1.3.6.1. Phân loại theo phương pháp cổ điển
Phương pháp phân loại cổ điển dựa trên các đặc điểm về hình thái, sinh lí-sinh hóa.
Các đặc điểm hình thái như kích thước, hình dạng, màu sắc của khuẩn lạc, hình dạng, kích cỡ của tế bào vi sinh vật; cách sắp xếp của tế bào (đơn, kép hay dạng chùm, dạng chuỗi ...); khả năng bắt màu khi nhuộm Gram; các đặc điểm vi cấu trúc như có tiên mao, tiêm mao hay không, số lượng của tiên mao, tiêm mao, cách thức di chuyển của tế bào; hình dạng và vị trí của các cơ quan trong tế bào ...
Các đặc điểm về sinh lý và trao đổi chất như nguồn năng lượng, nguồn cacbon và nitơ mà sinh vật sử dụng, kiểu dinh dưỡng, các sản phẩm lên men, giới hạn về nhiệt độ và nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng và phát triển; dải pH và pH tối thích cho sinh trưởng, các sản phẩm trao đổi thứ cấp ...
Khóa phân loại vi khuẩn của Bergey là ví dụ điển hình của phương pháp phân loại vi sinh vật theo phương pháp truyền thống, khóa phân loại này hiện vẫn đang được cập nhật và được nhiều nhà vi sinh vật sử dụng.
1.3.6.2. Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử
Phân loại bằng sinh học phân tử là phương pháp mới nhưng có độ chuẩn xác cao. Phương pháp này có thể phát hiện mô tả và giải thích tính đa dạng sinh học ở mức phân tử và quan hệ giữa các loài và trong phạm vi loài [1].
Bảng 1.1: Phân tích các thành phần hóa học của tế bào theo hệ thống hóa học Thành phần tế bào Phương pháp phân tích Phạm vi Phân loại Thành phần bazơ(%G+C) Chi
Biến tính DNA:DNA Loài
Các phần DNA được cắt bằng enzyme giới hạn DNA
nhiễm sắc thể
Đa hình chiều dài các đoạn giới hạn của RNA riboxome
Loài và dưới loài
Trình tự nucleotid RNA riboxom
Lai DNA: rRNA
Loài, chi và Trên chi
Trình tự amino acid Loài, chi và trên chi
So sánh bằng phản ứng huyết thanh
Các kiểu điện di
Loài và chi Protein
Điện di enzyme đa vị trí Các dòng trong loài Cấu trúc peptidoglycan Polysaccharid Thành tế bào Acid teichoic Loài và chi Acid béo Lipid phân cực Acid mycolic Màng Isoprenoid quinones Loài và chi
Ngày nay phương pháp phân loại vi khuẩn bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA đang được áp dụng phổ biến. Việc nghiên cứu phân tử rRNA là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ, tiến hóa của các vi sinh vật, vì rRNA có mặt ở tất cả các loại vi sinh vật, có khả năng xác định, có tính bảo thủ cao, chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm vi sinh vật. Tuy nhiên, dựa
vào sự khác nhau này, người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại vi sinh vật.
Trong ba gen mã hóa rRNA của vi khuẩn 5S rRNA, 16S rRNA và 23S rRNA thì gen 16S rRNA là phù hợp nhất cho việc nghiên cứu phân loại hiện nay. Gen mã hóa 5S rRNA có kích thước khoảng 120 nucleotid, do có kích thước nhỏ nên thông tin chứa đựng ít do đó khó phân biệt được chính xác sự khác nhau giữa chi, giữa loài và trong loài của vi sinh vật cũng như vị trí phân loại của chúng. Gen mã hóa 23S rRNA có kích thước khoảng 2900 bp quá lớn cho nên không thuận lợi cho tách dòng, xác định trình tự và phân loại vi khuẩn. Gen mã hóa 16S rRNA có kích thước khoảng 1500 nucleotid vừa đủ để phân loại chi tiết giữa các chủng vi sinh vật không gây khó khăn trong các bước xác định trình tự gen và được ưu tiên chọn lựa trong phân loại vi khuẩn.
