Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme từ nội tạng cá tra

Đại Học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA LÊ NGUYỄN TỐ QUYÊN NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME TỪ NỘI TẠNG CÁ TRA Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm Đồ uống LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 07 năm 2009 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH Cán hướng dẫn khoa học: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Cán chấm nhận xét 1: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Cán chấm nhận xét 2: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Luận văn thạc sĩ bảo vệ HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày tháng năm TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc -oOo Tp HCM, ngày 01 tháng 08 năm 2009 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Lê Nguyễn Tố Quyên Ngày, tháng, năm sinh: 12/09/1984 Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm Đồ uống MSHV: 01107438 Phái: Nữ Nơi sinh: Đồng Tháp 1- TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme từ nội tạng cá tra 2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂ ĂN: - Khảo sát hoạt tính hệ enzyme thu từ nội tạng cá tra - Khảo sát q trình trích ly enzyme lipase từ nội tạng cá tra - Tối ưu hóa q trình trích ly enzyme lipase từ nội tạng cá tra - Khảo sát q trình kết tủa enzyme thơ từ nội tạng cá tra - Khảo sát giảm hoạt tính enzyme lipase theo thời gian 3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Ghi đầy đủ học hàm, học vị): TS Trần Bích Lam Nội dung đề cương Luận văn thạc sĩ Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Họ tên chữ ký) CHỦ NHIỆM BỘ MÔN KHOA QL CHUYÊN NGÀNH QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH (Họ tên chữ ký) (Họ tên chữ ký) LỜI CẢM ƠN Đối với học viên cao học, trình thực Luận văn thạc sĩ xem hội thách thức lớn để tổng kết lại kiến thức đào tạo suốt khóa học ứng dụng chúng vào thí nghiệm thực tế Chính thế, q trình làm việc, tơi đối mặt với khơng khó khăn, trở ngại Tuy nhiên, với hỗ trợ thầy cô, người thân, đồng nghiệp bạn bè, tơi hồn thành đề tài Nhân đây, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: - Tiến sĩ Trần Bích Lam – người tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ tơi q trình thực đề tài – thầy cô môn - Gia đình đặc biệt cha mẹ – hai người theo sát, động viên thời gian qua - Đồng nghiệp – người nhiệt tình hỗ trợ tơi cơng việc để tơi có dành toàn tâm toàn ý làm đề tài - Bạn bè – người quan tâm giúp đỡ TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Từ thực trạng nguồn phụ phẩm ngành chế biến thuỷ sản nói chung cá tra nói riêng chưa khai thác xử lý mức, vấn đề đặt làm để chế biến nguồn phụ phẩm thành sản phẩm giá trị gia tăng để mang lại hiệu kinh tế cho nhà sản xuất đồng thời giảm thiểu tình trạng nhiễm mơi trường phế liệu nhà máy thuỷ sản gây Với mục đích tìm giải pháp cho vấn đề vừa nêu, nghiên cứu thực nhằm tìm cách thu nhận hệ enzyme nội tạng cá tra Các kết thu khảo sát hoạt tính enzyme amylase, protease lipase dịch chiết enzyme thu từ nội tạng cá tra cho thấy nguồn thu nhận amylase protease lý tưởng Vì vậy, q trình trích ly hệ enzyme khảo sát tối ưu hoá với hàm mục tiêu hoạt tính riêng lipase Dịch chiết enzyme có hoạt tính riêng enzyme lipase cao 2.149 µmol acid béo/h/mg protein tiến hành q trình trích ly điều kiện sau: tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch trích ly: 96/500 (w/w), nhiệt độ: 28oC, pH thời gian trích ly: Bên cạnh đó, q trình kết tủa enzyme thơ ethanol tỷ lệ ethanol dịch chiết enzyme khác thực kết cho thấy tiến hành kết tủa với tỷ lệ ethanol dịch chiết enzyme 50:50 hoạt tính lipase thu cao 4.153 µmol acid béo/h/ml dịch chiết enzyme Hiệu suất thu hồi độ tinh chế phẩm enzyme thơ 93% 6.08 lần Hoạt tính lipase chế phẩm giảm dần trình bảo quản Tuy nhiên, thời gian đầu, hoạt tính lipase giảm nhanh ngày sau hoạt tính giảm chậm dần Sự thay đổi hoạt tính biểu diễn hàm số mũ: y = 5.3979e-0.375x MỤC LỤC MỤC LỤC MỤC LỤC I DANH MỤC BẢNG III DANH MỤC HÌNH V DANH MỤC HÌNH V CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 Cá tra 2.1.1 Sơ lược [9, 34] 2.1.2 Hiện trạng nghề nuôi chế biến cá tra Đồng sông Cửu Long [4,35] .4 2.1.3 Chế biến phụ phẩm cá tra: thực trạng giải pháp [34] 2.1.4 Tiềm nguồn enzyme từ nội tạng cá tra 2.2 Các enzyme động vật thuỷ sản [8, 22] .7 2.2.1 Sơ lược .7 2.2.2 Các enzyme tiêu hoá quan trọng động vật thuỷ sản 2.2.3 Các enzyme tiêu hoá cá da trơn 25 2.3 Các ứng dụng enzyme từ động vật thuỷ sản [22] .28 2.3.1 Biến tính có chọn