Nghiên cứu một vài đặc điểm sinh học của rickettsia like bacteria (RLB) ở tôm hùm bông (panulirus ornatus fabricius, 1798)

i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của nhiều tổ chức và cá nhân. Qua đây tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: Trường Đại học Nha Trang, Khoa Nuôi trồng Thủy sản, phòng Bệnh và Môi trường của Trung tâm Giống hải sản miền Trung thuộc Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 3, phòng Công nghệ phôi của Viện công nghệ sinh học Hà Nội là những cơ quan đã giúp đỡ về mặt vật chất và kỹ thuật để tôi hoàn thành đề tài này. TS Nguyễn Chí Thuận - giáo viên hướng dẫn, người đã định hướng, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi thực hiện đề tài. Cô Nguyễn Hoàng Uyên, các anh Phạm Ngọc Long, Nguyễn Quang Vinh, Nguyễn Văn Giang, Đinh Quang Huy đã động viên và giúp đỡ tôi trong việc phân tích mẫu cũng như hoàn thành khóa luận. Và tất cả người thân, bạn bè đã luôn bên tôi, cổ vũ, động viên tinh thần để tôi có nghị lực học, vượt qua mọi khó khăn trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận. Xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, ngày 15 tháng 03 năm 2011 Học viên: Nguyễn Thị Thu Thủy ii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Mục lục ii Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt v Danh mục các bảng vi Danh mục các hình vii MỞ ĐẦU 1 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Tình hình nghiên cứu Rickettsia trên động vật thủy sản trên thế giới 3 1.1.1. Tình hình nghiên cứu Rickettsia–like organism (RLO) trên cá 3 1.1.2. Tình hình nghiên cứu RLO trên nhuyễn thể 8 1.1.3. Tình hình nghiên cứu RLO trên giáp xác 12 1.2. Tình hình nghiên cứu Rickettsia trên động vật thủy sản ở Việt Nam 16 1.3. Tổng quan về các phương pháp phát hiện RLB 18 1.3.1. Phương pháp chẩn đoán lâm sàng 18 1.3.2. Phương pháp mô bệnh học 18 1.3.3. Phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) 19 1.3.4. Phương pháp phân lập RLB 20 1.3.5. Phương pháp PCR phát hiện RLB 21 1.3.6. Một số phương pháp phân loại vi sinh vật 23 1.3.6.1. Phân loại theo phương pháp cổ điển 23 1.3.6.2. Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử 23 1.3.6.3. Tách dòng và giải trình tự gen 16S rRNA 25 Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 27 2.2. Phương pháp nghiên cứu 27 2.2.1. Phương pháp thu mẫu nghiên cứu 27 2.2.1.1 . Phương pháp thu mẫu tại hiện trường 27 2.2.1.2. Phương pháp thu mẫu trong phòng thí nghiệm 28 2.2.2. Phương pháp nuôi cấy RLB 28 iii 2.2.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái của RLB 29 2.2.4. Phương pháp PCR xác định RLB 29 2.2.4.1. Phương pháp tách chiết DNA của RLB 29 2.2.4.2. Thực hiện phản ứng PCR 30 2.2.5. Phương pháp PCR nhân đoạn gen 16S rRNA 32 2.2.6. Phương pháp làm sạch sản phẩm PCR 33 2.2.7. Phương pháp tách dòng và xác định trình tự gen 16S rRNA của RLB 34 2.2.7.1. Tách dòng gen 16S rRNA trong vector pCR TOPO 2.1 34 2.2.7.2. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt 35 2.2.7.3. Tách plasmid DNA bằng Qiagen Miniprep Kit 35 2.2.7.4. Cắt kiểm tra DNA plasmid bằng EcoRI 36 2.2.7.5. Giải trình trình tự đoạn gen 16S rRNA 37 2.2.8. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 37 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1. Kết quả thu mẫu 39 3.1.1. Mẫu tôm hùm bông 39 3.1.2. Mẫu thức ăn 41 3.1.3. Mẫu sinh vật bám xung quanh lồng nuôi tôm hùm 45 3.2. Đặc điểm hình thái và trình tự gen 16S rRNA của chủng RLB trên tôm hùm bông ở Việt Nam 46 3.2.1. Đặc điểm hình thái của chủng RLB trên tôm hùm bông ở Việt Nam 46 3.2.2. Trình tự gen 16S rRNA của chủng RLB trên tôm hùm bông ở Việt Nam 48 3.2.2.1. Tách chiết DNA tổng số 48 3.2.2.2. Kết quả nhân đoạn gen 16S rRNA của RLB bằng phương pháp PCR .48 3.2.2.3. Tinh sạch sản phẩm PCR chủng RLB1 và RLB2 49 3.2.2.4. Tách dòng gen 16S rRNA trong vector pCR TOPO 2.1 50 3.2.2.5. Xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng RLB1 52 3.3. Kết quả khảo sát sự phân bố của RLB trên tôm hùm bông và một số loại thức ăn nuôi tôm bằng phương pháp PCR 53 3.3.1. Kết quả khảo sát sự phân bố của RLB trên tôm hùm bông 53 iv 3.3.2. Kết quả khảo sát sự phân bố của RLB trên một số loại thức ăn nuôi tôm và các sinh vật bám xung quanh lồng nuôi tôm 57 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT % : Phần trăm µm : Micromet bp : Base pair DNA : Deoxyribonucleic acid FBS : fetal bovine serum g : Gam H & E : Hematoxyline và Eosin LB : Luria – Bertani M : Marker PCR : Polymerase Chain Reaction RLB : Rickettsia-like Bacteria RLO : Rickettsia-like organism RNA : Ribonucleic acid rRNA : Ribosomal ribonucleic acid SEM : Scanning electron microscopy sp : Loài chưa xác định spp : Nhiều loài chưa xác định tên SV : Sinh vật TA : Thức ăn TEM : Transmision electron microscopy TH : Tôm hùm X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indodyl- β galactosidase vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Phân tích các thành phần hóa học của tế bào theo hệ thống hóa học 24 Bảng 1.2: Các thành phần chính trong vectơ pCR TOPO 2.1 25 Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR 31 Bảng 2.2: Chu trình phản ứng PCR 31 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng PCR nhân đoạn gen 16S rRNA của RLB 33 Bảng 2.4: Chu trình phản ứng PCR nhân đoạn gen 16S rRNA của RLB 33 Bảng 2.5: Thành phần phản ứng tách dòng gen 16S rRNA bằng vector pCR TOPO 2.1 35 Bảng 3.6: Hỗn hợp phản ứng cắt EcoRI 36 Bảng 3.1: Danh sách mẫu tôm hùm bông thu theo thời gian và địa điểm nghiên cứu.39 Bảng 3.2: Số lượng mẫu thức ăn đã phân tích 43 Bảng 3.3: Số lượng mẫu sinh vật bám xung quanh lồng nuôi tôm hùm 45 Bảng 3.4: Mức độ tương đồng đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng RLB1 với một số chủng vi khuẩn khác 53 Bảng 3.5: Kết quả PCR phát hiện RLB trên tôm hùm bông 55 Bảng 3.6: Tỷ lệ cảm nhiễm của RLB trên tôm hùm bông 55 Bảng 3.7: Mức độ tương đồng đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng RLB4 với một số chủng RLB trên các đối tượng khác nhau 57 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình kính hiển vi điện tử của RLO ký sinh trên loài hàu Crassostrea rizophorae 11 Hình 1.2: Hình kính hiển vi điện tử của RLO trên ống thực quản và tuyến tiêu hóa của loài bào ngư đỏ (H. rufescens). 12 Hình 1.3: Các khuẩn lạc của RLO bên trong tế bào mô liên kết của loài cua biển C. mediterraneus. 13 Hình 1.4: Hình cua C. maenas bị bệnh sữa và hình kính hiển vi điện tử của RLO trên gan tụy của cua bị bệnh sữa 14 Hình 1.5: Hình TEM của RLB trong cơ quan lympho của tôm 16 Hình 1.6: Hình kính hiển vi điện tử của RLB ký sinh trong nguyên sinh chất của tế bào mô liên kết gan tụy của tôm hùm bị bệnh sữa. 17 Hình 1.7: Sơ đồ cấu trúc vectơ pCR TOPO 2.1 26 Hình 2.1: Sơ đồ qui trình nuôi cấy RLB 29 Hình 2.2: Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 38 Hình 3.1: Hình tôm hùm bông và máu tôm hùm bông khỏe mạnh (A); Hình tôm hùm bông và máu tôm hùm bông bị bệnh sữa (B). 