KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ canxi cacbonat (CaCO3 ).
Năm 1995, Petruccioli nhận thấy việc bổ sung của CaCO3 vào môi trường phát triển trong bình lắc và trong thùng lên men sẽ ngăn cản pH giảm xuống trong suốt quá trình nuôi, điều này là cần thiết khi tối ưu quá trình sản xuất GOD. Năm 1988, Rogalski cho thấy sự tổng hợp của GOD dễ bị ảnh hưởng bởi sự tăng lên của nồng độ CaCO3 (0÷4,5%) làm tăng hoạt tính lên khoảng 3,5%. Hatzinikolaou và Macris cho rằng CaCO3 là tác nhân cảm ứng mạnh trong quá trình sinh tổng hợp GOD của
A. niger và đã chứng minh nó là cần thiết cho quá trình sản xuất [20].
Do đó, để xác định nồng độ tối thích của muối canxi cacbonat tối thích cho quá trình sinh tổng hợp enzyme GOD ngoại bào từ nấm mốc A. niger, tôi tiến hành khảo sát nồng độ của CaCO3.
Cố định nồng độ của saccharose là 70g/l và nồng độ peptone là 12g/l mà ta đã vừa khảo sát là cho hoạt độ của enzyme là tối đa. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ CaCO3 tới hoạt độ của GOD bằng các nồng độ lần lượt là 25; 30; 35; 40; 45 g/l rồi bổ sung vào MTCB để làm môi trường nuôi cấy. Nuôi cấy trong bình tam giác 100ml với thể tích làm việc là 35ml và hút 2 ml canh trường tăng sinh , tiến hành nuôi cấy trên máy lắc như trình bày ở mục 2.4.1.3. Sau 70h canh trường vi sinh vật được ly tâm 15 phút ở tốc độ 5200 vòng/phút như trình bày ở mục 2.4.5.1, dịch thu được dùng để tiến hành đo hoạt độ của GOD bằng phương pháp quang phổ hấp thụ như trình bày ở mục 2.4.3.
Kết quả khảo sát nồng độ CaCO3 được thể hiện ở bảng 3.5 theo theo dõi độ hấp thụ quang phổ sau khi xác định bằng phương pháp hấp thụ quang phổ và hình 3.5- hình ảnh của canh trường sau khi nuôi cấy 72h ở các nồng độ CaCO3 khác nhau.
Hình 3.5.Canh trường nấm mốc ứng với các nồng độ CaCO3 khác nhau sau khi nuôi cấy 70h trên máy lắc
Bảng 3.3.Kết quả theo dõi độ hấp thụ theo thời gian ứng với các nồng độ CaCO3 khác nhau
Thời gian (s)
Độ hấp thụ (Abs) ứng với khối lượng CaCO3 bổ sung vào (g/l)
25 30 35 40 45 0 0 0 0 0 0 50 0.072 0.074 0.086 0.078 0.060 60 0.077 0.077 0.093 0.082 0.063 70 0.081 0.081 0.100 0.085 0.065 80 0.084 0.085 0.102 0.089 0.067 90 0.087 0.089 0.107 0.093 0.069 100 0.090 0.094 0.113 0.098 0.070 110 0.094 0.098 0.118 0.102 0.070 120 0.098 0.103 0.125 0.106 0.072 130 0.101 0.108 0.129 0.110 0.074
Dựa vào bảng 3.3 và hình 3.5 cho ta thấy nồng độ của CaCO3 có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme GOD từ nấm mốc A. niger. Ở mỗi nồng độ CaCO3 khác nhau thì khả năng sinh tổng hợp GOD sẽ khác nhau. Mặt khác từ hình 3.5 cho ta thấy tại nồng 35 và 40 g/l (hình số 3 và 4) thì canh trường trong suốt nhất chứng tỏ lượng cơ chất đã được sử dụng là lớn hơn cả so với các nồng độ khác.
Từ kết quả đo độ hấp thụ theo thời gian ở bảng 3.3 trên, dựa vào công thức (2) ở mục 2.4.3 ta xác định được hoạt độ của enzyme GOD ở các nồng độ CaCO3 khác nhau. Kết quả thể hiện trên hình 3.6.
