Ly tâm Mốc giống Tăng sinh Lên men Lọc Sinh khối Dịch lên men Kết tủa Khuấy trộn Phân cắt tế bào Kết tủa (NH4)2SO4 Loại muối Làm khô lạnh Sắc ký phân loại kích cỡ Làm đơng khơ Chế phẩm enzyme
Hình 1. 7. Sơ đồ quy trình thu nhận enzyme Glucose oxidase
Kể từ khi phân tách sắc ký trao đổi ion trên cơ sở những pI khác nhau, người ta tìm thấy GOD từ P. amagakiense chứa 4 isoenzym khác nhau của những giá trị pI là 4,37; 4,42; 4,46 và 4,51. GOD mang điện tích âm trong nước cất 2 lần tùy thuộc vào pI của nó là 4÷5. Nó được hấp thu ở đầu cột. Trên quá trình chiết với bộ đệm chiết (pH= 3,6), GOD trở thành điện tích dương và hấp thu từ nhựa trao đổi ion. Những phần chiết khác nhau của GOD mang những lượng điện tích khác nhau và phân tách chúng khỏi nhau. Phần phân chia đầu tiên, GOD A có ít điện tích hơn GOD B trong qui trình làm sạch; do đó sự ảnh hưởng của xung điện tích với hình thể của GOD A thì nhỏ và có hoạt tính enzyme cao. GOD B mang nhiều điện tích âm hơn GOD A, và do đó nó có thể chỉ được chiết ra sau GOD A và cũng phá hủy SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B
hình thể riêng, làm giảm hoạt tính enzyme. Năm 1997, Rando đã sử dụng phương pháp chi tiết hóa và hiệu quả cho qui trình làm sạch GOD từ P. pinophilum. Quá
trình làm sạch GOD để đồng nhất hóa với hiệu suất 74% bao gồm bước chiết hiệu quả của khối khuẩn ty ở pH = 3,0 và sắc ký trao đổi ion theo sau là lọc gel.
1.3.6. Tình hình nghiên cứu enzyme glucose oxidase trong và ngồi nước
Từ những năm 1950, enzyme GOD đã được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất bột trứng sấy để loại bỏ glucose và trong bộ cảm biến glucose cho bệnh nhân tiểu đường để kiểm tra thường xuyên lượng đường trong máu [20]. Hơn 40 năm qua, nhiều ứng dụng của nó đã được phát triển và những gần đây GOD tiếp tục được các nhà nghiên cứu quan tâm.
Năm 1993, Petruccioli và cộng sự nghiên cứu quá trình sản xuất GOD bởi 84 chủng của Penicillium và kết luận P. expansum (1 chủng), P. italicum (1 chủng), P.
chrysogenum (3 chủng) and P. variabile (3 chủng), khi nuôi trên nguồn cacbon
glucose nó tạo ra hoạt tính GOD từ 0.61Uml-1 đến 5.45Uml-1 [20].
Năm 1995, D. G. Hatzinikolaou và B. J. Macris nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình sản xuất enzyme GOD bởi Aspergillus niger và xác định được vùng điều kiện tối ưu sinh tổng hợp enzyme GOD [13], cũng trong năm này Maurizio Petruccioli và cộng sự nghiên cứu quá trình sản xuất GOD bởi chủng đột biến Penicillium variabile ( P16) với hoạt tính GOD lên đến 19.09Uml-1 sau 96h lên men, cao hơn 127% so với chủng ban đầu [15].
Cũng với loài Aspergillus niger năm 1996 Tongbu Lu và cộng sự nghiên cứu quá trình sản xuất và ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính enzyme và kết luận: ở nồng độ thấp muối clorua và gluconate kim loại (như các muối clorua, gluconate của natri, kali, canxi, magie, kẽm) kích thích hoạt tính GOD nhưng ở nồng độ cao hơn, các muối clorua và gluconate thể hiện mức độ ức chế khác nhau, và ở cùng nồng độ sự ức chế của muối clorua mạnh hơn muối gluconate [22], năm 1999 trong nghiên cứu khả năng thu nhận GOD khi sử dụng nước ngâm bắp sinh tổng hợp bởi Aspergillus nige R. P. Kona và cộng sự kết luận hoạt tính enzyme tăng đến 640±36U/ml khi bổ sung nước ngâm bắp vào môi trường, họ nhận thấy
nitơ muối nitrat của canxi, natri, amoni, kali và dịch chiết nấm men, dịch chiết malt và peptone [19].
