mốc chứa mạng nội mạc, không bào, ty thể và hạt dự trữ,đặc biệt cấu trúc ty thể ở tế bào nấm tương tự như cấu trúc ty thể ở tế bào thực vật.Ngoài ra, tế bào nấm còn có ribose thể và những thể khác chưa rõ chức năng Tếbào nấm không có diệp lục tố, một vài loài nấm có rải rác trong tế bào một loại sắc

tố đặc trưng mà Matsueda và cộng sự (1978) đầu tiên trích ly được và gọi làneocercosporin (C29H26O10) có màu tím đỏ ở nấm Cercosporina kikuchi Tế bào nấmkhông nhất thiết có một nhân mà thường có nhiều nhân Nhân của tế bào nấm cóhình cầu hay bầu dục với màng đôi phospholipid và protein, bên trong màng nhânchứa ARN và ADN

1.1.2 Dinh dưỡng và tăng trưởng của nấm mốc

Hầu hết các loài nấm mốc không cần ánh sáng trong quá trình sinh trưởng.Tuy nhiên, có một số loài lại cần ánh sáng trong quá trình tạo bào tử (Buller, 1950).Nhiệt độ tối thiểu cần cho sự phát triển là từ 20C đến 50C, tối thích là 220C÷270C vànhiệt độ tối đa mà chúng có thể chịu đựng được là 350C÷ 400C, cá biệt có một số ítloài có thể sống sót ở 00C và ở 600C

Nói chung, nấm mốc có thể phát triển tốt ở môi trường axit (pH = 6) nhưng

pH tối thích là 5÷6,5, một số loài phát triển tốt ở pH < 3 và một số ít phát triển ở pH

> 9 (Ingold, 1967) Oxi cũng cần cho sự phát triển của nấm mốc vì chúng là nhómhiếu khí bắt buộc và sự phát triển sẽ ngưng khi không có oxi và tất nhiên nước làyếu tố cần thiết cho sự phát triển Nấm mốc không có diệp lục tố nên chúng cầnđược cung cấp dinh dưỡng từ bên ngoài (nhóm dị dưỡng), một số sống sót và pháttriển nhờ khả năng ký sinh (sống ký sinh trong cơ thể động vật hay thực vật) hayhoại sinh trên xác bã hữu cơ, cũng có nhóm nấm rễ hay địa y sống cộng sinh vớinhóm thực vật nhất định Theo Alexopoulos và Mims (1979) cho biết nguồn dưỡngchất cần thiết cho nấm được xếp theo thứ tự sau: C, O, H, N P, K, Mg, S, B, Mn,

Cu, Zn, Fe, Mo và Ca Các nguyên tố này hiện diện trong các nguồn thức ăn vô cơđơn giản như glucose, muối ammonium sẽ được nấm hấp thu dễ dàng, nếu từnguồn thức ăn hữu cơ phức tạp nấm sẽ sản sinh và tiết ra bên ngoài các loại enzym

thích hợp để cắt các đại phân tử này thành những phân tử nhỏ để dễ hấp thu vàotrong tế bào.

1.1.3 Sinh sản của nấm mốc

Nấm mốc sinh sản dưới 2 hình thức chính: vô tính và hữu tính Trong sinhsản vô tính, nấm hình thành bào tử mà không qua việc giảm phân, trái lại trong sinhsản hữu tính nấm hình thành 2 loại giao tử đực và cái

 Sinh sản vô tính: The Alexopoulos và Mims (1979), nấm mốc sinh sản vô tính thể

hiện qua 2 dạng: sinh sản dinh dưỡng bằng đoạn sợi nấm phát triển dài ra hoặc phânnhánh và sinh sản bằng các loại bào tử

 Sinh sản hữu tính: Sinh sản hữu tính xảy ra khi có sự kết hợp giữa hai giao tử đực

và cái có trải qua giai đoạn giảm phân Quá trình sinh sản hữu tính trải qua 3 giaiđoạn:

- Tiếp hợp tế bào chất với sự hòa hợp 2 tế bào trần của 2 giao tử

- Tiếp hợp nhân với sự hòa hợp 2 nhân của 2 tế bào giao tử để tạo một nhânnhị bội

- Giảm phân giai đoạn này hình thành 4 bào tử đơn bội qua sự giảm phân từ 2nNST (nhị bội) thành n NST (đơn bội)

1.1.4 Tìm hiểu về nấm mốc Aspergillus [3]

Giống nấm Aspergillus có thể tới hơn 200 loài, sinh sản vô tính bằng cách tạo

thân quả hoặc cuống bào tử đính Bào tử đính phát triển thành tế bào rất dày ở bêntrong hệ sợi nấm gọi là tế bào gốc (foot cell) Nó tạo thành sợi cuống dài (stalk) vàkết thúc khi tạo ra một cấu trúc phồng hình củ hành gọi là túi ( Xung quanh túi làmột hoặc hai bộ cuống để đính bào tử gọi là cuống đính bào tử hay thể bình) Từ bộcuống đính bào tử cuối cùng, bào tử được sinh ra gọi là bào tử đính (conidia)

Không có một giống nấm sợi nào khác ngoài giống nấm này có hệ bào tử đínhtương tự Giống nấm này phát triển rất nhiều trong các vùng khí hậu nhiệt đới vàcận nhiệt đới.

Nấm mốc Aspergillus niger [28]

Aspergillus niger là một nấm sợi đơn bội và là một vi sinh vật rất cần thiết

trong lĩnh vực sinh học Ngoài việc sản xuất các enzyme ngoại bào và acid citric, A.niger được sử dụng cho xử các lý chất thải và biến đổi sinh học Nấm mốc

Aspergillus niger là loài phổ biến nhất của giống nấm mốc Aspergillus Nó gây ra

một căn bệnh gọi là mốc đen trên một số loại trái cây và rau quả như nho, hành tây,

và đậu phộng, và là một chất gây ô nhiễm phổ biến trong thực phẩm Nó tồn tại phổbiến trong đất, từ các môi trường trong nhà…

Cấu trúc tế bào: Quan sát vi thể các sợi nấm của A niger cho thấy các sợi

được phân chia và có vách ngăn rõ ràng, chiều dài sợi nấm nằm trong khoảng 1600μm Trên đỉnh sợi nấm có chứa các bào tử túi khác nhau có đường kính 4-60μm

900-Cấu trúc bộ gen: A niger có tổng kích thước bộ gen rằng khoảng 35,5-38,5

Mb và bao gồm khoảng 13.000 gen Trong số những gen này, khoảng 8.000-8.500gen có nhiệm vụ chức năng rõ ràng Ngoài ra, khoảng 14.000 khung đọc mở (openreading frames -ORF) đã được xác định trong hệ gen có khả năng có thể mã hóa

một protein Các trình tự DNA của A niger bao gồm khoảng 33.900.000 cặp bazơ

Hình 1 2 Hình ảnh về bào tử và sợi nấm A niger quan sát dưới kính

lup và kính hiển vi

Ứng dụng: A niger là một loài nấm mốc rất quan trọng, được sư dụng trong

các lĩnh vực công nghệ sinh học Nhiều sản phẩm sinh học và chế phẩm enzyme

được sản xuất từ A niger như acid citric, amylase, lipases, cellulolase, xylanase, protease… A niger cũng được sử dụng để xử lý các chất thải và quá trình biến đổi sinh học (biotransformations) Trong 20 năm qua, A niger được xem là nguồn vi

sinh vật chính để sản xuất chế phẩm enzyme

1.2. Công nghệ enzyme

1.2.1. Khái quát về enzyme:[7]

Ennzyme là chất xúc tác sinh học, có bản chất protein, hòa tan trong nước và trong dung dịch muối loãng Enzyme có phân tử lượng lớn từ 20.000 đến 100.000 dalton nên không qua được màng bán thấm