Hình 3.6. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ CaCO3 lên hoạt tính enzyme GOD ngoại bào
Từ kết quả biểu diễn trên hình 3.6 cho thấy nồng độ CaCO3 ảnh hưởng rõ rệt lên sự tạo thành enzyme GOD. Ở đây tôi khảo sát khoảng nồng độ của CaCO3 trong khoảng từ 25÷45 g/l và bước nhảy nồng độ là 5 gam. Nhận thấy khi tăng hàm lượng CaCO3, hoạt tính enzyme tăng dần từ 1,49 Uml-1 ứng với nồng độ 25g/l đến giá trị
cực đại là 1,78 Uml-1 ứng với nồng độ 35g/l rồi bắt đầu giảm xuống còn 1,24 Uml-1 khi tăng nồng độ CaCO3 lên 45g/l.
Các nhà khoa học đã chứng minh rằng việc bổ sung CaCO3 vào môi trường lên men để sinh tổng hợp enzyme GOD vừa có tác dụng ngăn ngừa sự giảm pH, duy trì ở trong suốt quá trình lên men, đảm bảo sự phát triển ổn định pH = 6,5÷6,8 tối đa cho nấm mốc. Sự có mặt của CaCO3 làm tăng lên hoạt tính của GOD và CAT đồng thời hoạt tính của glucose-6-phosphate isomerase giảm xuống. Họ cho rằng thêm CaCO3vào môi trường phát triển có thể gây ra sự chuyển hóa từ phân huỷ glucose đến chu trình pentose phosphate do đó làm tăng lên hoạt tính của GOD. Việc thêm CaCO3vào môi trường phát triển gây ra những thay đổi về hoạt tính của GOD, CAT, 6-phosphofructokinase (6-PFK) và glucose-6-phosphatedehydro- genase (G-6-PDH). 6-PFK là enzyme điều khiển chủ yếu chu trình Embden- Meyerhof-Parnas (EMP) trong hầu hết các tế bào sống. Hơn nữa năm 2001, Liu cho thấy những tế bào phát triển trong môi trường không có CaCO3 tạo ra một lượng lớn 6-PFK và số lượng thấp của G-6-PDH, GOD và CAT. Việc thêm CaCO3vào môi trường phát triển làm tăng sự tạo thành GOD và CAT, và làm giảm sự sự tổng hợp của 6-PFK [20]. Do vậy, tăng nồng độ CaCO3 sẽ làm tăng khả năng tạo thành enzyme GOD khi đó hoạt độ trong lượng dịch lên men thu được sẽ tăng lên. Tuy nhiên, khi nồng độ CaCO3 càng tăng thì nó sẽ làm ảnh hưởng đến pH của môi trường - làm tăng pH, làm tăng áp suất thẩm thấu. Mặt khác, CaCO3 là muối không hòa tan, trong quá trình phát triển CaCO3 sẽ bám trên các các khuẩn ty, khi lượng enzyme GOD tạo ra không đủ để hòa tan hết CaCO3 thì nó sẽ gây cản trở quá trình sinh tổng hợp GOD.
Năm 1988, Rogalski cho thấy sự tổng hợp của GOD dễ bị ảnh hưởng bởi sự tăng lên của nồng độ CaCO3 (0÷4,5%) làm tăng hoạt tính lên khoảng 3,5%. Năm 1995 Hatzinikolaou và Macris đã xác định nồng độ 4% là điều kiện tối ưu để sinh tổng hợp GOD khi trong môi trường có saccharose là nguồn cacbon. Năm 2008 Banker và các cộng sự đã tìm thấy nồng độ CaCO3 thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp GOD cực đại là 3%. Trong khi đó, sau khi khảo sát tôi nhận thấy nồng độ 35g/l của CaCO3 là điều kiện tối thích cho quá trình sinh tổng hợp GOD từ A. niger.
Kết quả chúng tôi thu được nằm trong khoảng nồng độ CaCO3 tối thích mà các tác giả trên đã khảo sát.