Cấu trúc của gen mã hóa 16S đã được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ và đã thiết kế rất nhiều các cặp mồi chung dùng cho nhiều nhóm vi khuẩn cũng như các cặp mồi đặc hiệu riêng cho các chi và loài. Đây là một thuận lợi lớn cho các nghiên cứu phân loại vi khuẩn và xạ khuẩn dựa trên gen mã hóa 16S rRNA [35].
1.3.6.3. Tách dòng và giải trình tự gen 16S rRNA
Để tách dòng và xác định trình tự gen, thường sử dụng một số loại vector, trong đó vectơ pCR TOPO 2.1 được sử dụng phổ biến. Đây là một trong những vectơ có hiệu quả rất cao. Vectơ pCR TOPO 2.1 có kích thước 3,9 Kb (hình 1.7). Các thành phần chính trong vectơ được thể hiện ở bảng 1.2.
Bảng 1.2: Các thành phần chính trong vectơ pCR TOPO 2.1
Thành phần Vị trí Gen lac Z 1-57 Vị trí tạo dòng 269-381 T7 promotor 388-407 F1 ori 572-986 Gen kháng Kanamycin 987-2114 Gen kháng Ampixilin 2133-2992 Col E1 ori 3182-3765
Vectơ pCR TOPO 2.1 có mang operon Lac. Tại vùng ranh giới giữa promotor của operon này và gen cấu trúc mã hóa cho enzym β- galactosidaza có vùng cắt đa vị với 17 vị trí cắt cho các enzym giới hạn EcoRI, HindIII, NsiI, KpnI, SacI, BamHI, SpeI, BstXI, EcoRV, NotI, AvaI, PaeRI, XhoI, XbaI, ApaI. Trong đó EcoRI và BstXI
có 2 vị trí cắt còn các enzym khác chỉ có một vị trí cắt. Với vị trí của vùng cắt đa vị như vậy, enzym β-galactosidaza có thể được tạo ra (nếu vectơ không được dính đoạn DNA ngoại lai) hoặc không được tạo ra (nếu vectơ có dính đoạn DNA ngoại lai). Dựa vào dấu chuẩn đó ta có thể chọn lọc được các virus mang vectơ tái tổ hợp.
Mặt khác, vectơ pCR TOPO 2.1 cũng mang gen kháng Ampixilin và Kanamycin do đó ta cũng có thể chọn lọc sơ bộ các tế bào biến nạp trên môi trường chứa chất kháng sinh với nồng độ ức chế tối thiểu.
Hình 1.7: Sơ đồ cấu trúc vectơ pCR TOPO 2.1
Sau khi tạo được dòng tế bào mang đoạn gen, tế bào được nhân sinh khối tách plasmid và đọc trình tự trên mấy tự động.
Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Rickettsia-like Bacteria – RLB.
- Thời gian nghiên cứu: Từ 01/05/2010 đến 30/01/2011.
- Địa điểm nghiên cứu:
+ Địa điểm thu mẫu: Khánh Hòa, Phú Yên.
+ Địa điểm phân tích mẫu:
• Trung tâm Quốc gia giống hải sản miền Trung (Nha Trang) – Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản 3.
• Phòng công nghệ phôi - Viện Công nghệ sinh học - Hà Nội.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp thu mẫu nghiên cứu 2.2.1.1. Phương pháp thu mẫu tại hiện trường 2.2.1.1. Phương pháp thu mẫu tại hiện trường
- Mẫu tôm: thu chọn lọc 30 con tôm hùm bông nuôi ở Khánh Hòa và Phú Yên. Số lượng: 20 con tôm hùm bông bị bệnh sữa điển hình và 10 con tôm hùm bông khỏe mạnh.