41 Hình 3.2: Thức ăn tôm hùm được bán tại chợ Ba Ngòi – Cam Ranh – Khánh Hòa 42 Hình 3.3: Mẫu thức ăn thu tại chợ Xuân Thịnh – Sông Cầu – Phú Yên 42 Hình 3.4: Hình bình nuôi cấy tế bào 25cm 2 trước (A) và sau khi nuôi cấy 7 ngày (B) 46 Hình 3.5: Kết quả nuôi cấy của dịch L-15 trên môi trường MA, BHI và TCBS sau 48 giờ 46 Hình 3.6: Ảnh RLB nhuộm Gram và quan sát KHV vật kính dầu 1000x 47 Hình 3.7: Hình kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) của RLB (A) và hình chụp RLB trên kính hiển vi điện tử quét (SEM) (B) 47 Hình 3.8: Ảnh quá trình sinh sản của RLB chụp kính hiển vi điện tử quét (SEM) 47 Hình 3.9: Điện di đồ DNA mẫu RLB1 và RLB2. M: thang chuẩn; giếng 1, 2: DNA của RLB1, RLB2 48 Hình 3.10: Điện di đồ sản phẩm PCR đoạn gen 16s rRNA của RLB1 và RLB2 49 Hình 3.11: Điện di đồ sản phẩm tinh sạch của phản ứng PCR chủng RLB1 và RLB2. 49 Hình 3.12: Màu sắc khuẩn lạc sau khi biến nạp 50 viii Hình 3.13: Điện di đồ kiểm tra sản phẩm cắt Enzyme giới hạn EcoRI của các DNA plasmid 51 Hình 3.14: Điện di đồ DNA tổng số hemolymph của một số mẫu tôm hùm 53 Hình 3.15: Hình điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA của RLB trên hemolymph của 30 mẫu tôm hùm bông. 54 Hình 3.16: Kết quả điện di sản phẩm PCR trên agarose 1,5% 56 Hình 3.17: Phổ điện di DNA tổng số của các mẫu thức ăn tôm hùm. 57 Hình 3.18: Kết quả điện di sản phẩm PCR của thức ăn nuôi tôm hùm bông 58 1 MỞ ĐẦU Tôm hùm bông (Panulirus ornatus Fabricius, 1798) là một trong những loài hải đặc sản có giá trị kinh tế của Việt Nam, đặc biệt là các tỉnh miền Trung. Từ năm 1992, nghề nuôi tôm hùm lồng thương phẩm đã góp phần làm thay da đổi thịt cho các vùng ven biển thuộc các tỉnh từ Phú Yên đến Bình Thuận. Tuy vậy, một dịch bệnh mà người dân thường gọi là bệnh sữa (hay bệnh đục thân) xuất hiện vào cuối năm 2006 và bùng phát thành dịch vào tháng 8, 9 năm 2007 đã gây thiệt hại hàng trăm tỷ đồng cho người nuôi tôm. Bệnh có các dấu hiệu đặc trưng như máu và dịch tiết cơ thể có màu trắng đục như sữa, cơ của các đốt bụng chuyển từ trắng trong sang trắng đục. Ngoài ra, có một số con có thêm dấu hiệu các phần phụ và thân tôm chuyển sang màu hồng. Bệnh có thể gây chết đến 90% lượng tôm nuôi sau 3 – 7 ngày xuất hiện dấu hiệu bệnh lý. Bệnh thường xuất hiện ở tôm hùm bông 3 tháng tuổi đến 0,8 kg và cả tôm sắp thu hoạch. Hiện nay, bệnh sữa ở tôm hùm bông vẫn là một thách thức lớn đối với các nhà khoa học cũng như người nuôi tôm. Bệnh có các biểu hiện tương tự với bệnh sữa ở tôm hùm bông của Việt Nam là bệnh sữa ở tôm hùm gai Florida Keys (Panulirus argus), tuy nhiên bệnh chỉ xuất hiện ở giai đoạn juvenile. Tác nhân được xác định là một loại virus không có vỏ bọc, có dạng hình khối 20 mặt, được đặt tên là virus PaV1 [34]. Bệnh sữa cũng đã được phát hiện trên loài tôm sú (Penaeus monodon) nuôi ở Madagasca và vùng Đông Phi. Tác nhân gây bệnh được xác định là loại vi khuẩn ký sinh nội bào tựa như Rickettsia (Rickettsia-like bacteria - RLB). Kỹ thuật sinh học phân tử đã được ứng dụng để phát hiện loại vi khuẩn này [39]. Ngoài ra, bệnh sữa cũng xuất hiện trên loài cua châu Âu (Carcinus maenas) với dấu hiệu máu đục như sữa. Bệnh thường xuất hiện vào mùa hè khi nhiệt độ nước tăng cao. Tác nhân gây bệnh là một loại vi khuẩn gram (-), hình que, không nuôi cấy được trên các loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường. Kết quả phân tích 16S rRNA của vi khuẩn gây bệnh cho thấy đây là một loại vi khuẩn thuộc nhóm α-proteobacteria, bộ Ricketsiales [28]. 