3.2.2.1. Tách chiết DNA tổng số
Từ mẫu dịch thu được trên L-15, DNA được tách theo các bước như đã trình bày ở phần phương pháp. Sản phẩm DNA được điện di trên gel agarose 1%. Kết quả trên điện di đồ cho thấy DNA tổng số của RLB1 và RLB2 có chất lượng tốt đảm bảo cho chúng tôi tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.9: Điện di đồ DNA mẫu RLB1 và RLB2. M: thang chuẩn; giếng 1, 2: DNA của RLB1, RLB2
3.2.2.2. Kết quả nhân đoạn gen 16S rRNA của RLB bằng phương pháp PCR
DNA tổng số được thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại đoạn gen 16S rRNA của RLB1 và RLB2 sử dụng cặp mồi (27f; 254r) với thành phần phản ứng và chu trình nhiệt giống như đã trình bày ở phần phương pháp. Sản phẩn PCR được điện di trên gel agarose 1%.
Quan sát trên điện di đồ (hình 3.9) chúng tôi thấy sản phẩm PCR có kích thước khoảng 1200 bp, kích thước này là đúng với tính toán lý thuyết của chúng tôi. Vì vậy phản ứng PCR đã nhân lên rất đặc hiệu với đoạn gen 16S rRNA của RLB1 và RLB2 có trong dịch nuôi máu tôm hùm.
Hình 3.10: Điện di đồ sản phẩm PCR đoạn gen 16s rRNA của RLB1 và RLB2
Giếng 1: thang DNA chuẩn; giếng 2, 3: sản phẩm khuếch đại gen 16s rRNA của RLB1, RLB2; P+: chứng +; P-: chứng -
Trên điện di đồ sản phẩm PCR có băng vạch rõ nét điều này chứng tỏ sản phẩm của phản ứng PCR có chất lượng tốt và phản ứng đặc hiệu, sản phẩm có thể làm sạch để thực hiện tách dòng và đọc trình tự.
3.2.2.3. Tinh sạch sản phẩm PCR chủng RLB1 và RLB2
Sản phẩm PCR của RLB1 và RLB2 được tiến hành làm sạch theo các bước như đã trình bày ở phần phương pháp. Kết quả được thể hiện trên hình 3.11.
Hình 3.11: Điện di đồ sản phẩm tinh sạch của phản ứng PCR chủng RLB1 và RLB2.
Giếng 1: thang DNA chuẩn. Giếng 2,3: sản phẩm PCR được làm sạch của chủng RLB1, RLB2
Quan sát điện di đồ chúng tôi thấy sản phẩm của phản ứng PCR được tinh sạch có băng gọn, chất lượng tốt có kích thước khoảng 1200bp. Như vậy sản phẩm tinh sạch đã đáp ứng được chất lượng để thực hiện các bước tiếp theo. Vì điều kiện thời
M RLB1 RLB2 P+ P-
gian không cho phép nên trong khuôn khổ luận án này chúng tôi chỉ tiến hành tách dòng và đọc trình tự 1 chủng RLB1.
3.2.2.4. Tách dòng gen 16S rRNA trong vector pCR TOPO 2.1
Sản phẩm PCR được gắn vào vector pCR TOPO 2.1 và vector tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào DH5α- T1 (tế bào khả biến) bằng phương pháp sốc nhiệt như đã trình bày ở phần phương pháp. Sau khi biến nạp, các thể biến nạp được cấy trải trên môi trường chọn lọc chứa Kanamycin, chất cảm ứng IPTG và chất chỉ thị màu X-gal. Trên môi trường chọn lọc này, theo lý thuyết thì các khuẩn lạc E. coli mang vectơ tái tổ hợp sẽ có màu trắng trong khi đó các khuẩn lạc mang vectơ pCR TOPO 2.1 không được gắn đoạn DNA ngoại lai sẽ có màu xanh. Kết quả biến nạp như trên hình 3.12.