Tất cả các yếu tố làm biến tính protein như acid đặc, kiềm đặc, muối kim loạinặng…đều có thể làm enzyme bị biến tính và mất hoạt lực xúc tác

Enzyme có cường lực xúc tác rất lớn: ở điều kiện thích hợp hầu hết các phảnứng có xúc tác xảy ra với vận tốc nhanh gấp 108 - 1011 lần so với phản ứng không cóchất xúc tác

Enzyme có tính đặc hiệu cao: mỗi enzyme chỉ xúc tác làm chuyển hóa đượcmột hoặc một số cơ chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định Sự tác dụng

có tính chất lựa chọn này gọi là tính đặc hiệu của enzyme Enzyme có tính đặc hiệucao cho nên không tạo ra những sản phẩm phụ

Enzyme tác dụng trong điều kiện “êm dịu” enzyme thường tác dụng thíchhợp ở nhiệt độ 30÷500C, pH trung tính và ở áp suất thường, không cần nồng độ acidhay nồng đọ kiềm mạnh, áp suất cao, do đó không đòi hỏi các thiết bị chịu acid,kiềm và chịu áp suất cao đắt tiền

Tất cả các enzyme có nguồn gốc tự nhiên không độc Điều này có ý nghĩaquan trọng trong công nghiệp thực phẩm và trong y học

Trong sản xuất chế phẩm enzyme, cần chú ý đến những yếu tố:

1.2.2.1. Nguồn enzyme

Có thể thu nhận enzyme từ động vật như trypsin, chimotrypsin, từ thực vậtnhư papain của đu đủ, amylase của đại mạch Nhưng enzyme vi sinh vật là nguồnphổ biến và giá thành có ý nghĩa kinh tế nhất.

1.2.2.2. Cách thu nhận

Phải dựa vào đặc trưng sinh học của đối tượng Đối với vi sinh vật cần chú ýđến khâu chọn giống, vấn đề di truyền giống, khả năng sinh trưởngvà phát triển củagiống ,đặc tính sinh lí hóa sinh của giống

1.2.2.3. Các phương pháp nuôi cấy

- Môi trường nuôi cấy: Tùy chủng để chọn môi trường thích hợp, thành phần

dinh dưỡng phải phù hợp với sinh trưởng phát triển, đặc biệt là các yếu tố cần thiếtcho quá trình sinh tổng hợp protein Cần nắm vững cơ chế điều hòa để có nhữngthay đổi thích nghi

- Phương pháp nuôi cấy bề mặt: là nuôi cấy trên môi trường rắn với hàm

lượng nước thấp khoảng 15÷20% Ngoài thành phần dinh dưỡng là protein, tinh bột,khoáng …có thể trộn các chất làm xốp để thoáng khí

Tùy chủng để khống chế nhiệt độ, pH môi trường, độ ẩm, thời gian nuôicấy…cho đạt hiệu quả sinh tổng hợp enzyme cao nhất

- Phương pháp nuôi cấy chìm: là nuôi cấy trong môi trường dịch thể, hàm

lượng chất khô tối đa từ 25÷30%, thường từ 10÷15% Ngoài protein, tinh bột,khoáng…còn có thể bổ sung kích thích tố Cũng như trên, tùy chủng để khống chếnhiệt độ, pH môi trường, độ ẩm, thời gian nuôi cấy…cho đạt hiệu quả sinh tổng hợpenzyme cao nhất

Với hai phương pháp trên, mỗi loại có ưu khuyết điểm riêng Nuôi cấy bềmặt thường cho hiệu suất cao, dễ gở bỏ từng phần nếu bị nhiễm, nhược điểm là tốnmặt bằng nhiều, khó tự động hóa Phương pháp nuôi cấy chìm dễ tự động hóa, phảiloại bỏ hoàn tan khi bị nhiễm

1.2.2.4. Thu nhận chế phẩm enzyme:

Đối với canh trường bề mặt hay các đối tượng thực vật, có thể đồng hóa nếucần, đó dùng dung dịch đệm hay nước cất để chiết rút enzyme ra khỏi canh trường

bề mặt ta có dịch chiết enzyme Đối với canh trường bề sâu chỉ cần lọc bỏ sinh khối

là có dịch chiết tương tự trên

Sau đó có thể dùng các tác nhân kết tủa thuận nghịch như aceton, ethanol,muối trung tính để có chế phẩm enzyme ở dạng sạch hơn Từ chế phẩm sạch này,bằng kỹ thuật điện di, lọc gel… ta có thể tách từng phần để có enzyme tinh khiếthơn.Tùy mục đích sử dụng để ta tạo ra chế phẩm thích hợp

Để nâng cao giá trị sử dụng, hiện nay người ta thường tạo ra chế phẩmenzyme gọi là enzyme không tan

1.2.3. Enzyme cảm ứng [4]

Định nghĩa: Một quá trình sinh tổng hợp được gọi là cảm ứng nếu như nó chỉ

xảy ra ở mức độ đáng kể khi trong môi trường có cơ chất đặc hiệu của enzyme nàyhoặc các chất trao đổi có cấu trúc tương tự cơ chất Các enzyme thuộc loại này gọi

là enzyme cảm ứng, các cơ chất kích thích quá trình tổng hợp này gọi là chất cảmứng

Muốn tổng hợp được enzyme cảm ứng cần có 4 điều kiện:

Thứ nhất: có gen tương ứng trong nhiễm sắc thể,

Thứ hai: có nguyên liệu đầy đủ để xây dựng các phân tử enzyme đó (các axit

amin, các hợp phần coenzyme)

Thứ ba: có năng lượng cần thiết cho việc tổng hợp enzyme,

Thứ tư: có chất cảm ứng.

1.2.4. Phân loại enzyme [7]

Dựa vào vị trí khu trú của enzyme trong tế bào người ta chia làm 3 nhómchính:

Enzyme ngoại bào: Enzyme được sinh tổng hợp ra ở trong tế bào rồi sau đó

mới được tiết ra ngoài môi trường trong quá trình nuôi cấy chìm Đó là trường hợpcác enzyme hydrolase

Enzyme nội bào: Enzyme được tổng hợp và sử dụng ở bên trong tế bào Nói

chung các loại enzyme này thường có mặt hoặc dưới dạng liên hợp, dưới dạng liênkết hoặc dưới dạng bị ‘nhốt” trong các bào quan của tế bào

Các enzyme periplasmic: Là những enzyme nằm ở xoang ngoài màng sinh

chất nhưng trong màng tế bào

1.2.5 Ưu điểm của vi sinh vật trong công nghệ enzyme [4]

So với động vật và thực vật thì thu nhận enzyme từ vi sinh vật có nhiều lợi thế hơn

- Từ vi sinh vật có thể thu nhận được nhiều enzyme khác nhau, trong đó có nhữngloại không thể thu nhận từ động vật hoặc thực vật

- Bằng cách thay đổi điều kiện nuôi cấy hoặc dùng tác nhân điều chỉnh người ta cóthể điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật theo ý muốn

- Vi sinh vật có khả năng sinh sản và phát triển nhanh, tổng hợp enzyme với tốc độcực kỳ lớn trong thời gian ngắn Chính vì thế việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật íttốn thời gian

- Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các enzyme thu nhận

từ các nguồn khác

- Vi sinh vật có khả năng sinh sản, phát triển và tổng hợp enzyme trên các môi trườngdinh dưỡng đơn giản, dễ kiếm, rẻ tiền (có thể là phế liệu của các ngành sản xuấtkhác nhau) Cho nên việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật cũng rất kinh tế

1.3. Giới thiệu về enzyme glucose oxidase

Glucose oxydase (GOD: β-D-glucose: oxygen 1-oxidoreductase, EC 1.1.3.4)

là enzyme xúc tác quá trình oxi hóa β-D-glucose thành acid gluconic bằng cách sửdụng oxi làm chất chất nhận điện tử, đồng thời sinh ra hydroperoxit (H2O2) Vi sinhvật sinh enzyme GOD gần đây đã nhận được sự qua tâm rộng rãi trong việc mởrộng ứng dụng trong hóa học, dược phẩm, thực phẩm, đồ uống, hóa học lâm sàng,công nghệ sinh học và trong một số ngành công nghiệp khác Ứng dụng mới củaGOD là sử dụng trong thiết bị cảm biến sinh học đã làm gia tăng nhu cầu vềenzyme này trong những năm gần đây Hiện nay đang xem xét và nghiên cứu vềquá trình sản xuất, thu nhận, mô tả đặc tính, cố định và ứng dụng của GOD Quátrình sản xuất GOD bằng phương pháp lên men và phương pháp tái tổ hợp được

xem xét một cách cặn kẽ Nhiều kỹ thuật tinh chế khác nhau nhằm nâng cao hiệuquả thu nhận GOD đều được nghiên cứu và công bố Đã có nhiều nghiên cứu về cácvấn đề động học, tính ổn định và các đặc trưng của enzyme này Do đó, ứng dụngcủa GOD ngày càng rộng rãi trong các ngành công nghiệp khác nhau [19].

1.3.1. Đặc trưng của glucose oxidase [20]

Trọng lượng phân tử của GOD nằm trong khoảng từ 130÷175kDa GOD có

tính đặc hiệu cao đối với β-anomer của D-glucose, còn α-anomer không phải là cơchất thích hợp GOD thể hiện hoạt tính thấp với cơ chất 2-deoxy-D-glucose, D-mannose và D-galactose Những chất ức chế GOD bao gồm p-chloromecuri-benzoate, Ag+, Hg2+, Cu2+, hydroxylamine, hydrazine, phenylhydrazine, dimedone

và natri bisulphate Năm 1968, Nakamura và Fujiki đã thực hiện các nghiên cứu so

sánh trên GOD của A niger và P amagasakiense có trọng lượng phân tử của chúng

lần lượt là 152 và 150 kDa GOD sinh ra bởi cả hai loài sử dụng nguồncacbohydrate tương tự nhau trong đó chủ yếu là glucose, mannose và hexosamine

GOD từ A niger chứa mannose và hexosamine nhiều hơn GOD từ P amagasakiense nhưng ít glucose hơn Cacbohydrate tổng số được tìm thấy là 16% của A niger và 11% của P amagasakiense Axit amin chứa trong hai enzyme bao gồm: GOD từ A niger chứa histidine, arginine và tyrosine nhiều hơn và chứa lysine

và phenylalanine ít hơn GOD từ P amagasakiense Vùng pH tối ưu của GOD từ A niger và P amagasakiense lần lượt là 3,5÷6,5 và 4,0÷5,5 Như vậy, GOD từ A niger có vùng pH rộng hơn GOD từ P amagasakiense.

1.3.2. Thành phần cấu tạo của glucose oxidase[20]

GOD từ nấm sợi là hợp chất dimer glycoprotein gồm hai chuỗi polypeptidtiểu đơn vị đồng thể được liên kết với nhau bởi liên kết cộng hóa trị của cầudisulfua Hình 1.4 mô tả phân nửa FDA và trung tâm hoạt động chính của tiểu đơn

vị GOD thu nhận từ P amagasakiense Cấu trúc của GOD từ P amagasakiense chothấy mỗi tiểu đơn vị đều chứa một mol liên kết bền vững Nhưng co-factor liên kết

với phân nửa FDA không phải là liên kết cộng hóa trị GOD từ P amagasakiense bị

glycol hóa với mannose - hợp chất chứa nhiều hydrocarbonate với hàm lượng xấp

xỉ 11÷13%

Hình 1 2 Cấu trúc phân nửa FDA và trung tâm hoạt động chính của GOD thu

nhận từ P amagasakiense (wohlfahrt và các đồng nghiệp,1999) Các thành phần của trung tâm hoạt động của GOD từ P amagasakiense bao

gồm Tyr-73, Phe-418, Trp-430, Arg-516, Asn-518, His-520 và His-563 (hình 1.4) Năm 2000 Witt và các đồng nghiệp cho rằng Arg-516 là acid amin có vai trò quantrọng nhất ảnh hưởng đến hiệu quả kết hợp với β-D Glucose bởi GOD, trong khi đóảnh hưởng của Ans-518 là thấp hơn Còn các chất thơm còn lại là Tyr-73, Phe-418

và Trp-430 đóng vai trò quan trọng trong việc định hướng đúng đắn cơ chất mộtcách nhanh nhất có thể cho phản ứng oxi hóa glucose His-520 và His-563 hìnhthành liên kết hydro với gốc –OH từ vị trí số 1 của glucose trong suốt quá trìnhphản ứng

1.3.3 Một số đặc điểm của glucose oxidase

1.3.3.1. Đặc điểm cơ chất [20]

GOD có tính đặc hiệu cao với β-D-glucose và ít thể hiện hoạt tính với nhữngloại đường khác, nó oxi hóa β-D-glucose với sự có mặt của phân tử O2 ở vị trí C-1thành δ-glucono-1,5-lactone, sau đó tự động thủy phân thành axit D-gluconic.Những đặc điểm cấu trúc này và phản ứng đồng phân lập thể cho sự phân biệt rõràng giữa GOD và pyranose oxydase, là một homotetramer, oxi hóa D-glucose ở vịtrí C-2

1.3.3.2. pH tối thích và độ bền [20]

Hoạt tính của enzyme phụ thuộc vào trạng thái ion hóa của amino axit ởtrạng thái hoạt động pH đóng vai trò quan trọng duy trì hình thể riêng của enzyme

Hầu hết protein chỉ hoạt động trong khoảng pH hẹp, thường là từ 5÷9 pH tối thíchcủa GOD thay đổi từ 5 đến 7 GOD từ hầu hết nấm mốc có pH tối thích trong

khoảng axit đến trung tính như A niger và P chrysogenum có pH tối thích là 5,0÷6,0 Trái lại, GOD thu được từ P funiculosum 433 và P canescens có pH tối

thích nằm trong khoảng kiềm nhẹ từ 6 ÷ 8,6

40÷600C đối với A niger và P amagasakiense ATCC 28686.

1.3.3.4. Độ bền khi bảo quản [20]

GOD có chu kì bán rã trong khoảng 30 phút ở 370C GOD cố định có hiệuquả cao hơn trong ứng dụng ở 370C Rượu đa chức bao gồm ethylene glycol,glycerol, erythritol, xylitol, sorbitol và polyethylene glycol có thể ổn định GOD từ

A niger GOD đông khô giữ ổn định được trong ít nhất 6 tháng ở -200C

1.3.3.5. Cơ chế phản ứng của glucose oxidase [20]

GOD là một flavoprotein xúc tác quá trình oxi hóa của β-glucose thành glucono-δ-lactone và H2O2 sử dụng phân tử oxi như chất nhận điện tử Phản ứngnày có thể được tách ra thành một giai đoạn khử và một giai đoạn oxi hóa (Hình1.5)

Hình 1 3 Biểu diễn cơ chế của phản ứng GOD [20]

Trong giai đoạn khử, GOD xúc tác quá trình oxi hóa β-glucose thành glucono-δ-lactone, chất này sẽ bị thủy phân thành axit gluconic mà không cầnenzyme xúc tác Sau đó vòng flavine adenine dinucleotide (FAD) của GOD bị khửthành FADH2 Trong giai đoạn oxi hóa, GOD dạng khử bị oxi hóa trở lại bởi oxi tạo

D-ra H2O2 H2O2 bị phân giải bởi catalase (CAT) tạo thành nước và oxi Năm 1992,

Witteveen tìm thấy enzyme lactonase (EC 3.1.1.17) trong A niger xúc tác quá trình

thủy phân của glucono-δ-lactone thành axit gluconic

1.3.4. Ứng dụng của enzyme glucose oxidase [18]

GOD có vài ứng dụng trong thương mại bao gồm loại bỏ glucose trong sảnxuất bột trứng sấy, cải thiện màu sắc, mùi vị và thời hạn sử dụng của nguyên liệuthực phẩm, loại bỏ oxi từ nước ép trái cây, thức uống đóng hộp, và từ xốtmayonnaise để ngăn cản sự trở mùi (sự ôi) Nó cũng được sử dụng trong bộ dụng cụphân tích glucose tự động cùng với catalase [11] và chủ yếu là trong bộ cảm biếnsinh học để phát hiện và đánh giá glucose trong dung dịch công nghiệp và trongdịch của cơ thể như máu và nước tiểu [15] GOD có tác dụng chống lại với những

tác nhân gây bệnh khác nhau phát sinh từ thực phẩm như Salmonella infantis, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Bacillus cereus, Campylobacter jejuni và Listeria monocytogens GOD cũng được sử dụng như thành phần của kem

đánh răng [11], cho sản xuất axit gluconic, như chất bảo quản thực phẩm, những bộcảm biến glucose ứng dụng cho những bệnh nhân tiểu đường Những nghiên cứumới về GOD nhằm tìm những thuộc tính hữu ích cho các ứng dụng trong công nghệsinh học tiếp tục được quan tâm nhiều mặc dù GOD thương mại sẵn có rất phongphú

Vài ứng dụng của nó trong công nghiệp được mô tả sau đây

1.3.4.1. Bộ cảm biến glucose để kiểm tra bệnh đái tháo đường

Những người bị đái tháo đường cần kiểm tra thường xuyên lượng glucosetrong máu để biết được sự dao động lượng glucose có thể đẫn đến sự tăng đườnghuyết (lượng glucose trong máu cao) và sự giảm đường trong máu (lượng glucosetrong máu thấp) để kiểm soát căn bệnh Hiện tại, quá trình kiểm tra như thế được

thực hiện bằng cách sử dụng mẫu máu trích từ ngón tay và máy đo xách tay vài lầnmột ngày Bộ cảm biến được sử dụng để đo lượng đường glucose trong máu GOD

là một trong những enzyme có thể được dùng trong bộ cảm biến Những bộ cảmbiến làm việc bằng cách giữ lại vết của lượng electron đi qua một enzyme khi nối

nó với một điện cực và đo điện tích tổng Bộ cảm biến được sử dụng với nhiều mụcđích khác nhau như: kiểm tra glucose cho sự lên men, phân tích nồng độ glucosetrong thức uống không cồn, dùng cho kiểm tra máu và huyết thanh, cảm biến sinhhọc nhiệt thu nhỏ dùng cho tất cả loại máu, cảm biến glucose dùng cho tất cả loạimáu, bộ cảm biến sinh học glucose cho huyết thanh từ máu người

1.3.4.2. Pin sinh học

Pin sinh học là cần thiết khi muốn có nguồn năng lượng nhỏ để duy trì các quátrình hoạt động Pin sinh học chuyển năng lượng hóa sinh thành năng lượng điện sửdụng chất xúc tác sinh học Pin sinh học gồm bộ hai điện cực được điều chỉnh bởienzyme xúc tác sinh học để oxi hóa/khử cơ chất [20]

Một kiểu pin sinh học sử dụng enzyme làm chất xúc tác sinh học ví dụ nhưGOD và microperoxidase-8 được sử dụng trên anot và catot [20] Trên anôt GODoxi hóa glucose tạo ra H2O2, nó đi qua lớp màng xốp ngăn giữa hai điện cực và bịkhử bởi enzyme microperoxidase-8 trực tiếp nhận điện tử từ thanh điện cực cacbon.1.3.4.3. Phụ gia thực phẩm và thức uống

GOD được sử dụng thành công trong việc loại bỏ glucose dư và O2 trongthực phẩm và đồ uống để kéo dài thời hạn sử dụng H2O2 tạo ra bởi phản ứngenzyme là chất khử trùng tốt và có thể được loại bỏ sau đó bằng cách sử dụngenzyme thứ hai catalase (CAT) có thể chuyển H2O2 thành O2 và nước GOD/CATđược sử dụng để loại bỏ glucose trong quá trình sản xuất bột trứng, tránh quá trìnhsẫm màu gây ra bởi phản ứng Maillard và sử dụng trong công nghiệp làm bánh đểgiúp cải thiện cảm quan cho ruột bánh mỳ và bánh sừng bò

GOD còn có thể được sử dụng để loại bỏ oxy của không khí ở đầu chai đồuống trước khi chúng được đóng kín Hệ thống GOD/CAT kiểm soát quá trình sẫmmàu phi enzyme trong bảo quản và chế biến trái cây, purê Quá trình loại bỏ oxy bởi

hệ thống enzyme đem lại hiệu quả ổn định Thêm vào đó, GOD được sử dụng để

ngăn ngừa sự mất màu và vị cũng như để ổn định màu, vị trong bia, cá, đồ hộp và

đồ uống không cồn bằng cách loại bỏ oxy từ thực phẩm và đồ uống Ví dụ như,chúng được sử dụng để giảm sự biến màu xảy ra trong rượu và mayonnaise Hệthống enzyme GOD/CAT có thể làm chậm quá trình oxi hóa lipit trong mayonnaisegiữ ở 50C và 250C Trong mayonnaise có chứa dầu đậu tương nguyên chất, và đếnmột nửa dầu thực vật thêm vào với dầu cá, hệ thống enzyme có chức năng loại bỏoxy trong quá trình oxy hóa glucose, do đó làm giảm sự có mặt của oxy cho sựchuyển hóa lipit Năm 2006, Bonet đã nghiên cứu ảnh hưởng của GOD đến tínhchất lưu biến bột nhào và chất lượng bánh mỳ và thấy rằng GOD có khả năng cảithiện bột nhào lúa mì và tính chất bánh mỳ Tuy nhiên, mức độ enzyme thêm vàophải rất cẩn thận, vì có thể có những ảnh hưởng ngược lại do thêm vào enzyme quáthừa

1.3.4.4. Sản xuất rượu độ cồn thấp

GOD được sử dụng trong công nghiệp sản xuất rượu, nó có thể làm giảm độcồn của rượu nhờ loại bỏ glucose vì glucose tạo ra cồn Nhiều thí nghiệm được thựchiện và người ta nhận thấy quá trình xử lý trước nước quả nho với hệ enzymeGOD/CAT để chuyển bớt glucose có trong dịch quả thành axit gluconic, quá trìnhnày có thể làm giảm độ cồn khoảng 2% Thêm vào đó, GOD còn có khả năng ứcchế quá trình hỏng rượu nhờ vào tác dụng diệt khuẩn của nó [20]