lọc mơ cá động vật không xương sống 28 2.3.2 Tận dụng protease từ cá động vật có vú sống nước để thay cho rennet quy trình sản xuất phô mai .33 2.3.3 Khử mùi oxy hố sữa 34 CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .36 3.1 Nguyên liệu 36 3.1.1 Nội tạng cá tra 36 3.1.2 Thiết bị 36 3.2 Phương pháp nghiên cứu .36 3.2.1 Mục đích nghiên cứu 36 3.2.2 Nội dung nghiên cứu .37 3.2.3 Các phương pháp phân tích 40 3.2.4 Phương pháp tính tốn xử lý số liệu .46 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 48 4.1 Xây dựng đường chuẩn 48 I MỤC LỤC 4.1.1 Xây dựng đường chuẩn albumin .48 4.1.2 Xây dựng đường chuẩn tyrosin .49 4.2 Khảo sát hoạt tính hệ enzyme thu từ nội tạng cá tra .50 4.2.1 Tiến trình khảo sát 50 4.2.2 Kết khảo sát .50 4.3 Khảo sát q trình trích ly enzyme lipase từ nội tạng cá tra .56 4.3.1 Xác định thời gian trích ly 56 4.3.2 Xác định tỷ lệ nguyên liệu dung mơi trích ly 58 4.3.3 Xác định nhiệt độ trích ly 60 4.3.4 Xác định pH trích ly 63 4.4 Tối ưu hóa trình trích ly enzyme lipase từ nội tạng cá tra [4] 66 4.4.1 Chọn phương pháp quy hoạch thực nghiệm 66 4.4.2 Tổ chức thí nghiệm trực giao cấp I 67 4.4.3 Tiến hành tối ưu hoá thực nghiệm phương pháp dốc đứng .68 4.5 Khảo sát q trình kết tủa enzyme thơ từ nội tạng cá tra 69 4.6 Khảo sát giảm hoạt tính enzyme lipase theo thời gian 71 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN 76 5.1 Về hoạt tính hệ enzyme nội tạng cá tra .76 5.2 Về ảnh hưởng điều kiện trích ly đến hoạt tính riêng lipase dịch chiết enzyme thu từ nội tạng cá tra 76 5.3 Về trình kết tủa enzyme thô ethanol 76 5.4 Về biến đổi hoạt tính lipase theo thời gian 76 PHỤ LỤC 1: PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN 77 Định lượng protein thô phương pháp Micro-Kjeldahl [2, 10] 77 Định lượng protein hòa tan theo phương pháp Lowry [11, 26] 79 PHỤ LỤC 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME 82 Enzyme amylase 82 Enzyme protease [16] 83 Enzyme lipase [17, 23, 26, 29, 30] 83 PHỤ LỤC 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME [5] 91 Phương pháp trích ly kết tủa muối 91 Phương pháp trích ly kết tủa enzyme dung mơi hữu 91 Phương pháp sử dụng pH 92 II MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Thành phần thức ăn ruột cá tra tự nhiên Bảng 2: Khối lượng phần khác cá tra Bảng 3: Một số enzyme tiêu hóa ngoại bào động vật thủy sản [22] Bảng 4: Tính bền nhiệt, tính bền pH tính chất động học protease dày loài cá khác [22] 11 Bảng 5: Tính bền nhiệt, tính bền pH tính chất động học protease thu từ ruột động vật thuỷ sản [22] 14 Bảng 6: Các proteinase thu từ mô động vật thuỷ sản [22] 19 Bảng 7: Hoạt tính enzyme có mặt phần khác nội tạng cá da trơn Brazil (Pseudoplatystoma coniscans) [28] .27 Bảng 8: Các ứng dụng enzyme thu nhận từ số loài động vật thuỷ sản 29 Bảng 1: Thành phần ống nghiệm để xác định hoạt tính amylase 41 Bảng 2: Thành phần dung dịch tyrosin chuẩn 43 Bảng 3: Thành phần ống nghiệm để xác định hoạt tính protease 43 Bảng 4: Thành phần ống nghiệm để xác định hoạt tính lipase 45 Bảng 1: Mật độ quang ứng với nồng độ dung dịch albumin chuẩn khác 48 Bảng 2: Mật độ quang ứng với nồng độ dung dịch tyrosin chuẩn khác 49 Bảng 3: Nồng độ protein dịch trích ly mẫu bỏ mật mẫu không bỏ mật 50 Bảng 4: Hoạt tính riêng enzyme amylase nội tạng cá mẫu bỏ mật mẫu không bỏ mật .52 Bảng 5: Hoạt tính riêng enzyme protease nội tạng cá mẫu bỏ mật mẫu không bỏ mật .52 Bảng 6: Hoạt tính riêng enzyme lipase nội tạng cá mẫu bỏ mật mẫu không bỏ mật 53 Bảng 7: Nồng độ protein hịa tan dịch trích ly ứng với khoảng thời gian trích ly khác 56 Bảng 8: Hoạt tính riêng enzyme lipase nội tạng cá tra ứng với khoảng thời gian trích ly khác .57 Bảng 9: Nồng độ protein hịa tan dịch trích ly ứng với tỷ lệ ngun liệu dung mơi trích ly khác .59 Bảng 10: Hoạt tính riêng enzyme lipase nội tạng cá tra ứng với tỷ lệ ngun liệu dung mơi trích ly khác 59 Bảng 11: Nồng độ protein hòa tan dịch trích ly ứng với nhiệt độ trích ly khác 61 III MỤC LỤC Bảng 12: Hoạt tính riêng enzyme lipase nội tạng cá tra với nhiệt độ trích ly khác 61 Bảng 13: Nồng độ protein hịa tan dịch trích ly ứng với pH trích ly khác 64 Bảng 14: Hoạt tính riêng enzyme lipase nội tạng cá tra với pH trích ly khác 64 Bảng 15: Điều kiện thí nghiệm chọn .66 Bảng 16: Ma trận quy hoạch TYT 22 67 Bảng 17: Kết tính bước chuyển động δ j yếu tố 68 Bảng 18: Kết thí nghiệm theo hướng dốc đứng 69 Bảng 19: Nồng độ protein hịa tan dịch trích ly ứng với tỷ lệ dung môi kết tủa khác 70 Bảng 20: Hoạt tính riêng enzyme chế phẩm enzyme thơ ứng với tỷ lệ dung môi kết tủa khác 70 