Như vậy sau khi khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ CaCO3 thêm một lần nữa chúng tôi khẳng định nồng độ saccharose, peptone và CaCO3 có ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh tổng hợp glucose oxidase. Nồng độ peptone tối thích cho hoạt động sinh tổng hợp GOD từ nấm mốc Aspergillus niger là 35g/l.
3.2. Kết tủa enzyme glucose oxidase ngoại bào.
Dịch enzyme thô thu được sau khi nuôi cấy, ngoài enzyme GOD ngoại bào còn chứa nhiều loại enzyme, protein không hoạt động và các tạp chất khác. Do đó, để thu được enzyme GOD ngoại bào thô ta cần tiến hành loại bỏ các enzyme và protein tạp này. Để tách và tinh chế enzyme nói riêng và các protein nói chung thường có một loạt các phương pháp hóa lý và hóa học khác nhau. Có thể chia 3 nhóm phương pháp sau:
- Phương pháp kết tủa,
- Phương pháp sắc ký,
- Phươg pháp phân tách lỏng - lỏng [7]
Do điều kiện thí nghiệm và thời gian hạn chế nên chúng tôi chỉ tiến hành phương pháp kết tủa để làm tinh sạch sơ bộ enzyme GOD ngoại bào thu được. Để kết tủa enzyme ta có thể sử dụng các phương pháp khác nhau như: kết tủa đẳng điện; kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính (phương pháp diêm tích); kết tủa bằng dung môi hữu cơ. Trong đó, phương pháp diêm tích là phương pháp được sử dụng khá rộng rãi trong công tác nghiên cứu khoa học để thu nhận các chế phẩm enzyme có hoạt tính cao. Phương pháp diêm tích hay dung nhất là sử dụng phương (NH4)2SO4, thêm vào dung dịch nghiên cứu với liều lượng tăng dần [2].
Do đó, chúng tôi chọn phương pháp diêm tích để thực hiện kết tủa enzyme GOD ngoại bào.
3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ muối (NH4)2SO4 và pH của MTNC đến quá trình kết tủa enzyme glucose oxidase ngoại bào.
Phương pháp kết tủa phân đoạn bằng (NH4)2SO4 dựa trên cơ sở sự khác nhau về khả năng kết tủa của các protein enzyme ở một nồng độ muối (tính theo phần trăm nồng độ bão hòa). Các loại muối có thể được dùng là (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4 ... người ta đã nhận thấy muối (NH4)2SO4 là tốt nhất vì nó không làm hại mà làm ổn định (làm bền) hầu hết các loại enzyme. Loại muối này lại rẻ và phổ biến. Độ hòa tan của nó lại rất lớn (bão hòa 541,8 g/l ở 250C). Ngoài ra nồng độ (NH4)2SO4 cần thiết để kết tủa enzyme khác nhau thì khác nhau nhiều. Ví dụ: Protease của nấm mốc dễ bị kết tủa ở 70% của (NH4)2SO4 bão hòa hoàn toàn, còn amylase của mầm lúa bị kết tủa ở 50% độ bão hòa của dung dịch muối này. Điều đó nói lên tính kết tủa lựa chọn của (NH4)2SO4 cao hơn các muối khác. Ngoài ra, Ở một chỉ số pH xác định, mỗi phân tử protein có một điện tích tổng số nào đấy mà độ lớn của nó phụ thuộc vào số lượng các nhóm tích điện dương và tích điện âm. Kết quả là ở chỉ số nồng độ ion H+ cố định, các protein khác nhau trong hỗn hợp sẽ có tổng điện tích khác nhau. Các phân tử protein mang điện tích tổng số (dương hoặc âm) cùng dấu đẩy nhau ra xa nên dễ tan vào dung dịch. Do đó pH của dịch nghiên cứu cũng ảnh hưởng đến quá trình kết tủa của enzyme GOD [18].
Sử dụng kết quả vừa khảo sát các nồng độ saccharose, peptone và CaCO3 ở trên để tiến hành nuôi cấy thu nhận enzyme GOD ngoại bào. Tiến hành nuôi cấy như phương pháp đã trình bày ở mục 3.1.3, 3.1.4 . Ly tâm thu nhận canh trường lỏng để tiến hành nghiên cứu.
