KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1.3.Nhận xét chung
Qua quá trình quan sát đại thể và vi thể của chủng vừa phân lập, cho thấy được đặc điểm mô tả giống với chủng Aspergillus niger như đã trình bày ở mục 1.1.5 mà một số tác giả khác đã công bố [28]. Có thể mô tả đặc điểm hình thái của nấm mốc Aspergillus niger như sau:
- Khuẩn lạc tròn, dày, bề mặt lồi, mép khuẩn lạc dày đều, sợi nấm mọc dài, trên đầu sợi nấm là các bào tử màu nâu đen. Khóm nấm mốc có màu đen hoặc nâu đen lấm tấm như bã cafe
- Sợi nấm ăn sâu vào môi trường và có vách ngăn. Trên đầu sợi nấm có đính các bảo tử hình cầu, màu đen, có gai rõ rệt.
Như vậy, từ quá trình phân lập, đánh giá hoạt độ, quan sát đại thể và quan sát vi thể chúng tôi có thể kết luận chủng nấm mốc Aspergillus của chúng tôi đã được thuần chủng và có thể sử dụng làm giống cho quá trình nghiên cứu tiếp theo.
Sợi nấm Bào tử
3.1.Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzyme GOD ngoại bào từ Aspergillus niger
Môi trường dinh dưỡng là yếu tố quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển và sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Cùng một loại vi sinh vật nhưng nếu nuôi cây trên các môi trường có thành phần dinh dưỡng khác nhau và nồng độ cơ chất khác nhau thì mức độ tạo thành enzyme và thành phần enzyme được tạo thành cũng khác nhau. Môi trường dinh dưỡng để sinh tổng hợp enzyme bao gồm các yếu tố như nguồn cacbon, nguồn nitơ, các chất khoáng, các chất kích thích sinh trưởng…tuy nhiên, do giới hạn của đề tài nên chúng tôi chỉ tiến hành khảo sát các nguồn cacbon (saccharose), nguồn nitơ (peptone) và muối CaCO3 đến khả năng sinh tổng hợp enzyme GOD ngoại bào từ nấm mốc A. niger.
3.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ saccharose
Có nhiều nguồn cacbon khác nhau để nấm mốc sinh tổng hợp enzyme GOD như glucose, saccharose, lactose, maltose, fructose, mật đường…nhưng có nhiều nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp GOD và kết luận với nguồn cacbon saccharose khả năng sinh tổng hợp GOD là lớn nhất và có tính kinh tế cao [11], [19], [21]. Tuy nhiên, đối với mỗi chủng nấm mốc khác nhau sẽ có nồng độ saccharose tối ưu khác nhau do đó, tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ saccharose đến khả năng sinh tổng hợp GOD ngoại bào từ nấm mốc A.niger.
Trước khi nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme cần tiến hành tăng sinh mốc giống như trình bày ở mục 2.4.1.2. Thay đổi nồng độ saccharose với các giá trị (g/l): 50; 60; 70; 80; 90 rồi bổ sung vào MTCB cùng với một lượng peptone và CaCO3 phù hợp để làm môi trường nuôi cấy. Nuôi cấy trong bình tam giác 100ml với thể tích làm việc là 35ml và hút 2 ml canh trường tăng sinh , tiến hành nuôi cấy trên máy lắc như trình bày ở mục 2.4.1.3. Sau 70h canh trường vi sinh vật sau khi nuôi cấy bao gồm dịch lỏng và sinh khối tế bào. Trong dịch lỏng có chứa enzyme GOD ngaoij bào nên cần tiến hành ly tâm để loại bỏ sinh khối và các tạp tạp chất rắn. Quá trình
ly tâm được tiến hành trong 15 phút ở tốc độ 5200 vòng/phút như trình bày ở mục 2.4.5.1, dịch thu được dùng để tiến hành đo hoạt độ của GOD bằng phương pháp quang phổ hấp thụ như trình bày ở mục 2.4.3.
Kết quả khảo sát nồng độ saccharose được thể hiện ở bảng 3.1, theo theo dõi độ hấp thụ quang phổ sau khi xác định bằng phương pháp hấp thụ quang phổ và hình 3.1- hình ảnh của canh trường sau khi nuôi cấy 72h ở các nồng độ sacchrose khác nhau.