2 Ở Việt Nam, bệnh tôm hùm sữa là một bệnh mới và chưa có nhiều nghiên cứu về bệnh này. Theo kết quả nghiên cứu của Đỗ Thị Hòa và cộng sự (2009), tác nhân gây bệnh sữa ở tôm hùm nuôi tại các tỉnh miền Trung là một loại vi khuẩn gram (-), cong nhiều, kích thước 1,5 – 2,5 µm, ký sinh nội bào bắt buộc giống với Rickettsia (Rickettsia-like Bacteria - RLB) [2]. RLB là vi sinh vật ký sinh nội bào bắt buộc, ký sinh và nhân lên bên trong nguyên sinh chất của tế bào ký chủ. Hiện vẫn chưa nuôi cấy được RLB trên các loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn nhân tạo thông thường nên việc phát hiện chúng gặp nhiều khó khăn. Các loại thức ăn tươi sống nuôi tôm như cá, nhuyễn thể và giáp xác bị nghi ngờ là các vật chủ mang mầm bệnh. Xuất phát từ thực tế trên, bằng việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu một vài đặc điểm sinh học của Rickettsia-like Bacteria (RLB) ở tôm hùm bông (Panulirus ornatus Fabricius, 1798)”. Mục tiêu của đề tài là nhằm xác định đặc điểm hình thái, kích thước của chủng RLB ở tôm hùm bông và biết được sự phân bố của chúng trong thức ăn nuôi tôm. Nghiên cứu góp phần làm rõ hơn về tác nhân gây bệnh sữa, vật mang bệnh và đường truyền lan của bệnh sữa ở tôm hùm. Đây là việc làm mới có ý nghĩa khoa học và thực tế cần được triển khai nghiên cứu. Đề tài được thực hiện với các nội dung chính sau:  Nghiên cứu đặc điểm hình thái và trình tự gen 16S rRNA của chủng RLB trên tôm hùm bông nuôi ở Việt Nam.  Điều tra sự phân bố của RLB trên tôm hùm bông nuôi ở Việt Nam và một số loại thức ăn nuôi tôm. [...]... (Nha Trang) – Vi n Nghiên c u Nuôi tr ng th y s n 3 • Phòng công ngh phôi - Vi n Công ngh sinh h c - Hà N i 2.2 Phương pháp nghiên c u 2.2.1 Phương pháp thu m u nghiên c u 2.2.1.1 Phương pháp thu m u t i hi n trư ng - M u tôm: thu ch n l c 30 con tôm hùm bông nuôi Khánh Hòa và Phú Yên S lư ng: 20 con tôm hùm bông b b nh s a i n hình và 10 con tôm hùm bông kh e m nh + Tôm b nh s a: Máu tôm ư c l y tr c... nh trên tôm hùm n i bào tương t Rickettsia ư c i tư ng này Nghiên c u Vi t Nam là vi khu n ký sinh t tên là RLB (Rickettsia- like Bacteria) Tuy nhiên, khác v i RLB ã thông báo trư c ó trên tôm sú nuôi châu Âu b b nh s a, RLB ký sinh trên tôm hùm nuôi Madagasca và trên loài cua các t nh mi n Trung Vi t Nam có hình cong như vành trăng khuy t RLB là nhóm vi sinh v t ký sinh n i bào b t bu c, ch có th nuôi... RLB xác xu t cao hơn 1.2 Tình hình nghiên c u Rickettsia trên Nghiên c u ng v t th y s n ng v t th y s n Vi t Nam u tiên v b nh do vi khu n gi ng Rickettsia (RLB) gây ra trên Vi t Nam là trên tôm hùm (Panulirus spp.) M t d ch b nh l n tiên xu t hi n trên tôm hùm nuôi gây thi t h i g n 200 t Vi t Nam vào cu i năm 2006, u u năm 2007 ã ng cho ngư i nuôi tôm hùm hai t nh Khánh Hòa và Phú Yên D u hi u chính... y [27] tôm bi n, RLO ư c tìm th y trên tôm he hoang dã Mexico và các nư c Hawaii, tôm nuôi ông Nam Á Các loài thu c h tôm