Bảng 21: Hoạt tính riêng enzyme lipase, hiệu suất thu hồi độ tinh chế phẩm enzyme thô ứng với tỷ lệ dung môi kết tủa khác 70 Bảng 22: Hoạt tính lipase thu từ số lồi vi sinh vật phương pháp lên men [15] 74 Bảng PHỤ LỤC 1: Thành phần dung dịch tyrosin chuẩn 80 Bảng PHỤ LỤC 2: Thành phần ống nghiệm để xác định mật độ quang mẫu dịch chiết enzyme 80 IV MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH Hình 1: Cá tra Hình 2: Diện tích sản lượng ni cá tra Đồng sông Cửu Long từ năm 2001 đến năm 2006 [3] Hình 3: Khối lượng giá trị kim ngạch cá tra xuất Đồng sông Cửu Long từ năm 2001 đến năm 2006 [3] Hình 4: Sự hình thành protein tác động xúc tác transglutaminase 24 Hình 5: Hoạt tính amylase phần nội tạng cá da trơn nhọn [32] 26 Hình 6: Hoạt tính protease phần nội tạng cá da trơn nhọn [32] 26 Hình 1: Cấu tạo hệ thống tiêu hoá cá .36 Hình 2: Sơ đồ nghiên cứu 37 Hình 3: Quy trình trích ly enzyme từ nội tạng cá tra 38 Hình 4: Quy trình kết tủa enzyme thô từ dịch chiết enzyme nội tạng cá tra 39 Hình 1: Đường chuẩn albumin .48 Hình 2: Đường chuẩn tyrosin 49 Hình 3: Nồng độ protein hịa tan dịch trích ly so sánh mẫu bỏ mật (BM) mẫu không bỏ mật (M) 51 Hình 4: Hoạt tính riêng enzyme amylase nội tạng cá so sánh mẫu bỏ mật (BM) mẫu không bỏ mật (M) 54 Hình 5: Hoạt tính riêng enzyme protease nội tạng cá so sánh mẫu bỏ mật (BM) mẫu không bỏ mật (M) 54 Hình 6: Hoạt tính riêng enzym lipase nội tạng cá so sánh mẫu bỏ mật (BM) mẫu không bỏ mật (M) 55 Hình 7: Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease kiềm số lồi cá [14] 55 Hình 8: Hoạt tính riêng enzyme lipase nội tạng cá tra ứng với khoảng thời gian trích ly khác 58 Hình 9: Hoạt tính riêng enzyme lipase nội tạng cá tra ứng với tỷ lệ nguyên liệu dung môi trích ly khác 60 Hình 10: Hoạt tính riêng enzyme lipase nội tạng cá tra ứng với nhiệt độ trích ly khác 62 Hình 11: Hoạt tính riêng enzyme lipase nội tạng cá tra ứng với nhiệt độ trích ly khác 65 Hình 12: Hoạt tính enzyme lipase nội tạng cá tra ứng với tỷ lệ dung mơi trích ly dịch chiết enzyme khác 71 Hình 13: Sự biến đổi hoạt tính riêng lipase theo thời gian 72 Hình PHỤ LỤC 1: Mơ hình phương pháp pH – stat .85 Hình PHỤ LỤC 2: Sơ đồ phương pháp nhỏ giọt dầu “oil drop” .86 V MỤC LỤC PHỤ LỤC CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME Enzyme amylase Để xác định hoạt tính enzyme amylase dùng phương pháp sau: Phương pháp đo độ nhớt Davison [20] Nguyên tắc: đo biến thiên độ nhớt dung dịch nhớt kế cho amylase tác dụng lên hồ tinh bột, mạch phân tử chất bị cắt ngắn, độ nhớt dung dịch giảm dần Trong phương pháp hoạt tính amylase xác định lượng enzyme làm giảm 20% độ nhớt 60 phút, 10% 19.2 phút, 5% 8.4 phút Do 0.2 ml dung dịch enzyme làm giảm đến 80% độ nhớt ban đầu 20 phút dung dịch chứa đơn vị amylase ml Phương pháp Wohlgemuth [18, 19, 20, 24] Nguyên tắc: đo mật độ quang dung dịch sau thực phản ứng màu với iode Khi có amylase tác dụng sản phẩm phân giải tinh bột cho màu khác iode Phương pháp dựa vào màu xanh tinh bột iot tinh bột bị thủy phân Một lượng tăng dần dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm, cho ml dung dịch tinh bột 1% làm lạnh vào ống Tất sau cho đồng thời vào tủ ấm khoảng thời gian tùy ý, sau chúng lấy ra, cho nước cất đến gần đầy nhỏ giọt iode 0.1 N vào ống nghiệm Đơn vị hoạt tính số ml tinh bột 1% mà ml enzyme chuyển hóa thành dextrin điều kiện thí nghiệm cụ thể (thời gian, nhiệt độ …) Phương pháp Bernfield [32] Nguyên tắc: đo lượng đường maltose glucose tạo thành sau cho enzyme tác dụng lên chất Dưới tác dụng amylase, hàm lượng tinh bột giảm, hàm lượng dextrin tăng lên Tiến hành đo hàm lượng maltose giải phóng acid 3,5 dinitrosalisilic bước sóng 540 nm Hoạt tính amylase xác định số mg maltose giải phóng từ tinh bột g vật liệu phút 35oC pH 6.9 82 MỤC LỤC Trong phương pháp này, mẫu lấy khỏi dung dịch thủy phân sau 30 phút cho phản ứng với dung dịch Fehling Hỗn hơp cho vào bể điều nhiệt 112oC để xác phút Sau lấy lọc Kết tủa rửa với nước cất 60oC, sau hịa tan vào hỗn hợp muối sắt amon sulfate acidt sulfuric 0.5 M; chuẩn độ với dung dịch kali manganat 0.5 N Lượng đường biến đổi tính tốn từ giá trị chuẩn độ, xác định hoạt tính enzyme Enzyme protease [16] Để xác định hoạt tính protease, ta sử dụng phương pháp sau: Xác định thay đổi độ nhớt Cơ chất dung dịch gelatin 3% chỉnh pH 2.5 pepsin pH 7.4 dùng photphat 0.05 M trypsin 10 ml chất cho vào nhớt kế đặt bể điều nhiệt 35oC; cho 0.2 – 0.4 ml dịch chứa enzyme vào gelatin tăng lên đến nhiệt độ bể Enzyme vô hoạt cho vào hệ thống tương tự để làm mẫu đối chứng Dựa vào khoảng thời gian, độ nhớt hệ thống xác định Một đơn vị hoạt tính enzyme xác định lượng enzyme cần thiết để làm giảm 20% độ nhớt 60 phút, 10% 19.2 phút 5% 8.4 phút Xác định giảm hàm lượng nitơ protein Phương pháp Northrop sử dụng casein 2% làm chất Protein làm kết tủa vào lúc đầu mẫu, sau khoảng thời gian thích hợp, mẫu phản ứng kết tủa protein trước acid tricloacetic (TCA) Xác định hàm lượng kết tủa để xác định hoạt tính enzyme Xác định giảm số lượng liên kết peptide (chuẩn độ formol) Peptone dùng làm chất Một giọt dung dịch phenoltalein 0.1% cho vào ml dịch thủy phân toàn chuẩn đến xuất màu hồng dung dịch NaOH N/50 chứa giọt dung dịch phenoltalein ml 0.1 ml formol 40% thêm vào ml dung dịch dung dịch chuẩn độ đến màu tương tự lúc đầu Để thuận tiện, với mẫu người ta tiến hành cặp, hai đưa đến màu Formol cho vào mẫu thứ chuẩn đến màu mẫu thứ 2, cho formal vào mẫu thứ chuẩn đến màu mẫu thứ Xác định phương pháp Anson cải tiến Nội dung phương pháp trình bày chi tiết mục 3.2.3.2 Enzyme lipase [17, 23, 26, 29, 30] Có nhiều phương pháp để xác định hoạt tính enzyme lipase số tác giả miêu tả, phương pháp kiểm chứng kỹ lưỡng (Jensen 1983, 83 MỤC LỤC Jaeger cs 1994, Beisson cs 2000) Hầu hết phương pháp thiết kế dựa vào việc xác định sản phẩm phản ứng thủy phân Các phương pháp phân loại sau: (Frédéric Beisson cs, 2000) Phương pháp đĩa (Plate assays) Các lipase sinh tổng hợp nuôi cấy vi sinh vật xác định phương pháp đĩa mơi trường agar Đĩa phân tích dùng để phát sản phẩm phản ứng lipase cách dùng hợp chất: Methyl red, Phenol red, Rhodamine B Victoria blue B làm chất thị màu (Converse cs.1981, Kouker Jaeger 1987, Samad cs 1989) Trong phương pháp này, huyền phù chất béo cho vào môi trường nuôi cấy với chất thị màu.Phản ứng thủy phân chất béo hình thành nên màu khả kiến vịng sáng huỳnh quang (fluorescent halos) vùng khuẩn lạc mọc xung quanh Các acid báo monoesters polyoxyethylene sobitan liên kết với Remazol brilliant blue R địa phát triển Wirth (1992) Phương pháp chuẩn độ (Titrimetry) (Hình PHỤ LỤC 1) Phản ứng thuỷ phân lipase giải phóng acid béo acid chuẩn độ Rowe Gilmour (1981) miêu tả phương pháp xác định lipase huyết sữa cách dùng dầu oliu chất Phản ứng thuỷ phân vòng làm ngừng phản ứng ethyl alcohol Hỗn hợp phản ứng sau chuẩn độ với dung dịch kiềm Từ thể tích chuẩn độ nồng độ dung dịch kiềm xác định trước, người ta tính tốn lượng acid béo giải phóng từ xác định hoạt tính lipase Một phương pháp khác dùng để xác định hoạt tính lipase phương pháp “pHstat” Trong trình lipase xúc tác phản ứng giá trị pH hỗn hợp giữ cố định dung dịch NaOH thời gian (Gargouri cs 1986) Tốc độ phản ứng tuyến tính theo đường thẳng lipase nồng độ chất Nồng độ chất có ảnh hưởng quan trọng tạo nên bề mặt tiếp xúc lớn triacylglycerol nhũ tương hoá phương pháp siêu âm (sonication) Goodman Durgan (1969) dùng sóng siêu âm để nhũ hố dầu liu gơm arabic nhằm cải thiện độ nhạy phương pháp 84 MỤC LỤC Hình PHỤ LỤC 1: Mơ hình phương pháp pH – stat Kiểm soát áp suất bề mặt thoáng phương pháp đo sức căng bề mặt Các lipase phản ứng bề mặt hai pha lỏng không trộn lẫn vào pha béo pha nước Sức căng bề mặt thông số quan trọng Để kiểm tra lipase, thơng số sức căng bề mặt có ý nghĩa quan trọng giống nhiệt độ pH Tác động sức căng bề mặt số tác giả nghiên cứu thông quan kỹ thuật lớp đơn monolayer (Verger 1980 Ransac cs 1991) Một màng mỏng lớp đơn phân tử trải bề mặt thoáng nước, lớp film bị nén vật cản làm thay đổi mật độ chất, tạo nên sức căng bề mặt Lipase xâm nhập vào pha nước thứ cấp màng film đồng thời thuỷ phân chất Các chất (dicaprin, trioctanoin, didecanoin didodecanoin) không tan nước sản phẩm thuỷ phân từ chúng hồn tan nước Nó thuỷ phân chất có chuỗi acyl dài điều kiện sức căng bề mặt nhỏ 23mN/m albumin diện pha thứ cấp chất thu nhận sản phẩm (Ransac cs 1991) Khi chất thuỷ phân rời khỏi bề mặt làm cho giảm mật độ sức căng bề mặt Màng film bù vào thiếu hụt sức căng bề mặt, barrier di động di chuyển theo hàm thời gian Nury cộng (1987) phát triển phương pháp đo sức căng bề mặt để xác định hoạt tính enzyme lipase Phương pháp gọi phương pháp nhỏ giọt dầu (oildrop method) (Hình PHỤ LỤC 2) Phương pháp dùng hệ thống đầu kim nhỏ giọt (dầu) vào dung dịch nước Hình dạng giọt dầu ổn định nhờ vào sức căng bề mặt dầu nước Khi khơng có chất hoạt động bề mặt acid béo mơi trường hình dạng giọt dầu trơng giống táo Khi cho enzyme lipase vào 85 MỤC LỤC nước (chứa giọt dầu), thuỷ phân giọt dầu (cơ chất), hình dạng giọt dầu thay đổi sang dạng lê, cuối thời điểm xác định, giọt dầu rời khỏi đầu kim (Hình dưới) Một chương trình máy tính gọi “oil