Hình 3.12: Màu sắc khuẩn lạc sau khi biến nạp
Tất cả các khuẩn lạc phát triển được trên môi trường có Kanamycin đều là chủng E. coli mang plasmid. Những khuẩn lạc xanh xuất hiện là do vectơ pCR TOPO 2.1 mang lac operon hoạt động bình thường, khi có chất cảm ứng IPTG, operon sẽ tổng hợp enzym β-galactosidaza. Enzym này phân hủy cơ chất X-gal thành dẫn xuất indol, dẫn xuất này ngoài môi trường sẽ bị oxy hóa thành hợp chất có màu xanh. Khuẩn lạc có màu trắng có thể là do mang plasmid có lac operon không hoạt động. Lac operon bị bất hoạt là do nó bị thay đổi cấu trúc, bị đứt đoạn hay bị thay đổi trình tự hoặc có thể do đoạn DNA 16S rRNA của chủng RLB1 gắn vào giữa vùng promotor của operon và gen cấu trúc lac Z. Trong trường hợp này, lac promotor không thể điều khiển gen cấu trúc phiên mã nên không có sự dịch mã thành enzym. Enzym β- galactosidaza không được tổng hợp, cho nên mặc dù có X-gal trong môi trường nhưng cơ chất này không bị phân hủy, không tạo nên dẫn xuất indol và khuẩn lạc có màu trắng.
Để chọn lọc dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen 16S rRNA của chủng RLB1 cần tách dòng, chúng tôi chọn sáu khuẩn lạc trắng cấy vào sáu ống, mỗi ống chứa 5 ml môi trường LB lỏng có bổ sung Kanamycin và X-gal, nuôi qua đêm ở 37oC có lắc. DNA plasmid được tiến hành tách chiết theo các bước như đã trình bày ở phần phương pháp.
Plasmid thu được ở trên được cắt bằng EcoRI nhằm khẳng định chắc chắn được đoạn gen mong muốn (đoạn 1200 bp của chủng RLB1) có được gắn vào vectơ pCR TOPO 2.1 hay không.
Hỗn hợp được ủ ở 37oC trong 2 giờ. Sau đó điện di kiểm tra. Theo lý thuyết khi plasmid tái tổ hợp cắt bằng EcoRI sẽ thu đuợc hai băng, một băng khoảng 3,9 Kb là vectơ pCR TOPO 2.1, băng thứ hai khoảng 1200 bp là đoạn gen 16S rRNA cần tách dòng. Kết quả cắt EcoRI được thể hiện trên hình 3.13.
Hình 3.13: Điện di đồ kiểm tra sản phẩm cắt Enzyme giới hạn EcoRI của các DNA plasmid. M: thang chuẩn, Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6: sản phẩm cắt bằng Enzyme giới hạn lần lượt của plasmid 1, 2, 3, 4, 5, 6.
Trên điện di đồ chúng tôi thấy, sản phẩm cắt DNA plasmid xuất hiện ở các giếng 1, 2, 3, 4, 6 đều rất rõ nét, giếng số 5 không có DNA bị cắt bởi enzyme. Tuy nhiên, trên điện di đồ kích thước đoạn DNA 16S rRNA chỉ khoảng 600 bp mà theo tính toán lý thuyết thì đoạn DNA được gắn vào vector có kích thước là 1200 bp. Để giải thích cho điều này chúng tôi giả thuyết trên đoạn gen 16S rRNA của chủng RLB1 có điểm cắt của enzyme EcoRI ở khoảng giữa của đoạn 16S rRNA.