Hình 3.1. Canh trường nấm mốc ứng với các nồng độ saccharose khác nhau sau
khi nuôi cấy 70h trên máy lắc
(hình số 1,2,3,4,5 ứng với nồng độ saccharose là 50, 60, 70, 80, 90 g/l)
Bảng 3.1. Kết quả theo dõi độ hấp thụ theo thời gian ứng với các nồng độ
saccharose khác nhau
Thời gian Độ hấp thụ (A) ứng với khối lượng saccarose bổ sung vào (g/l)
(s) 50 60 70 80 90 0 0 0 0 0 0 50 0.066 0.070 0.121 0.094 0.078 60 0.071 0.077 0.128 0.096 0.088 70 0.074 0.093 0.130 0.097 0.090 80 0.074 0.100 0.135 0.098 0.093 90 0.076 0.101 0.137 0.100 0.095 100 0.076 0.103 0.139 0.103 0.097 110 0.077 0.103 0.143 0.105 0.108 120 0.079 0.104 0.145 0.105 0.111 130 0.079 0.106 0.148 0.108 0.113
Dựa vào bảng 3.1 và hình 3.1 cho ta thấy nồng độ của saccharose có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme GOD từ nấm mốc A. niger. Ở mỗi nồng độ saccharose khác nhau thì khả năng sinh tổng hợp GOD sẽ khác nhau. Mặt khác từ hình 3.1 cho ta thấy tại nồng 70g/l (hình số 3) thì canh trường trong suốt nhất chứng tỏ lượng cơ chất đã được sử dụng là lớn nhất so với các nồng độ khác.
Từ kết quả đo độ hấp thụ theo thời gian ở bảng 3.1 trên, dựa vào công thức (2) ở mục 2.4.3 ta xác định được hoạt độ của enzyme GOD ở các nồng độ saccharose khác nhau. Kết quả thể hiện trên đồ thị 3.2.
Hình 3.2. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ saccharose lên hoạt tính enzyme GOD
ngoại bào
Từ kết quả biểu diễn trên hình 3.2 cho ta thấy khi thay đổi nồng độ saccharose hoạt tính enzyme sẽ thay đổi theo. Như vậy, nồng độ saccharose có ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme của chủng nấm mốc A. niger. Khi nồng độ saccharose tăng thì hoạt tính enzyme GOD tăng nhanh đến giá trị cực đại rồi giảm dần.
Ban đầu ở nồng độ saccharose tăng dần từ 50 đến 60 g/l thì hoạt tính enzyme GOD tăng dần nhưng tốc độ tăng chậm và hoạt độ tương đối thấp, hoạt độ lần lượt là 1,37 Uml-1 và 1,44 Uml-1. Nhưng khi nồng độ saccharose tăng lên 70g/l thì hoạt độ tăng lên nhanh 2,51 Uml-1, gấp 1,83 lần so với hoạt độ tại 50g/l.
Tại nồng độ 70g/l thì hoạt tính đạt cực đại vì khi tăng nồng độ saccharose lên 80 và 90 g/l thì hoạt độ của enzyme lại giảm xuống tương ứng còn 1,94 Uml-1 và 1,62Uml-1, tương ứng giảm 1,29 và 1,55 lần so với hoạt độ tại nồng độ 70g/l.
Điều này được giải thích, do trong quá trình sinh trưởng và phát triển thì nấm mốc tiết ra enzyme invertaza để chuyển hóa đường saccharose thành đường glucose và đường fructose. Đây là các cơ chất cần thiết cho khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm mốc, đặc biệt glucose chính là chất cảm ứng cho quá trình sinh tổng hợp enzyme GOD [10] . Do đó khi nồng độ saccharose tăng thì nồng độ glucose và fructose cũng tăng, do đó tăng khả năng sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp nên enzyme GOD. Điều này dẫn đến khả năng sinh enzyme GOD thu được tăng lên theo độ tăng của nồng độ. Nhưng khi nồng độ tăng quá một giới hạn (70g/l) thì hoạt độ của GOD lại giảm điều này có thể giải thích là khi nồng độ saccharose cao thì tăng độ nhớt, áp suất thẩm thấu …làm ức chế quá trình sinh trưởng và phát triển cũng như quá trình sinh tổng hợp enzyme GOD của nấm mốc.