GOD có khả năng sử dụng trong công nghiệp rượu, nó làm giảm độ cồn củarượu nhờ loại bỏ glucose (bằng cách chuyển thành δ-glucono-1,5-lactone), vìglucose có thể chuyển thành cồn Các thí nghiệm đã chỉ ra rằng xử lý rượu bằngGOD có thể làm giảm độ cồn sinh ra khoảng 2% Thêm vào đó, GOD có thể ức chếquá trình hỏng rượu nhờ vào khả năng diệt khuẩn ảnh hưởng lên vi khuẩn axitaxetic và vi khuẩn axit lactic trong suốt quá trình lên men

1.3.4.5. Vệ sinh răng miệng

GOD cũng như lactoperoxidase có thể được sử dụng như chất chống vikhuẩn trong sản phẩm chăm sóc răng miệng Khoang miệng chứa những loài

Streptococci như Streptococci mutans, ảnh hưởng đáng kể làm phân hủy răng và có

ở hầu hết mọi người H2O2 tạo thành bởi hoạt động của GOD là chất diệt khuẩn hiệu

quả Khả năng của GOD tiêu diệt S mutans là nhờ có chuỗi kháng thể lớn.

1.3.4.6. Axit gluconic

GOD cũng được sử dụng trong thương mại để sản xuất axit gluconic nhờ quátrình thủy phân của δ-glucono-1,5-lactone, sản phẩm cuối cùng của xúc tác GOD.Axit gluconic được sử dụng như phụ gia thực phẩm hoạt động giống bộ điều chỉnhaxit, trong dung dịch khử trùng hay quá trình tẩy màu trong sản xuất thực phẩm vànhư muối trong hợp phần hóa học hay cấp thuốc Axit gluconic cũng được sử dụngnhư chất làm chua nhẹ trong thịt và công nghiệp da thuộc Nó còn được sử dụngtrong công nghiệp xây dựng như phụ gia trong xi măng để tăng lực cản và sức bềndưới điều kiện thời tiết khắc nghiệt Nó xuất hiện tự nhiên trong mật ong, trái cây vàrượu

1.3.4.7. Công nghiệp dệt

GOD có những ứng dụng trong công nghiệp dệt như tạo ra H2O2 để tẩy trắng.Năm 2002, Tzanov đã cố định GOD liên kết cộng hóa trị trên chất nền nhôm oxit vàkính cho kết quả khôi phục cao Lượng H2O2 lớn nhất là 0.35 g/l và 0.24 g/l đạtđược sau 450 phút để GOD cố định trên chất nền kính và nhôm oxit một cách riêngbiệt H2O2 tạo thành được kiểm tra để tẩy trắng sợi bông dệt và nhận thấy phù hợp

để tiêu chuẩn hóa quá trình tẩy màu Từ khi axit gluconic được sản xuất, người takhông sử dụng chất ổn định khác Năm 2008, Opwis ứng dụng đồng thời GOD vàperoxidase, ông bắt đầu với glucose như cơ chất cho GOD, H2O2 được tạo thành vàđược sử dụng ngay lập tức bởi POD oxi hóa hợp chất màu trong bể nhuộm Nhữngenzyme này được sử dụng trong quá trình khử màu và tẩy trắng của sợi tự nhiêntrong công nghiệp dệt

1.3.5. Lên men sản xuất enzyme glucose oxidase

1.3.5.1 Những loài nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzyme glucose

oxidase [20]

Nguồn vi sinh vật phổ biến nhất cho sản xuất lên men GOD là các loài

Aspergillus, Penicillium và Saccharomyces GOD được tìm thấy trong nhiều dòng

sau ở những loài khác nhau như Aspergillus niger, Phanerochaete chrysosporium, Talaromyces flavus và Penicillum spp Hiện tại, A niger, P amagaskiense và Penicillium vitale được sử dụng để sản xuất công nghiệp loại enzyme này Trong đó

A niger được dung để sản xuất enzyme nội bào, còn Penicillium được dùng để sản

xuất enzyme ngoại bào Hầu hết GOD thương mại đã sản xuất được tách từ khuẩn

ty của A niger và nuôi chủ yếu để sản xuất axit gluconic hay muối của nó như natri

gluconate hay calcium gluconate

Bảng 1 1 Một số chủng vi sinh vật sản xuất GOD:

Chủng VSV Phương pháp nghiên cứu Hoạt tính Tác giả

Penicillium variabile P16 So màu 5.52U/ml Petruccioli et al

(1999)Gen GOD của chủng

A.niger được gắn trên

S.cerevisiae

(1993)Maiherbe et al(2003)

Aspergillus niger (BTL) So màu 7.5U/ml Hatzinikolaou và

Macris (1995)S.cereviae tái tổ hợp So màu 3,43U/mg sinh

khối khô Kapat et al (2004)

Aspergillus niger AM111 So màu 2,5 U/ml Fiedureck và

Gromada (2000)Penicillium pinophilum

Aspergillus niger ZBY-7 Chuẩn độ 6U/ml Tongbu et al

(1996)

1.3.5.2 Các thông số ảnh hưởng đến quá trình sản xuất enzyme [20]

1 Nguồn carbon

Trong suốt quá trình lên men, nguồn cacbon không chỉ đóng vai trò nhưthành phần chính để xây dựng vật liệu tế bào mà còn được sử dụng trong quá trìnhtổng hợp polysaccharide và đóng vai trò là nguồn cung cấp năng lượng cho tế bào

Tỷ lệ cacbon được chuyển hóa có thể ảnh hưởng đến sự hình thành sinh khối haysản phẩm chuyển hóa (chính hoặc phụ) Lượng đường chuyển hóa càng nhanh sẽgiúp tế tào phát triển càng nhanh, kết hợp với sự tạo thành lượng lớn các sản phẩmliên quan hay các chất chuyển hóa chính

Năm 1995, Hatzinikolaou và Macris đã nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn

cacbon khác nhau đến sự phát triển và sinh tổng hợp GOD của A niger Mặc dù nấm mốc A niger phát triển trên tất cả các nguồn cacbon mà họ đã kiểm tra, nhưng

enzyme GOD chỉ thể hiện hoạt tính cao khi sử dụng các nguồn glucose, saccharose

và rỉ đường Hơn nữa, glucose (ở dạng tinh khiết hoặc là sản phẩm thuỷ phânsaccharose bởi invertase) là tác nhân cảm ứng chính cho sự phiên mã gen củaenzyme GOD Năm 2001, Kona đã sử dụng saccharose như nguồn cacbon chính khi

sử dụng nguồn dinh dưỡng thương mại có chứa nước ngâm bắp để thực hiện lên

men cho A niger Năm 1960, Kusai nhận thấy saccharose là nguồn carbon tốt nhất cho P amagasakiense sản xuất GOD Dù sao, nếu pH của môi trường phát triển