drop tensiometer” nghiên cứu sử dụng để kiểm tra tự động hoạt tính lipase theo nguyên lý (Labourdenne cs 1994) Hình PHỤ LỤC 2: Sơ đồ phương pháp nhỏ giọt dầu “oil drop” (1): Bàn kính, (2): đèn halogen, (3): cuvet điều nhiệt , (4): bơm tiêm (Exmire type), (5): DC motor with a 500 count per revolution optical encoder, (6): thấu kính (Melles Griot, Rochester, NY, USA), (7): CCD camera 512 x 512, (8): máy tính, (9): hình Phương pháp quang phổ (Spectroscopy) Nhiều phương pháp xác định hoạt tính lipase sở phép đo quang phổ đời Rollof cs (1984) phát triển kỹ thuât kiểm tra theo phương pháp Kỹ thuật sử dụng phương pháp đo trực tiếp mật độ quang để định lượng số lipid dư sau phản ứng thuỷ phân lipid lipase Kỹ thuật đo mật độ quang (turbidometric) Robinson cs (1989) dùng để xác định hoạt tính lipase huyết sữa Các triacylglycerol chất tự nhiên lipase nhiều phương pháp đo quang phổ (spectrophotometric method) dùng chúng chất cho phản ứng phương pháp Một vài kỹ thuật đo quang phổ phát triển sở màu 86 MỤC LỤC acid béo giải phóng trình thuỷ phân triacylglycerol Van Autryve cs (1991) dùng rhodamine 6G cho phức hợp hoá (complexation) với acid béo tự giải phóng q trình thuỷ phân lipdid Phức hợp tạo thành màu hồng xuất đo độ hấp thụ bước sóng 513nm Medcova cs (1981) kiểm tra hoạt tính monoglyceride lipase cách dùng chất Tween 20 Acid lauric giải phóng tạo phức hợp với đồng laurate xác định quang phổ bước sóng 435 nm Safarik (1991) phát triển phương pháp sử dụng triacylglycerol cố định Theo phương pháp này, acid béo giải phóng sau dùng enzyme thuỷ phân Acid béo chiết tách benzene cho phản ứng với dung dịch muối đồng II Rawyler Siegenthaler (1989) miêu tả phương pháp sử dụng thuộc tính màu cation, safranine, để xác định thay đổi tích điện âm bề mặt lipid nước Thông số xác định thông qua thay đổi safranine Các xét nghiệm nhạy xác định số lượng nhỏ enzyme thuỷ phân lipid đầu sử dụng phương pháp Một phương pháp khác dựa sở xác định glycerol acid béo giải phóng q trình thuỷ phân triacylglycerol lipase Fossati, cs (1992) miêu tả phương pháp động học phản ứng màu (kinetic colorimetric method) để xác định hoạt tính lipase huyết sữa Các tác giả sử dụng chuỗi acid béo tự nhiên 1,2-diglyceride làm chất Khi có diện colipase, deoxycholate calcium ions, lipase tuyến tuỵ thuỷ phân hoàn toàn chất để tạo thành 2monoglyceride, glycerol giải phóng tác dụng 2-monoglyceride lipase Glycerol kiểm tra hệ thống enzyme (glycerol kinase, glycerol phosphate oxidase, peroxidase) tạo sản phẩm có màu tím (violet) quinone monoimine hấp thụ bước sóng 550 nm Woollett cs (1984) miêu tả phương pháp xác định số lượng acid béo tự giải phóng q trình thuỷ phân triglyceride lipoprotein lipase Số lượng acid béo tự diện môi trường trước sau phản ứng thủy phân xảy xác định quang phổ (spectrophotometrically) dựa hệ thống oxi hoá NADH Trong vài phép đo quang phổ, chất nhân tạo sử dụng McKellar (1986) xác định hoạt tính lipase sữa gầy (skim milk) cách dùng β- 87 MỤC LỤC naphthyl caprylate làm chất Sản phẩm β-naphthol tạo thành cho phản ứng màu với blue BB Sản phẩm màu chiết tách ethanol xác định nồng độ màu máy đo quang (phổ spectrophotometer) Kurooka cs (1977) miêu tả phương pháp dùng 2,3-dimercaptopropan-1-ol tributyrate làm nguồn chất 5,5’dithiobis (2-nitro-benzoic acid) làm chất thị màu (chromogenic reagent) Richardson cs (1989) dùng dẫn xuất arylethene làm chất Sản phẩm phản ứng thủy phân có màu sắc đặc trưng tan nước, sản phẩm dễ dàng nhận biết cách màu đo quang phổ Para-nitrophenyl-ester có chuỗi acid béo dài sử dụng làm chất (Winkler Stuckmann, 1979) Tuy nhiên, chất khơng thích hợp dùng cho phương pháp kiểm tra lipase chất khơng chất đặc hiệu lipase mà chất esterase, esterase phân cắt loại chất (Stuer cs 1986) Một phương pháp so màu sử dụng diện chất hữu hoà tan Điều hữu ích việc tinh theo phương pháp micell ngược (AiresBarros Cabral 1991, Prazeres cs 1993a 1993b) Một cách phân tích quang phổ dựa vào đặc tính hấp thụ quang học tự nhiên acid béo, acid cisparinaric (PnA), Rogel cs (1989) sử dụng PnA tự hấp thụ tia UV bước sóng 321.2 nm Khi PnA bao quanh Bovine Serum Albumin (BSA), đỉnh hấp phụ thay đổi thành 324.2 nm Acid oleic giải phóng phản ứng thuỷ phân triolein enzyme lipase cạnh tranh vị trí PnA BSA Mức độ phản ứng xác định cách đo mật độ quang (OD) bước sóng từ 319 đến 329 nm Các hợp chất huỳnh quang sử dụng chất để xác định hoạt tính lipase Các tác giả (Roy 1980, Cooper Morgan 1981, Stead 1984) dùng dẫn xuất acyl eter fluorophore 4- methylumbelliferon làm chất cho phản ứng lipase Wilton (1990, 1991) tiếp