Theo D. G. Hatziuikolaou và B. J. Macris năm 1995 đã khảo sát ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp enzyme GOD của chủng nấm mốc
Aspegillus niger đã kết luận với nguồn cacbon là saccharose hoạt tính enzyme GOD
tăng cùng với sự tăng lên của nồng độ saccharose và hoạt tính enzyme đạt cực đại ở nồng độ saccharose 10% tức 100g/l [10] và gần đây, năm 2001 cũng với chủng nấm mốc đó R. P. Kona và cộng sự khảo sát ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp enzyme GOD nhận thấy tại nồng độ saccharose 70g/l hoạt tính enzyme GOD đạt giá trị cực đại và ở nồng độ saccharose cao hơn thì quá trình sinh tổng hợp enzyme GOD bị ức chế nghĩa là hoạt tính enzyme của nó giảm dần [18].
Tuy nhiên, do ứng với mỗi chủng nấm mốc khác nhau thì sẽ có nồng độ saccharose tối ưu khác nhau cho khả năng sinh tổng hợp enzyme GOD ngoại bào. Do đó, sau khi khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ saccharose tôi khẳng định nồng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
độ saccharose có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp GOD ngoại bào từ A.
niger. Nồng độ tối ưu của saccharose cho chủng nấm mốc A. niger đang nghiên cứu
là 70g/l.
3.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ peptone
Với mục đích làm tăng khả năng sinh tổng hợp GOD ngoại bào hơn nữa tôi tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của nồng độ peptone .
Có nhiều nguồn nitơ khác nhau để nấm mốc sinh tổng hợp GOD như peptone, nước chiết nấm men, nước ngâm bắp, một số nguồn nitơ vô cơ như NaNO3, NH4NO3, (NH4)2SO4…nhưng có nhiều nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp GOD và kết luận khả năng sinh tổng hợp GOD của peptone là lớn nhất [20]. Tuy nhiên, mỗi chủng nấm mốc khác nhau sẽ có nồng độ peptone tối thích khác nhau, do đó tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ peptone đến khả năng sinh tổng hợp GOD ngoại bào.
Cố định nồng độ saccharose 70g/l cho hoạt tính enzyme GOD cao nhất ở trên, thay đổi nồng độ peptone với các giá trị (g/l): 6; 8; 10; 12; 14 rồi bổ sung vào MTCB cùng với một lương CaCO3 phù hợp để làm môi trường nuôi cấy. Nuôi cấy trong bình tam giác 100ml với thể tích làm việc là 35ml và hút 2 ml canh trường tăng sinh , tiến hành nuôi cấy trên máy lắc như trình bày ở mục 2.4.1.3. Sau 70h canh trường vi sinh vật được ly tâm 15 phút ở tốc độ 5200 vòng/phút như trình bày ở mục 2.4.5.1, dịch thu được dùng để tiến hành đo hoạt độ của GOD bằng phương pháp quang phổ hấp thụ như trình bày ở mục 2.4.3.
Kết quả khảo sát nồng độ peptone được thể hiện ở bảng 3.3 theo theo dõi độ hấp thụ quang phổ sau khi xác định bằng phương pháp hấp thụ quang phổ và hình 3.3 - hình ảnh của canh trường sau khi nuôi cấy 72h ở các nồng độ peptone khác nhau.