+ Tôm bệnh sữa: Máu tôm được lấy trực tiếp tại nơi lấy mẫu. Cách lấy máu tôm: dùng kim tiêm loại 1 ml đâm vào gốc chân bò thứ 5 của tôm để lấy máu từ động mạch tôm hoặc lấy máu trực tiếp từ tim cho vào eppendorf vô trùng. Mẫu máu và mẫu tôm được chứa trong các túi vô trùng riêng biệt có nhãn ghi rõ ký hiệu mẫu, ngày lấy mẫu, địa điểm lấy mẫu... Mẫu được bảo quản lạnh trong thùng xốp đá rồi vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm.
+ Tôm khỏe: Vận chuyển sống về phòng thí nghiệm trong thùng xốp có sục khí.
- Mẫu thức ăn: thu các loại thức ăn thường được sử dụng cho nuôi tôm hùm bông thuộc ba nhóm đối tượng chính: giáp xác, nhuyễn thể, cá. Số lượng: 45 mẫu. Trong đó, số lượng mẫu mỗi nhóm gồm: 15 mẫu cá, 10 mẫu nhuyễn thể, 20 mẫu giáp xác.
- Mẫu sinh vật bám xung quanh lồng nuôi: thu ngẫu nhiên mẫu cua và hàu bám xung quanh lồng nuôi. Số lượng mẫu là 6 mẫu, trong đó có 3 mẫu cua và 3 mẫu hàu.
Mẫu thức ăn và mẫu sinh vật bám xung quanh lồng nuôi được thu và cho vào các túi nilon riêng biệt. Trên mỗi túi có nhãn ghi đầy đủ các thông tin về mẫu như ngày, địa điểm thu mẫu, đặc điểm mẫu... để tránh nhầm lẫn. Bảo quản trong thùng xốp lạnh và vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm.
2.2.1.2. Phương pháp thu mẫu trong phòng thí nghiệm
- Thu mẫu hemolymph tôm làm nguyên liệu cho tách chiết DNA tổng số: Lấy 100 µl hemolymph tôm cho vào eppendorf vô trùng.
- Thu mẫu thức ăn và sinh vật bám xung quanh lồng nuôi làm nguyên liệu cho tách chiết DNA tổng số:
+ Mẫu thức ăn sau khi vận chuyển về phòng thí nghiệm, một phần được bảo quản trong tủ âm (- 200C), một phần được phân loại, chụp ảnh và thu mẫu để tách chiết DNA tổng số làm nguyên liệu cho phản ứng PCR phát hiện RLB.
+ Rửa sạch bề mặt cơ thể mẫu bằng nước cất vô trùng. Dùng dụng cụ vô trùng tách lấy gan, thận (cá); gan tụy, màng áo và tuyến tiêu hóa (nhuyễn thể); mang, gan tụy (giáp xác). Mỗi mẫu khoảng 10 - 20 cá thể, nghiền đồng nhất sau đó lấy khoảng 0,1 g để tách DNA.
2.2.2. Phương pháp nuôi cấy RLB
Để tìm hiểu hình thái của RLB, cần phải tách được RLB ra khỏi dung dịch gồm nhiều nhóm vi khuẩn khác. Môi trường nuôi cấy tế bào Leibovitz L-15 được chọn làm môi trường nuôi cấy. Qua một số thử nghiệm, môi trường L-15 có bổ sung thêm NaCL 30 ppt, FBS 10%, 1% kháng sinh (penicillin và streptomycin), pH=7,5 là môi trường thích hợp nhất để nuôi cấy RLB.
Phương pháp nuôi cấy RLB trên môi trường L-15: lấy 500 µl mẫu hemolymph tôm hùm bị bệnh sữa cho vào eppendorf 1,5 ml; bổ sung 500 µl môi trường L-15; spin trong 5 phút, bỏ phần tủa tế bào máu; thu dịch chuyển vào trong bình nuôi tế bào 25cm2 với 10ml môi trường L-15, dịch đưa vào theo tỷ lệ 2%; nuôi ở 280C trong 72 giờ.