tục tiến trình cách thay hợp chất huỳnh quang acid béo gắn với mồi/ mẫu dò (probe) acid 11-(dansylamino) undecanoic, xác định lượng acid béo gắn với protein Chuỗi acid béo giải phóng q trình thuỷ phân lipase thay acid béo mang gốc huỳnh quang Cũng dùng triacylglycerol có nhóm alkyl thay nhóm huỳng quang pyrenyl (Thuren cs 1987, Negre-Salvayre cs 1991) Trong phức hợp chất, 88 MỤC LỤC nhóm pyrene gắn chặt vào phát huỳnh quang bước sóng 450 nm Khi acid béo phân cắt, huỳnh quang nhóm pyren phát quang 400 nm Một phương pháp quang phổ dùng tia hồng ngoại dùng đo hoạt tính lipase thủy phân triglyceride micell đảo (reverse micelles) Walde Luisi (1989) nghĩ Dùng phương pháp này, q trình thủy phân lipid giám sát ghi nhận hình ảnh tồn phản ứng Fourier Transformed Infra Red (FTIR) Acid béo tự liên kết xác định số lượng dựa vào hệ số phân tử lượng chúng theo nguyên tắc Beer Phương pháp dùng để thủy phân nhiều loại chất khác (trioctanoylglycerol, loại dầu thực vật) Phương pháp sắc ký (Chromatography) Phương pháp kiểm tra hoạt tính lipase dựa sở sắc ký lỏng cao áp (HPLC) phát triển Maurich cs (1991a, 1991b) Ủ β- naphthyl laurate p- nitrophenyl laurate với enzyme, theo số luợng naphthol p-nitro phenol dung dịch kiểm tra HPLC pha đảo Veerraghavan (1990) miêu tả sở việc dùng HPLC với chất triolein Acid oleic hình thành xác định HPLC Ruiz RoudriguezFernandez (1982) phân tích số lượng acid béo tạo thành sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography - TLC) Số lượng xác định hai phương pháp đo độ hấp thụ (densitometry) phóng xạ tự ghi (autoradiographic) Phương pháp phóng xạ tự ghi dùng nhãn phóng xạ gắn với triacylglycerol Kashyap cs (1980) miêu tả phương pháp xác định lipoprotein lipase sắc ký khí (gas chromatography - GC) Acid béo tạo thành sau phản ứng thuỷ phân triacylglycerol giàu lipoprotein chiết tách hexane bốn phần muối ammonium Trong bước chiết tách thứ hai dùng trimethyl (α,α,α-trifluro-m-tolyl) ammonium hydroxide Bốn phần muối ammonium sau ester hoá cách dùng methyl acetate xác định methyl ester tạo thành sắc ký khí (GC) Poluiaktova cs (1995) mô tả phương pháp xác định hoạt tính lipase sương (skeletal muscles) Dạng methyl ester acid oleic sinh trình thuỷ phân triolein xác định sắc ký khí 89 MỤC LỤC Hoạt tính lipase sản sinh mơi trường ni cấy định lượng sắc ký khí (Kulkarni Gadre 1998) Các phương pháp phân tích khác Một số tác giả sử dụng cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance NMR) để xác định hoạt tính lipase nhị pha đại nhũ tương (biphasic macroemulsions) (O’Connor cs 1992) Phương pháp đo độ dẫn (conductometric) miêu tả cách dùng triacetin có chuỗi acid béo ngắn (Ballot cs 1984) Có vài phương pháp phân tích miễn dịch phát triển cách đặc biệt để xác định lipase sữa sản phẩn từ sữa ( Birkelvà cs 1984, Stepaniack cs 1987) Các phương pháp miễn dịch sử dụng cho phân tích lipase: phương pháp ELISA, phương pháp xác định môi trường vật lý, phương pháp xác định dựa vào huyết tương huyết thanh, Immunocytolocalisation, Immunoblot, Như vậy, có nhiều dạng phương pháp khác để kiểm tra hoạt tính enzyme lipase Các phương pháp khác kỹ thuật xác định chất ban đầu sản phẩm cuối Titrimetry dùng pH-stat phương pháp thường dùng để xác định hoạt tính lipase Nhưng phương pháp đòi hỏi nhiều thời gian cần số lượng lớn chất 90 MỤC LỤC PHỤ LỤC CÁC PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME [5] Phương pháp trích ly kết tủa muối Phương pháp dựa nguyên tắc: muối có nồng độ cao có tác dụng với phân tử nước bao quanh protein enzyme làm chuyển hóa điện tích, làm thay đổi tính hịa tan enzyme Trong cơng nghiệp enzyme, người ta thường sử dụng muối ammonium sulfate Nhược điểm tính ăn mịn cao Sau người ta thay sodium sulfate, muối không gây hư hỏng thiết bị tính hịa tan khơng tốt Nhiệt độ tiến hành kết tủa enzyme 35 – 40oC để tránh khả làm hoạt tính enzyme, người ta thường phải làm lạnh dung dịch muối dung dịch enzyme trước trộn hai loại dung dịch lại với Nồng độ tối ưu muối dùng kết tủa enzyme xác định thí nghiệm cụ thể Khoảng tối ưu nồng độ muối dùng kết tủa enzyme rộng, khoảng 20 – 80% Phương pháp trích ly kết tủa enzyme dung mơi hữu Dung mơi hữu có ảnh hưởng lớn đến khả hòa tan enzyme, ảnh hưởng solvat hóa phân tử nước xung quanh phân tử enzyme bị thay đổi, tương tác enzyme tăng lên Nguyên tắc phương pháp sau: cho dung môi hữu vào dung dịch enzyme làm giảm khả hòa tan nước bao quanh enzyme Hiện tượng xảy giảm số điện ly dung môi, đẩy lượng lớn nước Các phân tử nước xếp trật tự xung quanh đoạn kỵ nước bề mặt enzyme thay phân tử dung mơi hữu Từ làm gia tăng độ hịa tan chúng Các enzyme có tính kỵ nước mạnh có khả hịa tan hồn tồn dung môi hữu Nguyên nhân quần hợp protein enzyme lực tĩnh điện, lực Van der Waals (giống muối) Tương tác kỵ nước trường hợp khơng có ý nghĩa lớn, điểm đẳng điện kết tủa diễn tốt nhất, lượng dung mơi sử dụng cho q trình tủa 91 MỤC LỤC Trong công nghiệp sản xuất enzyme, người ta thường sử dụng ethanol aceton để kết tủa enzyme Khi tiến hành kết tủa enzyme nghững dung môi hữu cần lưu ý đến nhiệt độ Do enzyme nhạy cảm với nhiệt độ có mặt chất ethanol acetone, nên bắt buộc tiến hành kết tủa enzyme phải làm lạnh dung môi hữu dung dịch enzyme Mức độ nhạy cảm nhiệt độ enzyme có mặt dung môi hữu thường mạnh mức độ nhạy cảm enzyme với nhiệt độ có mặt muối vô Người ta thường tiến hành kết tủa enzyme dung môi hữu nhiệt độ từ – 10oC Tỷ lệ nồng độ dung môi hữu dùng để kết tủa enzyme xác định thực nghiệm cho loại enzyme nồng độ enzyme có dung dịch Tuy nhiên, trích ly kết tủa enzyme dung môi hữu có nhược điểm xảy tượng biến tính khơng thuận nghịch kết tủa dung môi hữu Nguyên nhân số điện mơi giảm phân tử protein tự tháo gỡ tạo thành dạng không hoạt động, gốc kỵ nước lại tiếp xúc với dung môi Hiện tượng xảy tiến hành tủa nhiệt độ phòng, thực nhiệt độ – 10oC không thấy xuất kết tinh enzyme Trong q trình kết tủa dung mơi hữu tạo nhiệt lượng lớn làm hoạt tính enzyme Do dung dịch sau lọc dung môi làm lạnh trước sử dụng dung môi phải cho từ từ khuấy liên tục để tránh tăng nhiệt độ cục bên hỗn hợp (thời gian – 10 phút nhiệt độ không 5oC) Phương pháp sử dụng pH Protein chất lưỡng cực, chúng có nhóm acid nhóm bazơ Mức độ hịa tan enzyme phụ thuộc vào pH, mức độ tối thiểu chúng điểm đẳng điện, phần lớn protein có điểm đẳng điện khoảng acid, trình gọi kết tủa acid Kết tủa enzyme điểm đẳng điện thường thực quy mô nhỏ, không thực quy mô công nghiệp Thời gian tạo điểm đẳng điện thời gian lưu để tạo kết tủa bền vững thường làm thay đổi hoạt tính enzyme Như vậy, thiết bị phản ứng lớn, khả làm thay đổi hoạt tính enzyme lớn Khi đó, thời gian khuấy trộn thời gian lắng kết tủa kéo dài, enzyme dễ bị biến tính 92 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Lê Ngọc Tú tác giả, “Hố sinh cơng nghiệp”, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội (2002) [2] Lê Thanh Mai cộng sự, “Các phương pháp phân tích ngành cơng nghệ lên men”, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, 2005 [3] Ngô Phước Hậu, “Phát triển bền vững cá tra Pangasius: Quan điểm nhà sản xuất”, Đối thoại cá tra lần thứ (2008) [4] Nguyễn Cảnh, “Quy hoạch thực nghiệm”, Nhà xuất Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh, 117p (2004) [5] Nguyễn Đức Lượng, “Công nghệ enzyme”, Nhà xuất Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh, 534p (2001) [6] Nguyễn Đức Lượng, “Công nghệ sinh học”, Nhà xuất Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh (2001) [7] Nguyễn Đức Lượng, “Công nghệ vi sinh - Tập 2, Vi sinh vật học công nghiệp”, NXB ĐHQG TPHCM (2002) [8] Nguyễn Trọng Cần, Đỗ Minh Phụng, “Công nghệ chế biến thực phẩm thuỷ sản – Tập 1: Nguyên liệu chế biến thuỷ sản”, Nhà xuất Nông nghiệp, 234p 1990) [9] Phạm Văn Khánh, “Kỹ thuật nuôi cá tra ba sa bè”, Nhà xuất Nông nghiệp, 42p (2006) [10] Trần Bích Lam, Tơn Nữ Minh Nguyệt, Đinh Trần Nhật Thu, “Thí nghiệm hố sinh thực phẩm”, Nhà xuất Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh, 83p (2004) [11] Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn, “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme protease từ ruột cá ba sa (Pangasius bocourti)”, Tạp chí phát triển Khoa học Công nghệ, Tập 9, Số 11, p 59 – 67 (2006) [12] Adel Sayaria, Hafedh Mejdoubb and Youssef Gargouri, "Characterization of turkey pancreatic lipase", Journal of Food Biochemistry (82, 2), p 153-159 (2000) [13] Alarcon F.J., Diaz M., Moyana F.J., “Studies on digestive enzyme in fish: Characterization and practical applications”, CIHEAM – Options Meditorraneennes, p 113 - 121 Anna Lindberg and Gunilla Olivecrona, "Lipoprotein lipase from rainbow trout differs in several respects from the enzyme in mammals", Gene (292, 1), p 213-223 (2002) [14] 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO [15] Alan C Lanser1, Linda K Manthey1 and Ching T Hou1, “Regioselectivity of new bacterial lipases determined by hydrolysis of triolein”, Current Microbiology (44), p 336-340 (2002) [16] Bayliss, L.E, “Digestion in the plaice (Pleuronectes platessa)”, Journal of the [17] [18] [19] [20] [21] [22] Marine Biological Association of the United Kingdom (20,1), p 73-91 (1935) Beisson