Hình 3.3.Canh trường nấm mốc ứng với các nồng độ peptone khác nhau sau khi nuôi cấy 70h trên máy lắc
(hình số 1,2,3,4,5 ứng với nồng độ peptone là 6, 8, 10, 12, 14 g/l)
Bảng 3.2.Kết quả theo dõi độ hấp thụ theo thời gian ứng với các nồng độ peptone khác nhau
Thời gian (s)
Độ hấp thụ (Abs) ứng với khối lượng peptone bổ sung vào (g/l)
6 8 10 12 14 0 0 0 0 0 0 50 0.100 0.108 0.140 0.145 0.104 60 0.105 0.112 0.143 0.150 0.107 70 0.107 0.117 0.147 0.157 0.114 80 0.111 0.121 0.151 0.164 0.120 90 0.113 0.127 0.156 0.174 0.126 100 0.116 0.133 0.160 0.181 0.132 110 0.118 0.137 0.164 0.189 0.137 120 0.119 0.142 0.168 0.195 0.142 130 0.121 0.144 0.172 0.202 0.148
Dựa vào bảng 3.2 và hình 3.3 cho ta thấy nồng độ của peptone có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme GOD từ nấm mốc A. niger. Ở mỗi nồng độ peptone khác nhau thì khả năng sinh tổng hợp GOD sẽ khác nhau. Mặt khác từ hình
3.2 cho ta thấy tại nồng 10 và 12 g/l (hình số 3 và 4 ) thì canh trường trong suốt hơn cả, chứng tỏ lượng cơ chất đã được sử dụng là lớn nhất so với các nồng độ khác.
Từ kết quả đo độ hấp thụ theo thời gian ở bảng 3.2 trên, dựa vào công thức (2) ở mục 2.4.3 ta xác định được hoạt độ của enzyme GOD ở các nồng độ peptone khác nhau. Kết quả thể hiện trên hình 3.4.
Hình 3.4. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ peptone lên hoạt tính enzyme GOD ngoại bào
Từ kết quả biểu diễn trên hình 3.4 cho thấy nồng độ peptone ảnh hưởng rõ rệt lên sự tạo thành enzyme GOD. Ở đây tôi khảo sát khoảng nồng độ của peptone trong khoảng từ 6÷14 g/l và bước nhảy nồng độ là 2 gam. Hoạt độ của enzyme thu được tăng dần tương ứng với nồng độ peptone tăng từ 6 đến 12 g/l và giảm dần khi tiếp tục tăng nồng độ của peptone lên 14g/l.
Hoạt độ của enzyme thu được đạt cao nhất khi nồng độ peptone nằm trong khoảng 10÷12g/l và đạt giá trị cực đại tại nồng độ 12g/l.
Điều này có thể giải thích là do peptone là nguồn nitơ cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp của tế bào. Nó giúp tế bào hình thành nên các acid amin là thành phần quan trọng cấu tạo nên protein của tế bào. Do đó, khi sử dụng peptone làm nguồn ni tơ sẽ giúp nấm mốc sinh trưởng và phát triển và sinh tổng hợp enzyme. Tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật tăng theo nồng độ cơ chất, nghĩa là khi nồng độ cơ chất tăng, tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật tăng, do đó khả năng sinh tổng hợp enzyme GOD cũng tăng theo. Nhưng khi nồng độ peptone tăng tới một giá trị giới hạn nào đó thì hoạt tính lại giảm bởi vì lúc này việc tăng thêm cơ chất sẽ là tác nhân gây ức chế quá trình sinh trưởng và phát triển của mốc do tạo độ nhớt cao, tăng áp suất thẩm thấu…do vậy làm giảm khả năng sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp glucose oxidase.
Theo D. G. Hatziuikolaou và B. J. Macris năm 1995 đã khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzyme GOD của chủng
enzyme đạt được ở nồng độ peptone 1÷2% tức 10÷20g/l và ở nồng độ peptone cao hơn thì quá trình sinh tổng hợp enzyme GOD bị ức chế [10], nghĩa là hoạt tính enzyme của nó giảm dần. So sánh với tác giả đó cho thấy vùng cho hoạt tính enzyme GOD cao nhất ở nồng độ peptone từ 12 g/l mà chúng tôi khảo sát được giống với các tác giả đã nghiên cứu.
Như vậy sau khi khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ peptone thêm một lần nữa chúng tôi khẳng định nồng độ saccharose, peptone có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp glucose oxidase. Nồng độ peptone tối thích cho hoạt động sinh tổng hợp GOD ngoại bào từ Aspergillus niger là 12g/l.