he thư ng d b nhi m 15 RLO là: các loài tôm hoang dã như Penaeus marginatus, P stylirostris, P merguiensis và tôm nuôi g m tôm th chân tr ng (P vannamei), tôm sú (P monodon) Các tri u ch ng c a tôm nhi m RLO trên cơ quan gan t y: nh không có d u hi u b nh lý rõ ràng; n ng tôm s hôn... ng ch a ch t kháng sinh v i n ng Hình 1.7: Sơ c ch t i thi u c u trúc vectơ pCR TOPO 2.1 Sau khi t o ư c dòng t bào mang o n gen, t bào ư c nhân sinh kh i tách plasmid và c trình t trên m y t ng 27 Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 2.1 - i tư ng, th i gian và a i m nghiên c u i tư ng nghiên c u: Rickettsia- like Bacteria – RLB - Th i gian nghiên c u: T 01/05/2010 - n 30/01/2011 a i m nghiên c u: + a i... thân m m hai m nh v nư c m n và 12 loài giáp xác b nhi m sinh v t ký sinh n i bào gi ng Rickettsia (Rickettsia like organism – RLO) Pháp, Canada, Nh t B n, Tây Ban Nha, Scotland, Th y i n, Singapore, Malaysia và M [29] 1.1.1 Tình hình nghiên c u Rickettsia like organism (RLO) trên cá Nghiên c u u tiên v RLO trên cá ư c thông báo vào năm 1939 Trong nghiên c u này, RLO ư c phát hi n trong t bào c a cá Tetrodon... & E 1.1.3 Tình hình nghiên c u RLO trên giáp xác B nh do các sinh v t gi ng Rickettsia (RLO) ã gây ra m t s thi t h i cho các loài giáp xác có giá tr kinh t như cua và tôm RLO trên cua Nghiên c u u tiên v RLO trên cua bi n là nghiên c u c a Bonami và Rapparado (1980) Theo k t qu nghiên c u, RLO n m trong nguyên sinh ch t c a các t bào mô liên k t c a gan t y, ru t, mang và tuy n sinh d c c a loài cua... ti n hành nghiên c u truy tìm tác nhân gây b nh K t qu nghiên c u cho th y tác nhân gây b nh s a trên tôm hùm là m t lo i vi khu n hình cong, kích thư c 1,5 – 2,5 m, b t màu gram (-), l p v ngoài màu tr ng b c, không có tiên mao, không có lông (Hình 1.6) [2] Hình 1.6: Hình kính hi n vi i n t c a RLB ký sinh trong nguyên sinh ch t c a t bào mô liên k t gan t y c a tôm hùm b b nh s a K t qu nghiên c u... vi sinh v t c m nhi m h th ng, chúng xâm nh p vào các t ch c cơ quan khác nhau như mang, tim, gan t y, ru t, d dày, m t, bi u mô dư i v …và gây b nh [2] Như v y, có th nói nghiên c u v Rickettsia gây b nh trên ng v t th y s n Vi t Nam chưa nhi u và còn khá m i m Nghiên c u v b nh tôm hùm s a c a Th Hòa và c ng s (2009) là m t nghiên c u bư c uv này cho th y cho th y tác nhân gây b nh trên tôm hùm. .. hình nghiên c u Rickettsia trên ng v t th y s n trên th gi i Rickettsia là m t nhóm vi sinh v t có kích thư c nh , s ng ký sinh n i bào b t bu c, tăng trư ng và nhân lên trong t bào ch t c a các t bào ch nhân chu n (thư ng là các t bào n i mô) Do ó Rickettsia chưa s ng ư c trong môi trư ng dinh dư ng nhân t o Rickettsia gây b nh trên c ngư i, ng v t có xương s ng và ng v t không xương s ng [16] Vi sinh . Nghiên cứu một vài đặc điểm sinh học của Rickettsia-like Bacteria (RLB) ở tôm hùm bông (Panulirus ornatus Fabricius, 1798) . Mục tiêu của đề tài là nhằm xác định đặc điểm hình thái, kích thước của. sữa ở tôm hùm bông vẫn là một thách thức lớn đối với các nhà khoa học cũng như người nuôi tôm. Bệnh có các biểu hiện tương tự với bệnh sữa ở tôm hùm bông của Việt Nam là bệnh sữa ở tôm hùm. PCR của thức ăn nuôi tôm hùm bông 58 1 MỞ ĐẦU Tôm hùm bông (Panulirus ornatus Fabricius, 1798) là một trong những loài hải đặc sản có giá trị kinh tế của Việt Nam, đặc biệt là các tỉnh