Trước hết, tiến hành xác định hoạt độ của dịch lên men ban đầu, bằng phương pháp hấp thụ quang phổ như đã trình bày ở mục 2.3.4. (Kết quả được thể hiện ở phụ lục 4.4)
Tiếp theo, chúng tôi thăm dò các khoảng nồng độ bão hòa (NH4)2SO4 khác nhau là: 50÷60%; 60÷70%;70÷80%; 80÷90% độ bão hòa. Ở mỗi khoảng nồng độ (NH4)2SO4 tôi điều chỉnh các giá trị pH của MTNC khác nhau là: 5, 6, 7.
Tiến hành thực hiện kết tủa bằng muối (NH4)2SO4 khan. Tôi đã sử dụng phần mềm tính toán lượng muối sulfate amon “Ammonium Sulfate Calculator” để xác định lượng muối cần thiết để có độ bão hòa khác nhau tại các nhiệt độ nhất định [26].
Hòa tan lượng muối (NH4)2SO4 ứng với các độ bão hòa là 50%; 60%; 70%; 80% vào 10ml MTNC, ứng với mỗi nồng độ của (NH4)2SO4 điều chỉnh pH về các giá trị 5, 6, 7. Cho muối vào từ từ và khuấy trộn nhanh chóng và liên tục để đảm bảo sự hòa tan hoàn toàn của muối. Hỗn hợp được để yên trong 12 giờ, ở 40C, ly tâm 5500 vòng/phút, trong 20 phút, 40C để tách kết tủa. Dịch lỏng thu được của mỗi nồng (NH4)2SO4 ta tiến hành bổ sung thêm (NH4)2SO4 khan để đạt các nồng độ là 60%; 70%; 80%; 90% độ bão hòa. Sau 12 giờ tiến hành kết tủa và thu nhận kết tủa giống như trên.
Phần kết tủa sau hai lần ly tâm được hòa tan trong đệm natri citrate pH=5 với thể tích đúng bằng thể tích enzyme thô ban đầu (10ml) để tiến hành xác định hoạt độ.
Sau khi xác định được hoạt độ của các chế phẩm thô ở các nồng độ (NH4)2SO4 và các mức pH khác nhau, đem so với hoạt độ ban đầu của canh trường enzyme thô ta được hoạt độ tương đối của chế phẩm thô so với ban đầu ( xem phụ lục 4)
Kết quả thể hiện trên hình 3.4.
Hình 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 và pH dịch MTNC đến hiệu suất thu nhận enzyme GOD ngoại bào thô.
Từ kết quả thể hiện trên hình 3.7 cho ta thấy:
Ở mỗi giá trị pH của môi trường sẽ có một nồng độ bão hòa của muối (NH4)2SO4 tương ứng để hoạt độ của chế phẩm của enzyme thu được là cao nhất. Điều này chứng tỏ pH của MTNC và nồng độ bão hòa của (NH4)2SO4 có ảnh hưởng đến khả năng kết tủa của enzyme GOD.
Tại nồng độ 50÷60% và 80÷90% độ bão hòa thì hoạt độ của chế phẩm thu được hầu như không đáng kể ở tất cả các mức pH (nhỏ hơn 50%).
Hoạt độ tại nồng độ 60÷70% và 70÷80% là đạt các giá lớn hơn cả, trong đó hoạt độ đạt cực đại tại 70÷80% độ bão hòa và pH =5 (hiệu suất thu nhận là 80,02% ứng với GODA=2,49Uml-1 xem phụ lục 3). Tiếp theo là ở pH=6 và 7 tại nồng độ
hiện kết tủa tại nồng độ (NH4)2SO4 là 70÷80 % độ bão hòa tại pH=5 thì quá trình thực hiện ít phải điều chỉnh pH vì giá trị pH=5 gần với giá trị pH của dịch MTNC hơn (pH của dịch MTNC là 5,4).