F., Tiss A., Rivière C., Verger R., “Methods for lipase detection and assay : a critical review”, European Journal of Lipid Science and Technology, p 133-153 (2000) Chesley L.C., “The concentrations of proteases, amylase, and lipase in certain marine fishes”, Biological Bulletin (66, 3), p 133 – 144 (1934) Chesley, L.C., “The influence of temperature upon the amylases of cold - and warm blooded animals”, Biological Bulletin (66, 3), p 330-338 (1934) CHESLEY, L C., “The validity of the viscometric and Wohlgemuth methods for the quantitative determination of amylase” Journal of Biological Chemistry, p 92-171 (1931) Edwin H Robinson, “A practical guide to nutrition, feeds, and feeding of catfish”, Thad Cochran National Warmwater Aquaculture Center, 2001 Fereidoon Shahidi and Y.V.A JanakKamil, "Enzymes from fish and aquatic invertebrates and their application in the food industry", Trends in Food Science & Technology (12), p 435-464 (2001) [23] Frank Taylor, “Flow-through pH-stat method for lipase activity”, Analytical Biochemistry Volume 148 (1), p 149-153 (1985) [24] Johnson, W A., “A proposed method for the routine valuation of diastase preparations”, Journal of the American Chemical Society, 30 (5), p 798-805 (1908) Klomklao S, Bebjakul S and Visessanguan S, “Comparative studies on proteolytic activity of splenic extract from three tuna species commonly used in Thailand”, Journal of Food Biochemistry 28, p 355-372 (2004) Lowry O H, Rosebrough N J, Farr A L & Randall R J., “Protein measurement with the Folin phenol reagent”, Journal of Biological Chemistry, p 193:265 (1951) MacDonald R P., Lefave R O., “Serum Lipase Determination with an Olive Oil Substrate Using a Three-Hour Incubation Period”, Clinical Chemistry (8), p 509-519, (1961) Lundstedt L M et al., “Induction of digestive enzymes in the Brazilian catfish (Pseudoplatystoma Coruscans)”, Comp Biochemistry and physiology Part B, (137), p 331-339 (2002) [25] [26] [27] [28] 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO [29] NW Tietz, JR Astles and DF Shuey, “Lipase activity measured in serum by a continuous-monitoring pH-Stat technique – an update”, Clinical Chemistry (35), p 1688-1693, (1989) [30] Robert E Connon, Harold Van Kley & William A Knight, Jr, “A Simple Assay Technique for Pancreatic Lipase”, Digestive Diseases (23, 5), p 472-475 (1978) [31] Ul-Haq I., Idrees S., Rajoka M.I., “Production of lipases by Rhizopus oligosporous by solid-state fermentation”, Process Biochemistry (37), p 637641 (2002) Uys W., Hecht T., “Assays on the digestive enzymes of sharptooth catfish, Clarias gariepinus (Pisces: Clariidae)”, Alquacultutre (63), p 301-313 (1987) W G Pond, Jean Twombly Snook, Deborah McNeill, W I Snyder and B R Stillings, "Pancreatic Enzyme Activities of Pigs Up to Three Weeks of Age", Journal of Animal Science (33), p.1270-1273 (1971) Một số trang web: [32] [33] [34] http://www.baocantho.com.vn/?mod=detnews&catid=72&p=&id=25074 http://www.chebien.gov.vn/index.asp?m=0201&bydate=&page=3&layID=4226 http://www.fistenet.gov.vn/details.asp?Object=7126825&news_ID=81267609 http://www.fistenet.gov.vn/details.asp?Object=1015068&News_ID=9853974 http://www.sgtt.com.vn/web/tintuc/default.aspx?cat_id=600&news_id=21595 http://www.sgtt.com.vn/web/tintuc/default.aspx?cat_id=630&news_id=21593#co ntent http://www.sgtt.com.vn/web/tintuc/default.aspx?cat_id=600&news_id=21595 http://sokhoahoccn.angiang.gov.vn/xemnoidung.asp?maidtt=1865 http://en.wikipedia.org/wiki/Digestive_enzym 95 LÝ LỊCH TRÍCH NGANG Họ tên: Lê Nguyễn Tố Quyên Ngày, tháng, năm sinh: 12/09/1984 Nơi sinh: Đồng Tháp Địa liên lạc: 13 Tỉnh lộ 854, Tân Nhuận Đông, Châu Thành, Đồng Tháp QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO (Bắt đầu từ Đại học đến nay) 2002 – 2007: Sinh viên Trường Đại học Bách khoa Tp Hồ Chí Minh Q TRÌNH CÔNG TÁC (Bắt đầu từ làm đến nay) 2007 – nay: Nhân viên Công ty IBM Việt Nam ... nội tạng cá tra - Khảo sát q trình trích ly enzyme lipase từ nội tạng cá tra - Tối ưu hóa q trình trích ly enzyme lipase từ nội tạng cá tra - Khảo sát q trình kết tủa enzyme thơ từ nội tạng cá tra. .. tiến hành nghiên cứu thu nhận hệ enzyme từ nội tạng cá tra đề số ứng dụng Nội dung luận văn gồm phần sau: - Khảo sát hoạt tính hệ enzyme thu từ nội tạng cá tra - Khảo sát q trình trích ly enzyme. .. tinh hệ enzyme từ nội tạng cá thu nhận chế phẩm enzyme lipase từ phức hệ 36 Chương 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.2 Nội dung nghiên cứu 3.2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu Nghiên cứu thực theo