Trước khi đem đi giải trình tự, sản phẩm PCR được làm sạch bằng bộ Kit Bioneer. Các bước làm sạch như sau:
- Điện di các mẫu cần làm sạch.
- Nhuộm bản gel, soi dưới đèn UV, cắt băng DNA với kích thước 1200 bp trên gel. Cân gel và cho vào ống eppendorf. Thêm dung dịch GB buffer với tỉ lệ 5 VGB: 1 Vgel (500 µl GB ≈ 100 mg gel).
- Ủ ở 600C trong 10 phút (hoặc cho đến khi gel tan hết).
- Sau khi tan hết, dung dịch sẽ có màu vàng. Nếu dung dịch có màu cam hoặc tím, cần bổ sung thêm 10 µl dung dịch CH3COONa 3M và trộn đều, dung dịch sẽ chuyển thành màu vàng.
- Đặt cột có màng lọc vào ống 2 ml.
- Hút toàn bộ dịch DNA cho vào cột (chú ý lượng lớn nhất cho vào cột không quá 750 µl, nếu dịch lớn hơn thì phải làm thêm 1 lần nữa), ly tâm 10.000 vòng/phút trong 2 phút.
- Bỏ dịch li tâm bên dưới, chèn cột lại.
- Thêm 500 µl GB vào cột, ly tâm lại như trên.
- Bỏ dịch, rửa cột 2 lần bằng dung dịch WB buffer (đã được pha với cồn tuyệt đối tỷ lệ 1/5 lần) mỗi lần 500 µl. Để trong 5 phút và li tâm lại như trên.
- Nhấc cột ra và đặt vào ống eppendorf 1,5ml mới.
- Thêm 30-50 µl dung dịch đệm EL. Để ở nhiệt độ phòng 5-10 phút, li tâm 13.000 vòng/phút trong 2 phút, chuyển dịch li tâm sang ống eppendorf 1,5 mới khác, giữ ở -200C.
Sau khi làm sạch, sản phẩm PCR được điện di để kiểm tra lại trên gel agarose 1,5%, đệm TAE 1X.
Sản phẩm PCR sau khi làm sạch có thể sử dụng để đọc trình tự trực tiếp.
2.2.7. Phương pháp tách dòng và xác định trình tự gen 16S rRNA của RLB 2.2.7.1. Tách dòng gen 16S rRNA trong vector pCR TOPO 2.1