được duy trì trong suốt quá trình nuôi thì glucose là nguồn cacbon được lựa chọn

2 Nguồn nitơ

Nitơ vô cơ bao gồm khí amoniac, muối amoni hoặc nitrate Amoniac được

sử dụng để điều chỉnh pH Muối amoni như amoni sulphate thường tạo môi trườngaxit khi vi sinh vật sử sụng ion NH4 và giải phóng ra axit tự do Mặt khác, nitratethường gây ra khuynh hướng kiềm hoá khi chúng được chuyển hóa Amoni nitratetrước hết sẽ gây ra khuynh hướng axit khi ion amoni được sử dụng Khi các ionamoni cạn kiệt, nitrat sẽ được sử dụng như nguồn nitơ thay thế và tạo ra môi trườngkiềm Năm 1995, Hatzinikolaou và Macris nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn

nitơ khác nhau đến sự phát triển và hoạt tính tổng của GOD từ A niger nuôi trên

nguồn carbon duy nhất là saccharose và rỉ đường Họ nhận thấy nồng độ peptone cóảnh hưởng rõ ràng đến toàn bộ quá trình sản xuất GOD Với saccharose và rỉ đườnglàm nguồn cacbon, hoạt tính cực đại của GOD đạt được lần lượt tại 1÷2% và0.2÷0.3% peptone Năm 2001, Kona khảo sát ảnh hưởng của nước ngâm bắp là

nguồn dinh dưỡng duy nhất cho sản xuất GOD từ A niger và nhận thấy hoạt tính

của GOD tăng lên từ 550 Uml− 1 đến 640 Uml− 1, trong khi đó các nguồn nitơ kháckhông thể cải thiện thêm khả năng tổng hợp GOD

3 Canxi cacbonat (CaCO 3) - tác nhân cảm ứng

Năm 1995, Petruccioli nhận thấy việc bổ sung của CaCO3 vào môi trườngphát triển trong bình tam giác và trong thùng lên men sẽ ngăn cản pH giảm xuốngtrong suốt quá trình nuôi, điều này là cần thiết khi tối ưu hóa quá trình sản xuấtGOD Năm 1988, Rogalski cho thấy sự tổng hợp của GOD rất nhạy cảm bởi sự tănglên của nồng độ CaCO3 (0÷4,5%) ứng với hoạt tính cực đại tăng lên gần 3,5%.Hatzinikolaou và Macris cho rằng CaCO3 gây cảm ứng mạnh trong quá trình sinh

tổng hợp GOD của A niger và đã chứng minh nó là cần thiết cho quá trình sản xuất Năm 1996, Hatzinikolaou đã nuôi A niger sử dụng môi trường nuôi tối ưu của

Rogalski và chứng minh khả năng cảm ứng của CaCO3 khi sản xuất GOD (tối ưu4%), nó cũng duy trì pH của môi trường nuôi trong khoảng 6,5÷6,8 Người ta nhậnthấy hoạt tính của enzyme glucolytic và glucose-6-phosphate isomerase là cao hơntrong môi trường phát triển không có CaCO3, trong khi đó GOD và catalase (CAT)

là khá thấp Sự có mặt của CaCO3 sẽ làm tăng hoạt tính của GOD và CAT đồng thờihoạt tính của glucose-6-phosphate isomerase giảm xuống Việc thêm CaCO3 vàomôi trường phát triển có thể gây ra sự chuyển hóa từ phân hủy glucose đến chutrình pentose phosphate do đó làm tăng lên hoạt tính của GOD CaCO3 vào môitrường phát triển gây ra những thay đổi về hoạt tính của GOD, CAT, 6-phosphofructokinase (6-PFK) và glucose-6-phosphate dehydrogenase (G-6-PDH).6-PFK là enzyme điều khiển chủ yếu chu trình Embden-Meyerhof-Parnas (EMP)trong hầu hết các tế bào sống Hơn nữa năm 2001, Liu cho thấy những tế bào pháttriển trong môi trường không có CaCO3 tạo ra mức độ cao của 6-PFK và số lượngthấp của G-6-PDH, GOD và CAT Việc thêm CaCO3 vào môi trường phát triển làm

G- 6PDH

tăng sự tạo thành GOD và CAT, và làm giảm sự sự tổng hợp của 6-PFK Do đó,quan sát này có thể chỉ ra rằng CaCO3 gắn liền với sự chuyển hóa từ chu trình phânhủy đường glucose (EMP) đến quá trình oxi hóa trực tiếp glucose bởi GOD

Hình 1 4 Sự chuyển hóa từ chu trình phân hủy đường glucose (EMP) đến quá

trình oxi hóa trực tiếp glucose bởi GOD

4 Thành phần môi trường khác

Nồng độ GOD trong A niger có thể được tăng lên bởi các loại hydrocarbon

khác nhau trong suốt quá trình nuôi Năm 1994, Li và Chen cho rằng có một sự tănglên cực đại hoạt tính GOD nội bào 43%, 110% và 31% khi thêm vào riêng từng loạin-dodecane, n-hexadecane và dầu đậu nành Điều này được cho là do sự tăng lêncủa hiệu quả tổng hợp enzyme trong tế bào bởi n-dodecane and n-hexadecane và sựtăng lên của sinh khối với việc thêm vào dầu đậu nành Năm 1996, Fiedurek nghiêncứu ảnh hưởng của thành phần môi trường khác nhau và chất ức chế chuyển hóa

của quá trình sản xuất GOD trong A niger, và nhận thấy thay thế ammonium

phosphate với natri nitrate trong môi trường muối cơ bản làm tăng đáng kể hoạt tínhGOD đến 269,6% Hơn nữa, hoạt tính GOD nội bào tăng đến 68,3% trong sự cómặt của natri orthovanadate (1 mM) và hoạt tính GOD ngoại bào tăng trong sự cómặt của hematin (1 mM), choline (40 mM) và Tween 80 (0,1%) Sự tăng lên củahoạt tính GOD ngoại bào thu được trong khoảng 31,4÷53,9%

5 Ảnh hưởng của thông khí và khuấy trộn

Sự di chuyển khí-lỏng là nhân tố giới hạn trong quá trình lên men hiếu khí.Một trong những nguyên nhân chính là do tính hòa tan thấp của oxi trong môitrường lên men khi so sánh với tính hòa tan của nguồn cacbon, nitơ và các dinhdưỡng khác Sự cung cấp oxi càng trở ngại hơn trong môi trường nhớt, nơi có nồng

độ tế bào cao và thường thấy trong quá trình lên men của nấm Vì vậy thông khí vàkhuấy trộn là hai nhân tố quan trọng cho quá trình lên men hiếu khí Sự thông khícủa môi trường phát triển hiếu khí đáp ứng yêu cầu cung cấp oxi cũng như loại bỏkhí thải ra Oxi cung cấp cho sự phát triển và sản xuất trong quá trình nuôi nấmđược đảm bảo bởi sự thông khí và khuấy trộn

Năm 2000, Fiedurek và Gromada xác định phương pháp mới làm tăng oxihòa tan trong môi trường phát triển bằng cách thêm vào H2O2 như nguồn oxi duynhất CAT được tạo ra bởi vi sinh vật xúc tác phân hủy H2O2 thành nước và oxi tự

do, trong trường hợp này, H2O2 đóng vai trò như cả chất cho điện tử và chất nhậnđiện tử trong phản ứng Oxi tinh khiết cũng được chứng minh là có lợi cho tốc độ

tăng trưởng của A niger khi nuôi chìm Tốc độ tăng trưởng tăng từ 61 mg trọng

lượng nấm khô/100 ml/h (thông khí với không khí) đến 95 mg trọng lượng nấmkhô/100 ml/h (thông khí với oxi tinh khiết) So sánh hoạt tính GOD nuôi ở 24h của

A niger đã khuấy trộn lần lượt ở 460, 700 và 900 rpm cho thấy hoạt tính của quá

trình nuôi đã khuấy trộn ở 700 rpm khoảng 20÷24% cao hơn quá trình nuôi thôngkhí ở 460 rpm Tăng tốc độ máy khuấy trộn hơn nữa không cải thiện được tốc độtăng trưởng hay sản xuất GOD Quá trình nuôi bão hòa oxi đạt được hiệu suất nấmsợi cao hơn và sớm hơn 8h so với khi nuôi thông khí Tuy nhiên, sự tự phân cũngcao hơn trong môi trường nuôi đã bão hòa oxi Thêm vào đó, độ nhớt của môitrường nuôi bão hòa oxi là khoảng 50% thấp hơn quá trình nuôi thông khí Thành tếbào của quá trình nuôi thông khí được nhận thấy dày hơn và bền hơn quá trình nuôibão hòa oxi, do đó làm cho tế bào bão hòa oxi có sức chịu đựng kém hơn trong thiết

bị khuấy trộn Đồng thời hoạt tính GOD của quá trình nuôi bão hòa oxi gấp đôi của

quá trình nuôi thông khí Bất lợi duy nhất của việc sử dụng oxi tinh khiết là vấn đềkinh tế khi thực hiện ở qui mô lớn.

