là nhu cầu cần thiết trước khi tính đến những ứng dụng trong tương lai [20].
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Chủng nấm mốc Aspergillus Niger được phân lập và giữ giống tại Phòng Thí Nghiệm Khoa Hóa, Trường Đại Học Bách Khoa, Đại Học Đà Nẵng.
2.2. Hóa chất
Bảng 2. 1 Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm
Tên hoá chất khiết (%)Độ tinh Nơi sản xuất
(NH4)2HPO4, Na2HPO4, axit citric, Natri citrate.
D-glucose, benzoquinone 99,5 Đức
2.3. Dụng cụ và thiết bị
Bảng 2. 2 Các thiết bị chính dùng trong thí nghiệm
STT Tên thiết bị Nơi sản xuất
1 Máy đo pH Oakton Châu Âu
2 Máy ly tâm Mikro Hettich Đức
3 Máy lắc Edmund Bühler GmbH Trung Quốc
4 Nồi hấp Hirayama HVE–50 Nhật Bản
5 Máy đo quang phổ UV-VIS Jenway 6305 Spectrophotometer Anh Quốc
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp vi sinh
2.4.1.1. Phân lập nấm mốc Aspergillus niger
Dùng 200ml nước cất vô trùng để tráng rửa bào tử trong ống giống ban đầu, hút 0,1 ml dịch cho vào đĩa petri có môi trường Czapek đặc đã tiệt trùng trước. Dùng que trang trải đều khắp mặt thạch. Ủ ở nhiệt độ 280C trong 3÷7 ngày. Chọn khuẩn lạc đứng tách biệt dùng que cấy lấy một ít bào tử cấy lên các đĩa petri khác, làm tương tự cho đến khi thu được khuẩn lạc thuần chủng, dùng que cấy lấy một ít bào tử khuẩn lạc đó cấy vào ống thạch nghiêng.
2.4.1.2.Nuôi cấy chuyền giống vi sinh vật.
Nấm mốc A.Niger được nuôi trong môi trường rắn- môi trường Czapeck và được cấy chuyền qua ống thạch nghiêng. Giống được nuôi trong ống thạch nghiêng trong thời gian khoảng 1÷2 tháng thì cần phải cấy chuyền sang ống thạch nghiêng mới để đảm bảo chất lượng giống ổn định cho quá trình nghiên cứu.
Mốc giống được nuôi trong tủ nuôi ở 280C trong 5÷7 ngày , sau đó bảo quản trong tủ lạnh, ở 40C.
β-D-Glucose + BQ + H2O D-gluconic acid + HQGOD
Môi trường nuôi cấy tăng sinh [10] bao gồm các thành phần sau (g/l): (NH4)2HPO4: 0,4; KH2PO4: 0,2; MgSO4.7H2O: 0,2; Saccarose: 0; peptone: 10. Môi trường được đun sôi trong 5 phút rồi rót vào bình tam giác 250ml, với thể tích làm việc là 70ml. Điều chỉnh pH về 5,5 bằng dung dịch HCl 0.1N. Rồi đem tiệt trùng ở 1210C trong 20 phút sau đó để nguội, cấy giống và tiến hành nuôi trong máy lắc với tốc độ 225 vòng/phút, nhiệt độ 300C trong 24 giờ.
1.4.1.3.Phương pháp nuôi cấy sinh tổng enzyme glucose oxidase
Chuẩn bị môi trường cơ bản (MTCB) gồm các thành phần sau (g/l): (NH4)2HPO4: 0,4g/l; KH2PO4: 0,2g/l; MgSO4.7H2O: 0,2g/l.
Sau đó MTCB được bổ sung thêm các nguồn cacbon, nitơ và CaCO3 với các nồng độ khác nhau vào để tiến hành nuôi cấy.
Môi trường được đun sôi 5 phút. Sau đó cho vào bình tam giác 100ml với thể tích làm việc là 32ml. Đem đi tiệt trùng ở 1210C trong 20 phút. Để nguội, sau đó hút vào 1,8 ml dịch tăng sinh để lên men. Quá trình lên men được giữ trong máy lắc với tốc độ 175 vòng/phút, trong thời gian 70 giờ, ở nhiệt độ 300C.
2.4.2. Phương pháp kết tủa enzyme
Khảo sát độ bão hòa của muối sunphat amon và pH của MTNC tới quá trình kết tủa enzyme GOD ngoại bào.
Hòa tan (NH4)2SO4 vào dung dịch có chứa enzyme với nồng độ nhất định, để yên 24h ở nhiệt độ 40C. Thu nhận kết tủa bằng cách ly tâm hỗn hợp này ở 5500 vòng/phút, trong 20 phút, 40C.
2.4.3. Phương pháp phân tích hóa lý
Xác định hoạt tính của enzyme GOD theo phương pháp quang phổ [6]
Hoạt độ của enzyme được xác định dựa trên việc đo tốc độ hấp thụ ban đầu của hydroquinone (HQ) tạo thành ở bước sóng 290 nm. Theo phản ứng sau:
Sử dụng hai cuvet để chứa mẫu thí nghiệm, dùng làm mẫu trắng và mẫu phân tích, Cho vào lần lượt mỗi cuvet 2ml dung dịch glucose 1M, 1ml dung dịch
benzoquinone 1% (BQ), 1ml và 0,9ml dung dịch đệm natri citrate 1M, pH=5. Để cân bằng trong 5 phút ở 250C. Đối với mẫu phân tích, tại thời điểm ban đầu thêm vào 0,1ml enzyme GOD vào cuvet và trộn đều. Độ tăng độ độ hấp thụ tại 290nm được ghi nhận trong khoảng từ 1÷2 phút. Hàm số A290nm= f(t) cho phép tính toán được tốc độ hình thành hydroquinone (HQ)ban đầu (∆A/Δt) chính là hệ số góc của tiếp tuyến tại t = 0. Tốc độ này dùng để tính toán để tìm ra hoạt tính của enzyme dựa vào công thức sau:
GODA = µmole HQ/phút/ml (1) Trong đó:
: Tốc độ hấp thụ ban đầu.
V = 4ml, là thể tích hỗn hợp phản ứng tiêu chuẩn được sử dụng để xác định. v = 0,1ml, là thể tích chuẩn của GOD dùng để xác định.
= 2,31, hệ số hấp thụ phân tử của HQ tại bước sóng 290nm. l = 1 cm, là chiều dài chuẩn của cuvet phân tích.
Chương 3