Với mục đích nâng cao sản xuất GOD năm 2007 Shazia Sabir và cộng sự nghiên cứu sản xuất GOD từ Penicillium notatum sử dụng cám gạo, hoạt tính của enzyme đạt được tối đa 112±5U/ml dưới các điều kiện tối ưu: cám gạo 5g, nuôi trong 72h ở (30±1)0C và pH=6.0 [20]. Năm 2009 Muhammad Ramzan và Tahir Mehmood nghiên cứu sản xuất GOD từ chủng Aspergillus niger đột biến UV nhận thấy hoạt tính enzyme ngoại bào và nội bào tăng lên 1.57 and 1.98 lần so với chủng bố mẹ [16].
Nhiều ứng dụng của GOD trong những năm qua đã được nghiên cứu, đặc biệt trong công nghiệp thực phẩm: Năm 1998 G. J. Pickering và cộng sự nghiên cứu ứng dụng của GOD trong sản xuất rượu có độ cồn thấp bởi glucose chuyển thành axit gluconic làm cho nồng độ cồn giảm xuống [12]. Năm 2004 Hardeep Singh Gujral và Cristina M. Rosell nghiên cứu cải thiện tính chất nướng bánh của bánh mì làm từ bột gạo khi sử dụng enzyme GOD. Trong nghiên cứu này ảnh hưởng của GOD đến tính lưu biến của bột nhào, sự sửa đổi protein và tính chất nướng bánh được trình bày. GOD làm thay đổi protein của bột gạo bởi nó làm giảm nồng độ của nhóm thiol và amino [13].
Ứng dụng của GOD khơng chỉ phát triển trong công nghiệp thực phẩm mà cịn trong các ngành cơng nghiệp khác. Điều này được chứng minh trong nghiên cứu “Hydrogen peroxide generation with immobilized glucose oxidase for textile
bleaching” của Tzanko Tzanov và cộng sự (2001), hydrogen peroxide sinh ra dùng
để tẩy trắng trong ngành dệt [23].
Tuy nhiên, ở nước ta tình hình nghiên cứu về enzyme GOD cịn rất hạn chế. Đáng chú ý nhất là các đề tài: “Nghiên cứu thụ động enzyme glucose oxidase trên
cảm biến nano sinh học để kiểm tra và định lượng glucose” của Trần Phú Duy [25]
và “Nghiên cứu khả năng gắn enzyme glucose oxidase vào sợi nano platinum để tạo
cảm biến glucose” của Lê Thị Thanh Tuyền (2008) [27].
1.4. Nhận xét chung
SVTH: Trần Văn Hoàng Lớp 06H2B Đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase ngoại bào thô từ nấm mốc
Từ những bằng chứng trên, GOD là một trong những enzyme quan trọng nhất được sử dụng trong qui trình cơng nghiệp. Nó có khả năng sử dụng trong thực phẩm, dược, cơng nghệ sinh học và cơng nghiệp hương liệu. Vì vậy quá trình lên men sản xuất enzyme GOD với qui mô lớn là cần thiết.
Mặc dù, nguồn vi sinh vật phong phú, đa dạng nhưng quá trình sản xuất enzyme này vẫn còn hạn chế chỉ trong vài chủng nấm mốc và nấm men được lựa chọn.
Tuy GOD đã được sử dụng lâu dài trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau, nhưng những sự cải tiến về mặt kỹ thuật luôn được xem xét. Tuy nhiên, kết quả thỏa đáng trong việc ứng dụng GOD cố định mà khơng có bất cứ hạn chế nào hiếm khi đạt được. Những vấn đề như sự hạn chế khuếch tán và giảm hoạt tính enzyme sau khi đã cố định cần được vượt qua để có lợi ích nhiều hơn. Tương tự,