Dịch nuôi thu ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ tủa (vi khuẩn khác). Phần dịch nổi chứa RLB (tế bào có nhiều không bào nên có tỷ trọng nhẹ) ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Thu tủa hòa trong PBS (phosphate buffer saline), cấy
lên các môi trường agar dinh dưỡng: BHI, MA và môi trường TCBS, nuôi 48 - 96 giờ để kiểm tra sự tồn tại của các vi khuẩn khác. Nếu sau khi kiểm tra thấy không có mặt của các vi khuẩn khác, dịch ly tâm này là sinh khối RLB thu được.
Sơ đồ qui trình nuôi cấy RLB như sau:
Hình 2.1: Sơ đồ qui trình nuôi cấy RLB
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái của RLB
Đặc điểm hình thái, kích thước của RLB được xác định bằng cách quan sát trên kính hiển vi quang học (vật kính 1000x), kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và kính hiển vi điện tử quét (SEM).
Phương pháp kính hiển vi quang học: mẫu hemolymph của tôm bệnh và dịch nuôi cấy trên L-15 được nhuộm gram (theo bộ thuốc nhuộm gram của công ty Nam Khoa) và quan sát, chụp ảnh trên kính hiển vi quang học (vật kính 1000x).
Phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), kính hiển vi điện tử quét (SEM): mẫu hemolymph của tôm bệnh và dịch nuôi cấy trên L-15 được gửi sang phòng Kính Hiển vi Điện tử - Viện Vệ sinh Dịch tể Trung ương để chụp ảnh và phân tích.
2.2.4. Phương pháp PCR xác định RLB
2.2.4.1. Phương pháp tách chiết DNA của RLB
DNA trong hệ gen của RLB được chiết xuất để làm nguyên liệu cho giải trình tự gen và làm khuôn cho phản ứng PCR nhân đoạn gen cần nghiên cứu. DNA được tách theo kit Genomic DNA Purification Kit của hãng Fermentas. Trình tự tiến hành
Mẫu máu tôm Spin 5 phút để thu dịch Nuôi trong L-15 Ly tâm bỏ tủa Tách DNA tổng số Mẫu TH39
như sau (theo quy trình chỉ dẫn của hãng):
- Lấy mẫu vào ống eppendorf và nghiền kỹ bằng chày nghiền.
- Thêm 200 µl TE 1X, tiếp tục nghiền sau đó trộn đều, tránh tạo bọt.
- Thêm 400 µl dung dịch Lysis và ủ ở 65 0C trong 10 phút.
- Thêm 600 µl dung dịch chloroform vào ống đã ủ, lắc nhẹ vài lần. Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 3 phút.
- Hút toàn bộ dịch trên sang ống mới và thêm 800 µl dung dịch tủa DNA (720 µl dung dịch H2O khử ion + 80 µl dung dịch Supplied 10X). Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
- Ly tâm, loại dịch nổi. Hoà tủa DNA trong 100 µl dung dịch NaCl 1,2 M. Thêm 2 µl RNAse 10 mg/ml, ủ 370C trong 1 giờ.
- Thêm 300 µl cồn tuyệt đối vào ống và để -20 0C trong 3 giờ hoặc qua đêm.
- Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút, thu tủa. Rửa tủa hai lần bằng cồn 700:
+ Thêm 500 µl cồn 700, trộn đều
+ Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút
+ Làm khô DNA bằng máy hút chân không hoặc làm khô tự nhiên trong bốc sạch.
- Hoà tủa DNA trong 30-100 µl TE 1X, kiểm tra độ sạch và xác định hàm lượng DNA bằng đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 280 nm và 260 nm và điện di trên gel agarose 1%.