Muhammad Anjum Zia, Khalil-ur-Rahman, Muhammad K. Saeed, Fozia Andaleeb, Muhammad I. Rajoka, Munir A. Sheikh, Iftikhar A. Khan, and Azeem I. Khan đã xác định nồng độ bão hòa của (NH4)2SO4 kết tủa được enzyme GOD nội bào từ A. niger là 60÷85% [22]. Năm 1964, Bennett, E.P. Swoboda và Vincent Massey đã tìm thấy nồng độ bão hòa thích hợp nhất cho A. niger là 90%. [9]. Năm 2005, Clinton Simpson đã nghiên cứu quá trình kết tủa enzyme GOD ngoại bào và nội bào từ chủng nấm mốc Penicillium canescens (Tt42) bằng muối (NH4)2SO4 khan, kết quả cho thấy hiệu suất thu hồi enzyme lớn nhất đối với GOD ngoại bào là 60÷70% độ bão hòa, còn nội bào là 100% độ bão hòa với hiệu suất thu hồi là 80%. [10]. Còn H.N. Bhatti, M. Madeeha, M. Asgher, và N. Batoolthu thì tìm thấy 85% độ bão hòa thì hiệu suất thu hồi chế phẩm GOD từ A. niger là tốt nhất [14].
So sánh kết quả chúng tôi thu được với các kết quả của các tác giả trên, nhận thấy khoảng nồng độ bão hòa 70÷80% mà chúng tôi thu được thuộc khoảng các giá trị mà các tác giả đã thu được. Tuy nhiên, enzyme GOd mà các tác giả nghiên cứu chủ yếu là GOD nội bào, còn enzyme của chúng tôi là enzyme ngoại bào nên kết quả thu được không trùng với các kết quả trên nhưng vẫn có thể chấp nhận được. Ngoài ra, chúng tôi nhận thấy giá trị pH của dịch enzyme ban đầu sẽ ảnh hưởng đến cấu trúc của protein trong dung dịch, nó quyết định đến điện tích tổng số cảu protein, do đó ảnh hưởng đến khả năng hydrat hóa. Yếu tố này đóng vai trò quan trọng trong quá trình kết tủa enzyme bằng phương pháp phân đoạn. Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát giá trị pH của môi trường nuôi cấy đến khả năng kết tủa enzyme GOD ngoại bào.
Do vậy, có thể kết luận, với 70÷80% độ bão hòa muối (NH4)2SO4 và pH=5 sẽ cho hiệu suất thu hồi chế phẩm enzyme GOD ngoại bào thô từ Aspergillus niger là cao nhất, với hiệu suất thu hồi là 82,05%.
Để xác định hoạt độ riêng của chế phẩm GOD ngoại bào thô thu được, tiến hành thu nhận kết tủa, sấy đến khối lượng không đổi và cân để xác định khối lượng của nó.
Sau khi xác định được điều kiện tốt nhất cho quá trình thu nhận chế phẩm GOD ngoại bào thô là 70÷80 % độ bão hòa (NH4)2SO4 ở pH=5, thực hiện kết tủa ở điều kiện đó với thao kết tác thực hiện kết giống như quá trình kết tủa ở mục 3.2.1. sau hai lần kết tủa và hai lần ly tâm ta thu được kết tủa, sấy khô kết tủa đến khối lượng không đổi. Cân để xác định khối chế phẩm thu được
Kết quả thu được thể hiện trên bảng 3.7.
Bảng 3.4. Bảng tổng kết các bước thu nhận chế phẩm enzyme
Chế phẩm GOD thô
Hoạt độ tổng
(UI) Protein tổng(g) Hoạt độ riêng(UI/mg)
9,94 2,680 3,71
Từ kết quả thu được ở bảng 3.4 cho thấy chế phẩm enzyme GOD ngoại bào thu được sau khi thực hiện kết tủa ở điều kiện trên có hoạt độ riêng là 3,71 U/mg.
So với các tác giả khác thu nhận được thì hoạt độ riêng của chế phẩm enzyme GOD ngoại bào thô mà chúng tôi thu nhận được có hoạt độ rất thấp. Chẳng hạn