Được phát minh vào năm 1985 và được thừa nhận chính thức năm 1993 qua giải thưởng Nobel y dược và sinh lý cho Kary Mullis - người phát minh ra nó. PCR hiện đang được ứng dụng rộng rãi tại Việt Nam.
Nguyên lý của phản ứng PCR
PCR là một phản ứng phụ thuộc nhiệt độ, sử dụng đặc điểm của quá trình sao chép DNA với sự tham gia của enzyme DNA – polymerase chịu nhiệt, có hai đoạn DNA làm mồi và dùng các đoạn DNA mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi bổ sung với nó. Vì vậy, để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA cần cung cấp đoạn mồi oligonucleotit (có độ dài từ 6 – 30 nucleotit). Đoạn này gắn kết với DNA khuôn tại điểm khởi đầu sao chép và được enzyme DNA – polymerase điều khiển tổng hợp một đoạn DNA đặc thù. Các sợi DNA mạch đơn làm khuôn được tạo ra theo cách đơn giản là nâng nhiệt độ lên trên 90°C (92 – 98°C) cho mạch xoắn kép bung ra [3].
Cả hai sợi DNA đều được dùng làm khuôn cho quá trình tổng hợp nếu các đoạn mồi (primer) được cung cấp để bám vào vị trí tương ứng cho cả hai sợi. Trong kỹ thuật PCR, các đoạn mồi được chọn nằm ở hai đầu đoạn DNA cần nhân lên sao cho các sợi DNA tổng hợp mới được bắt đầu tại vị trí bám của mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia, cho sản phẩm có độ dài giới hạn giữa hai đoạn mồi này. Độ dài sản phẩm của PCR có thể vài trăm cho đến hàng ngàn, thậm chí hàng chục ngàn cặp nucleotit. Như vậy, sau mỗi chu kỳ các điểm bám cho mồi lại xuất hiện trên mỗi sợi DNA mới được tổng hợp. Hỗn hợp phản ứng lại được nâng nhiệt độ thích hợp sao cho các sợi ban đầu tách khỏi sợi mới được tổng hợp, các sợi này sau đó còn được dùng tiếp cho chu kỳ tiếp theo bao gồm các bước gắn mồi, tổng hợp DNA và tách rời các đoạn [3].
Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ của phản ứng, tính theo lý thuyết ta sẽ có 2n bản sao các phân tử DNA mạch kép nằm giữa hai đoạn mồi. Đó là một đặc điểm quan trọng của kỹ thuật.
PCR dẫn đến kết quả là một đoạn DNA định trước được nhân lên với một lượng rất lớn. Ví dụ sau 30 chu kỳ số lượng bản sao DNA của PCR sẽ là 1.073.741.824 [3].
Cách tiến hành phản ứng PCR
PCR là một kỹ thuật phòng thí nghiệm rất đa năng và được ứng dụng rất rộng rãi. Vật liệu khởi đầu cho PCR là DNA có chứa đoạn gen mà ta cần nhân lên gọi là khuôn. Các đoạn mồi dùng trong phản ứng sẽ xác định vị trí bám để thực hiện phản ứng. Hàm lượng DNA làm khuôn cần rất nhỏ. Trong thí nghiệm bình thường ở phòng thí nghiệm chỉ cần 100 nanogram (ng) DNA làm khuôn là đủ. Tuy nhiên trong nhiều trường hợp, phản ứng PCR có thể thực hiện thành công chỉ từ một phân tử DNA riêng lẻ, tức là chỉ cần DNA làm khuôn từ duy nhất một tế bào cơ thể [3].
Thành phần chủ yếu của phản ứng PCR bao gồm:
- DNA làm khuôn.
- Hai đoạn mồi để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp DNA.
- Enzyme chịu nhiệt DNA – polymerase (hiện nay được dùng phổ biến nhất là taq – Polymerase, chiết xuất từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus).
- Hỗn hợp của tất cả bốn tiền chất deoxynucleotit ở dạng (dNTP).
- Môi trường đệm cung cấp ion Magie (Mg++).
- Nước tinh khiết (không có DNAaza, RNAaza,…).
Dung tích tổng số cho phản ứng PCR thông thường là 50µl hoặc 25µl.
PCR là chuỗi phản ứng gồm nhiều chu kỳ lặp đi lặp lại, mỗi chu kỳ gồm có ba bước:
- Bung liên kết của khuôn DNA (denaturation): Được thực hiện ở nhiệt độ 92 – 95°C trong vài giây đến vài phút. Tại nhiệt độ này, các phân tử DNA mạch kép sẽ bị tách tạo nên các sợi đơn dùng để làm khuôn cho các đoạn mồi bám vào và enzyme Taq – polymerase xúc tác tổng hợp.
- Mồi bám (annealing): Sau bước một, ngay lập tức nhiệt độ được hạ xuống 36 – 65°C để các đoạn mồi bám vào với các trình tự bổ sung tương ứng trên các phân tử DNA làm khuôn.
- Tổng hợp (hay còn gọi là kéo dài – extension): Nhiệt độ ngay lập tức được nâng lên 68 – 72°C trong vài chục giây đến vài chục phút để các sợi DNA vừa được tổng hợp xoắn vào nhau tạo nên DNA mạch kép, chính là sản phẩm của PCR [3].
Ứng dụng
Phương pháp PCR đã được ứng dụng bởi Fiona và cộng sự (2007) để phát hiện RLB gây bệnh sữa trên loài cua châu Âu. DNA làm nguyên liệu cho phản ứng PCR được tách chiết từ khoảng 300 µl hemolymph cua bị bệnh sữa sử dụng bộ kít GenElute bacterial genomic DNA kit. Cặp mồi 27f (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'), 1387r (5'-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3') được sử dụng trong phản ứng này. Bằng phản ứng PCR, khuếch đại và giải trình tự đoạn gen 16S rRNA và sử dụng kỹ thuật lai, nhóm nghiên cứu đã xác định tác nhân gây bệnh sữa trên loài cua này thuộc nhóm
-proteobacteria, bộ Rickettsiales [28].