3.2.2.5. Xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng RLB1
Dòng vi khuẩn mang DNA plasmid có gen mong muốn đã được tách DNA plasmid và làm sạch sản phẩm. Sau đó, DNA plasmid được xác định trình tự nucleotide theo phương pháp của Sanger. Sau khi xử lý số liệu trình tự chủng RLB1 như sau:
AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG AACGAACGCT GGCGGCAGGC CTAACACATG CAAGTCGAAC GATCTCTTCG GAGAGAGTGG CAGACGGGTG AGTAACGCGT GGGAACCTAC CTGGTGGTAC GGAATAACGC AGGGAAACTT GTGCTAATAC CGTATAAGCC CTTAGGGGGA AAGATTTATC GCCATTGAAT GGGCCCGCGT TGGATTAGCT TGTTGGTGGG GTAATGGCCT ACCAAGGCGA CGATCCATAG CTGGTCTGAG AGGATGATCA GCCACACTGG GACTGAGACA CGGCCCAGAC TCCTACGGGA GGCAGCAGTG AGGAATATTG GACAATGGGG GAAACCCTGA TCCAGCCATG CCGCGTGAGT GATGAAGGCC TTAGGGTTGT AAAGCTCTTT CACCGGCGAA GATAATGACG GTAGCCGGAG AAGAAGCCCC GGCTAACTTC GTGCCAGCAG CCGCGGTAAT ACGAAGGGGG CTAGCGTTGT TCGGAATCAC TGGGCGTAAA GCACACGTAG GCGGACTGTT TAGTCGGGGG TGAAATCCTG AGGCTCAACC TCAGAACTGC CTCCGATACT GACAGTCTAG AGTCCGGAAG AGGTGAGTGG AATTCCGAGT GGAGAGGTGA AATTCGTAGA TATTCGGAGG AACACCAGTG GCGAAGGCGG CTCACTGGTC CGGTACTGAC GCTGAGGTGC GAAAGCGTGG GGAGCAAACA GGATTAGATA CCCTGGTAGT CCACGCCGTA AACGATGAAT GCCAGCCGTC GGGGGGCATG CCCTTCGGTG GCGCAGTTAA CGCATTAAGC ATTCCGCCTG GGGAGTACGG TCGCAAGATT AAAACTCAAA GGAATTGACG GGGGCCCGCA CAAGCGGTGG AGCATGTGGT TTAATTCGAA GCAACGCGCA GAACCTTACC AGCCCTTGAC ATCCCGATCG CGAGGACCAG AGATGGACCT TTTCAGTTCG GCTGGATCGG AGACAGGTGC TGCATGGCTG
TCGTCAGCTC GTGTCGTGAG ATGTTGGGTT AAGTCCCGCA ACGAGCGCAA CCCTCGCCCT TAGTTGCCAG CATTCAGTTG GGCACTCTA AGGGGACTGC CGGTGATAAG CCGGAGGAAG GTGGGGATGA CGTCAAGTC CTCATGGCCC TTACGGGCTG GGCTACACAC GTGCTACATG GCGGTGACAA TGAGC
Trình tự chủng RLB1 có kích thước 1193 bp đúng với tính toán lý thuyết (căn cứ theo trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn và RLB). Điểm cắt của enzyme EcoRI cũng được tìm thấy ở vị trí khoảng 610 bp, điều này phù hợp với giả thuyết của chúng tôi về điểm cắt của enzyme EcoRI có mặt trong trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng RLB1. So sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng RLB1 với các trình tự gen của các vi sinh vật đã được công bố trên ngân hàng gen thế giới và phân tích bằng phần mềm Blast 2.1 NCBI, độ tương đồng giữa chủng RLB1 với một số chủng vi sinh vật khác được xác định (bảng 3.4).
Bảng 3.4: Mức độ tương đồng đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng RLB1 với một số chủng vi khuẩn khác
Tên vi sinh vật Mức độ tương đồng
Uncultured bacterium clone VIETMHD 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence 99% Uncultured bacterium clone TANMHD 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence. 96% Uncultured bacterium clone MOZMHD 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence. 96%
Trình tự gen 16S rRNA của chủng RLB1 có mức tương đồng 99% với các vi khuẩn VIETMHD, 96% với vi khuẩn TANMHD và vi khuẩn MOZMHD. Theo Nunan và cộng sự (2007) tại đại học Arizona đã công bố chủng VIETMHD được giải trình tự từ máu tôm hùm nhiễm bệnh sữa ở Việt Nam vì vậy chủng RLB1 của chúng tôi có độ tương đồng cao tới 99% với chủng này. Chủng RLB1 có độ tương đồng 96% với các chủng TANMHD và MOZMHD do các chủng TANMHD, MOZMHD được lấy từ các nước Tanzania, Mozambique trên vật chủ là tôm sú bị nhiễm bệnh sữa cho thấy có sự khác biệt giữa các chủng Rickettsia gây bệnh sữa trên các đối tượng khác nhau cũng như vùng địa lý khác nhau [40].
3.3. Kết quả khảo sát sự phân bố của RLB trên tôm hùm bông và một số loại thức ăn nuôi tôm bằng phương pháp PCR ăn nuôi tôm bằng phương pháp PCR
3.3.1. Kết quả khảo sát sự phân bố của RLB trên tôm hùm bông
Hemolymph của 30 mẫu tôm hùm bông gồm 20 mẫu tôm bị bệnh sữa điển hình và 10 mẫu tôm khỏe được thu và làm nguyên liệu để tách chiết DNA tổng số. Kết quả điện di kiểm tra DNA tổng số của một số mẫu hemolymph tôm hùm thể hiện ở hình 3.14.