2.2.4.2. Thực hiện phản ứng PCR
Trình tự mồi: sử dụng cặp mồi 254f và 254r cho phát hiện RLB ở tôm hùm bông bệnh sữa MHD-SL theo khuyến cáo của OIE 2010. Trình tự của mồi như sau:
254F: 5’-CGA-GGA-CCA-GAG-ATG-GAC-CTT-3’
Thành phần phản ứng và chương trình chạy PCR Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nước cất khử ion 14.5 2 Buffer PCR KCl 10X 2.5 3 MgCl2 25mM 1.5 4 dNTPs 2mM 2.5 5 Mồi xuôi 254F 10mM 0.5 6 Mồi ngược 254R 10mM 0.5
7 Taq polymerase 1u/µ 1
8 DNA 2 Tổng 25 Bảng 2.2: Chu trình phản ứng PCR Bước Phản ứng Nhiệt độ (OC) Thời gian Chu Kỳ 1 Biến tính 94 5 phút 1 2 Biến tính 94 20 giây 3 Gắn mồi 64 30 giây
4 Kéo dài chuỗi 72 20 giây
30
5 Hoàn tất kéo dài 72 5 phút 1 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
Điện di
Điện di là một kỹ thuật rất quan trọng trong phản ứng PCR để làm cho các đoạn acid nucleic hiển thị trực tiếp dưới tác dụng của tia cực tím. Phương pháp này dựa vào đặc tính là các phân tử acid nucleic ở pH trung tính chúng tích điện âm nhờ các nhóm phosphat nằm trên khung phosphodieste của các acid nucleic. Khi đặt gel (đã cho sản phẩm PCR vào các giếng) trong điện trường, các acid nucleic sẽ chuyển dịch từ cực
âm về cực dương, các phân tử có kích thước (phân tử lượng) nhỏ sẽ chuyển dịch nhanh, các phân tử có kích thước lớn sẽ chuyển dịch chậm hơn.
Các bước tiến hành:
- Chuẩn bị thạch agarose 1% (0.8%): cân 1g (0.8g) agarose cho vào chai thủy tinh chịu nhiệt với 100 ml đệm điện di TAE 1x. Đun trong lò vi sóng cho tới khi gel chảy hoàn toàn trong suốt (không có bọt khí). Để nguội tới nhiệt độ 500C sau đó đổ gel vào khuôn có gài sẵn các lược để tạo giếng (gel có độ dày 2-3 mm). Sau khi gel đông (khoảng 30 phút ở nhiệt độ phòng) cẩn thận rút lược ra và có thể dùng để điện di (lưu ý: không để gel ở nhiệt độ phòng quá 4 giờ). Gel sau khi chuẩn bị phải ngâm chìm trong dung dịch đệm điện di TAE 1x.
- Trộn đều 5 µl sản phẩm PCR với 1 µl chỉ thị màu loading dye blue trên các khuôn bên ngoài rồi cho vào các giếng trên gel.
- Tra 4 – 6 µl DNA Marker vào giếng thạch khác để tạo thang chuẩn.
- Chạy điện di ở hiệu điện thế 100V trong vòng 30 – 40 phút.
- Nhuộm bản gel bằng Ethidium bromide (5 – 15 phút), rửa lại bằng nước rồi cho gel vào máy tử ngoại để đọc kết quả.
Đọc kết quả
Sau khi nhuộm với Ethidium bromide, lấy gel cho vào máy tử ngoại đọc kết quả (so sánh với đối chứng và ladder).
2.2.5. Phương pháp PCR nhân đoạn gen 16S rRNA
Đoạn gen 16S rRNA của mẫu RLB1 và RLB2 được nhân lên nhờ phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27f mồi chung cho vi khuẩn và mồi 254r đặc hiệu cho RLB (theo OIE khuyến cáo) và DNA tổng số của mẫu RLB1, RLB2 làm khuôn.
Trình tự cặp mồi
27f: 5’ - AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG - 3’
Thành phần và chu trình phản ứng
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng PCR nhân đoạn gen 16S rRNA của RLB