6 Ảnh hưởng của pH nuôi

Trong số các thông số vật lý, pH của môi trường phát triển đóng vai trò quantrọng bởi nó gây ra sự thay đổi hình thái trong sinh vật và trong sự tiết enzyme pH

là một yếu tố quan trọng có ảnh hưởng đến chức năng sinh lý của vi sinh vật bởi nóảnh hưởng đến tính hòa tan và hấp thu chất dinh dưỡng, hoạt tính enzyme, hình tháimàng tế bào, sự hình thành sản phẩm và các phản ứng oxi hóa khử Sự thay đổi pHtrong suốt quá trình phát triển của sinh vật cũng ảnh hưởng đến sự ổn định sảnphẩm trong môi trường pH nuôi có thể có những ảnh hưởng sâu sắc đến tốc độ sảnxuất và tổng hợp enzyme pH thích hợp cho quá trình sản xuất GOD có thể khácnhau do sự tối ưu quá trình phát triển Hầu hết các chủng thương mại đã sử dụngcho sản xuất GOD có pH tối ưu giữa 6,0 và 7,0 thuận lợi cho tăng trưởng và sảnxuất enzyme Trong nhiều quá trình, một số thành phần môi trường như CaCO3 vàcác phosphate khác có khả năng đệm thì không cần thiết phải điều chỉnh pH

7 Ảnh hưởng của nhiệt độ tăng trưởng

Nhiệt độ bên trong của vi sinh vật phải cân bằng với môi trường của nó vìhoạt động vi sinh vật rất nhạy cảm với nhiệt độ môi trường Ảnh hưởng của nhiệt độđến quá trình sản xuất GOD có liên quan đến sự tăng trưởng của vi sinh vật Trong

số các loại nấm, hầu hết các nghiên cứu sản xuất GOD được thực hiện với nấm sợitrong vùng nhiệt độ từ 25÷37°C Hiệu suất tối ưu của GOD đạt được ở 27÷37°C

cho A niger Năm 1995, Hatzinikolaou và Macris đã khảo sát ảnh hưởng của nhiệt

độ tăng trưởng đến toàn bộ quá trình sản xuất GOD ở 22,5°C đến 32°C, và nhậnthấy 27,5°C là nhiệt độ tối ưu

1.3.5.3. Qui trình sản xuất enzyme glucose oxidase

Bước chủ yếu sau khi hoàn thành quá trình lên men là thu nhận và tinh chếGOD Hình 1.7 mô tả qui trình tổng quát làm tinh khiết GOD GOD được làm tinh

khiết để ứng dụng trong thương mại sản xuất từ những nấm khác nhau bao gồm

A.niger và những loài Penicillium như P.pinophilum, P.amagasakiense, num, P.notatum, và P.funciculosum GOD được sản xuất là enzyme nội bào hoặc

P.chysoge-ngoại bào Những tế bào phải được phân cắt để giải phóng hoàn toàn enzyme GODtrong canh trường Đã có nhiều cuộc thảo luận về vị trí nội bào hay ngoại bào ở

enzyme của A.niger và những loài Penicillium Trong khi đó, vị trí tế bào chất của A.niger được mô tả rõ ràng, phù hợp với sự tồn tại của chuỗi nhận biết trước trong

bộ gen GOD của A.niger Là chuỗi của vị trí ngoại biên, sự giải phóng enzyme từ

khuẩn ty có thể dễ dàng hơn bằng lực cơ học và vật lý, khuấy trộn hoặc siêu âm.Những phương pháp khác nhau để phân cắt tế bào sử dụng đối với nhiều loại nấmkhác nhau, bao gồm đồng nhất hóa, siêu âm và kết hợp của cả hai Năm 2000,Taubert đã nghiên cứu tổng quát những phương pháp khác nhau để phân cắt hai loại

nấm khác nhau (Ganoderma applanatum và Pycnoporus cinnabarinus) Tế bào nấm

bền vững riêng với vài phương pháp phân hủy chung dùng cho những loại men và

vi khuẩn cũng như phương pháp phân cắt cơ học hoặc không cơ học được mô tả bởiChristi và Moo-Young (1986) Để giải phóng enzyme bội bào cũng như GOD liênkết tế bào trong canh lỏng, các phương pháp khác nhau như siêu âm, nghiền, đồngnhất hóa và tan băng được sử dụng Sau khi phân hủy tế bào, GOD được giải phóngtrong canh trường lên men có thể được phân tách khỏi tế bào, ly tâm, hoặc lọc Các

kỹ thuật lắng khác nhau được sử dụng để làm tinh khiết GOD bao gồm ammoniumsulphat, uranyl acetat, potassium hexacyanoferrate và đồng sulphat Chất lắngammonium sulphat được ứng dụng thành công để lắng cả GOD nội bào và ngoại

bào có thể là do GOD từ Penicillium được glycosyl hóa GOD từ P.amagasakiense

là glycoprotein chứa 11÷13% carbohydrate được mô tả như loại mannose bậc cao

Khi thực hiện quá trình lắng theo kỹ thuật sắc ký phân chia như sắc ký traođổi ion, điểm đẳng điện trung bình của GOD được tìm thấy nằm khoảng pH= 4 ÷5.Nhìn chung, sắc ký trao đổi ion được sử dụng cho mục đích làm sạch GOD đượcchiết chủ yếu với gradient muối; mặc dù pH hỗn hợp và gradient muối trước đây

được sử dụng Điểm đẳng điện của CAT từ P chrysogenum là 6,5 Sự khác biệt

trong giá trị pI của GOD và CAT có thể được sử dụng cho quá trình làm sạch GOD

để đảm bảo rằng nó được giải phóng từ CAT bởi sử dụng sắc ký trao đổi ion

Làm khô lạnh

Sắc ký phân loại kích cỡ

Làm đông khô

Chế phẩm enzyme

Hình 1 7 Sơ đồ quy trình thu nhận enzyme Glucose oxidase

Kể từ khi phân tách sắc ký trao đổi ion trên cơ sở những pI khác nhau, người

ta tìm thấy GOD từ P amagakiense chứa 4 isoenzym khác nhau của những giá trị

pI là 4,37; 4,42; 4,46 và 4,51 GOD mang điện tích âm trong nước cất 2 lần tùythuộc vào pI của nó là 4÷5 Nó được hấp thu ở đầu cột Trên quá trình chiết với bộđệm chiết (pH= 3,6), GOD trở thành điện tích dương và hấp thu từ nhựa trao đổiion Những phần chiết khác nhau của GOD mang những lượng điện tích khác nhau

và phân tách chúng khỏi nhau Phần phân chia đầu tiên, GOD A có ít điện tích hơnGOD B trong qui trình làm sạch; do đó sự ảnh hưởng của xung điện tích với hìnhthể của GOD A thì nhỏ và có hoạt tính enzyme cao GOD B mang nhiều điện tích

âm hơn GOD A, và do đó nó có thể chỉ được chiết ra sau GOD A và cũng phá hủy

hình thể riêng, làm giảm hoạt tính enzyme Năm 1997, Rando đã sử dụng phương

pháp chi tiết hóa và hiệu quả cho qui trình làm sạch GOD từ P pinophilum Quá

trình làm sạch GOD để đồng nhất hóa với hiệu suất 74% bao gồm bước chiết hiệuquả của khối khuẩn ty ở pH = 3,0 và sắc ký trao đổi ion theo sau là lọc gel

1.3.6. Tình hình nghiên cứu enzyme glucose oxidase trong và ngoài nước

Từ những năm 1950, enzyme GOD đã được sử dụng rộng rãi trong côngnghiệp sản xuất bột trứng sấy để loại bỏ glucose và trong bộ cảm biến glucose chobệnh nhân tiểu đường để kiểm tra thường xuyên lượng đường trong máu [20] Hơn

40 năm qua, nhiều ứng dụng của nó đã được phát triển và những gần đây GOD tiếptục được các nhà nghiên cứu quan tâm

Năm 1993, Petruccioli và cộng sự nghiên cứu quá trình sản xuất GOD bởi 84

chủng của Penicillium và kết luận P expansum (1 chủng), P italicum (1 chủng), P chrysogenum (3 chủng) and P variabile (3 chủng), khi nuôi trên nguồn cacbon

glucose nó tạo ra hoạt tính GOD từ 0.61Uml-1 đến 5.45Uml-1 [20]

Năm 1995, D G Hatzinikolaou và B J Macris nghiên cứu ảnh hưởng của

các yếu tố đến quá trình sản xuất enzyme GOD bởi Aspergillus niger và xác định

được vùng điều kiện tối ưu sinh tổng hợp enzyme GOD [13], cũng trong năm nàyMaurizio Petruccioli và cộng sự nghiên cứu quá trình sản xuất GOD bởi chủng đột

biến Penicillium variabile ( P16) với hoạt tính GOD lên đến 19.09Uml-1 sau 96h lênmen, cao hơn 127% so với chủng ban đầu [15]

Cũng với loài Aspergillus niger năm 1996 Tongbu Lu và cộng sự nghiên cứu

quá trình sản xuất và ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính enzyme và kếtluận: ở nồng độ thấp muối clorua và gluconate kim loại (như các muối clorua,gluconate của natri, kali, canxi, magie, kẽm) kích thích hoạt tính GOD nhưng ởnồng độ cao hơn, các muối clorua và gluconate thể hiện mức độ ức chế khác nhau,

và ở cùng nồng độ sự ức chế của muối clorua mạnh hơn muối gluconate [22], năm

1999 trong nghiên cứu khả năng thu nhận GOD khi sử dụng nước ngâm bắp sinh

tổng hợp bởi Aspergillus nige R P Kona và cộng sự kết luận hoạt tính enzyme

tăng đến 640±36U/ml khi bổ sung nước ngâm bắp vào môi trường, họ nhận thấyđây là nguồn nitơ tốt nhất cho sự tổng hợp enzyme GOD hơn hẳn so với các nguồn

nitơ muối nitrat của canxi, natri, amoni, kali và dịch chiết nấm men, dịch chiết malt

và peptone [19]

Với mục đích nâng cao sản xuất GOD năm 2007 Shazia Sabir và cộng sự

nghiên cứu sản xuất GOD từ Penicillium notatum sử dụng cám gạo, hoạt tính của

enzyme đạt được tối đa 112±5U/ml dưới các điều kiện tối ưu: cám gạo 5g, nuôitrong 72h ở (30±1)0C và pH=6.0 [20] Năm 2009 Muhammad Ramzan và Tahir

Mehmood nghiên cứu sản xuất GOD từ chủng Aspergillus niger đột biến UV nhận

thấy hoạt tính enzyme ngoại bào và nội bào tăng lên 1.57 and 1.98 lần so với chủng

bố mẹ [16]

Nhiều ứng dụng của GOD trong những năm qua đã được nghiên cứu, đặc biệttrong công nghiệp thực phẩm: Năm 1998 G J Pickering và cộng sự nghiên cứu ứngdụng của GOD trong sản xuất rượu có độ cồn thấp bởi glucose chuyển thành axitgluconic làm cho nồng độ cồn giảm xuống [12] Năm 2004 Hardeep Singh Gujral

và Cristina M Rosell nghiên cứu cải thiện tính chất nướng bánh của bánh mì làm từbột gạo khi sử dụng enzyme GOD Trong nghiên cứu này ảnh hưởng của GOD đếntính lưu biến của bột nhào, sự sửa đổi protein và tính chất nướng bánh được trìnhbày GOD làm thay đổi protein của bột gạo bởi nó làm giảm nồng độ của nhómthiol và amino [13]

Ứng dụng của GOD không chỉ phát triển trong công nghiệp thực phẩm mà còntrong các ngành công nghiệp khác Điều này được chứng minh trong nghiên cứu

“Hydrogen peroxide generation with immobilized glucose oxidase for textile bleaching” của Tzanko Tzanov và cộng sự (2001), hydrogen peroxide sinh ra dùng

để tẩy trắng trong ngành dệt [23]

Tuy nhiên, ở nước ta tình hình nghiên cứu về enzyme GOD còn rất hạn chế

Đáng chú ý nhất là các đề tài: “Nghiên cứu thụ động enzyme glucose oxidase trên cảm biến nano sinh học để kiểm tra và định lượng glucose” của Trần Phú Duy [25]

và “Nghiên cứu khả năng gắn enzyme glucose oxidase vào sợi nano platinum để tạo cảm biến glucose” của Lê Thị Thanh Tuyền (2008) [27].

1.4. Nhận xét chung

Từ những bằng chứng trên, GOD là một trong những enzyme quan trọngnhất được sử dụng trong qui trình công nghiệp Nó có khả năng sử dụng trong thựcphẩm, dược, công nghệ sinh học và công nghiệp hương liệu Vì vậy quá trình lênmen sản xuất enzyme GOD với qui mô lớn là cần thiết.

Mặc dù, nguồn vi sinh vật phong phú, đa dạng nhưng quá trình sản xuấtenzyme này vẫn còn hạn chế chỉ trong vài chủng nấm mốc và nấm men được lựachọn

Tuy GOD đã được sử dụng lâu dài trong nhiều ngành công nghiệp khácnhau, nhưng những sự cải tiến về mặt kỹ thuật luôn được xem xét Tuy nhiên, kếtquả thỏa đáng trong việc ứng dụng GOD cố định mà không có bất cứ hạn chế nàohiếm khi đạt được Những vấn đề như sự hạn chế khuếch tán và giảm hoạt tínhenzyme sau khi đã cố định cần được vượt qua để có lợi ích nhiều hơn Tương tự,những nỗ lực nghiên cứu để tối ưu hóa và thiết lập bình phản ứng phù hợp vẫn đang

là nhu cầu cần thiết trước khi tính đến những ứng dụng trong tương lai [20]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

Chủng nấm mốc Aspergillus Niger được phân lập và giữ giống tại Phòng Thí

Nghiệm Khoa Hóa, Trường Đại Học Bách Khoa, Đại Học Đà Nẵng

2.2. Hóa chất

Bảng 2 1 Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm

Tên hoá chất khiết (%) Độ tinh Nơi sản xuất

Peptone, CaCO3, KH2PO4, MgSO4.7H2O, (NH4)2SO4, 99 Trung Quốc