Hình 3.14: Điện di đồ DNA tổng số hemolymph của một số mẫu tôm hùm. M: Marker; Giếng 1 - 11: Mẫu tôm hùm có số thứ tự từ 1 -11 (bảng 3.1).
Trên hình 3.14 là kết quả điện di DNA tổng số của một số mẫu hemolymph của cả tôm hùm bông khỏe và tôm hùm bông bị bệnh sữa được đánh số thứ tự từ 1 đến 11 trong bảng danh sách mẫu tôm hùm ở bảng 3.1. Như vậy, giếng 1, 2, 3, 4 và giếng 9, 10, 11 là điện di đồ DNA tổng số của hemolymph tôm hùm bị bệnh sữa, còn giếng 5, 6, 7, 8 là điện di đồ DNA tổng số của hemolymph tôm hùm khỏe. Kết quả điện di cho thấy, hầu hết các mẫu tách DNA đều rõ, ngoại trừ ở các băng số 3 và 7 kết quả điện di hơi mờ. Tuy vậy, DNA tổng số của các mẫu tôm hùm được tách theo qui trình mô tả đạt độ sạch để thực hiện phản ứng PCR phát hiện RLB tiếp theo.
Phản ứng PCR đã được tiến hành với thành phần phản ứng và chu trình nhiệt giống như ở phần phương pháp. Kết quả điện di sản phẩm PCR của 30 mẫu hemolymph của tôm hùm bông thu ở hai tỉnh Khánh Hòa và Phú Yên thể hiện ở hình 3.15.
Hình 3.15: Hình điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA của RLB trên hemolymph của 30 mẫu tôm hùm bông.
M: Marker; P-: chứng (-); P+: chứng (+); Giếng 1 – 30: sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA của RLB trên tôm hùm bông được đánh số thứ tự từ 1 – 30 trong bảng 3.1.
19 5 6 7 8 M P- P+ 1 2 3 4 9 10 11 12 13
Kết quả PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA của RLB trên máu tôm hùm bông thu ở hai tỉnh Khánh Hòa và Phú Yên thể hiện cụ thể ở bảng 3.5 như sau:
Bảng 3.5: Kết quả PCR phát hiện RLB trên tôm hùm bông
TT Ký hiệu mẫu Tình trạng tôm Kết quả TT Ký hiệu mẫu Tình trạng tôm Kết quả 1 TH39 Bệnh sữa + 16 TH121 Bệnh sữa + 2 TH40 Bệnh sữa + 17 TH122 Bệnh sữa + 3 TH41 Bệnh sữa + 18 TH123 Bệnh sữa +
4 TH42 Bệnh sữa + 19 TH150 Tôm khỏe -
5 TH82 Tôm khỏe - 20 TH151 Tôm khỏe -
6 TH83 Tôm khỏe - 21 TH152 Tôm khỏe -
7 TH84 Tôm khỏe - 22 TH153 Tôm khỏe -
8 TH85 Tôm khỏe - 23 TH154 Tôm khỏe -
9 TH86 Bệnh sữa + 24 TH155 Tôm khỏe -
10 TH87 Bệnh sữa + 25 TH160 Bệnh sữa + 11 TH88 Bệnh sữa + 26 TH161 Bệnh sữa + 12 TH89 Bệnh sữa + 27 TH162 Bệnh sữa + 13 TH90 Bệnh sữa + 28 TH163 Bệnh sữa + 14 TH 91 Bệnh sữa + 29 TH164 Bệnh sữa - 15 TH120 Bệnh sữa + 30 TH165 Bệnh sữa +
Ghi chú: +: dương tính với RLB; -: âm tính với RLB.
Bảng 3.6: Tỷ lệ cảm nhiễm của RLB trên tôm hùm bông
Loại mẫu n Tỷ lệ cảm nhiễm (%)
Tôm bệnh sữa 20 95
Tôm khỏe 10 0
Qua bảng 3.5 và bảng 3.6 ta thấy, trong 30 mẫu kiểm tra, có 19 mẫu (chiếm 95% số mẫu tôm bị bệnh sữa với n = 20) dương tính với RLB và 11 mẫu âm tính với RLB. Trong đó, tất cả 19 mẫu dương tính với RLB đều là mẫu tôm bị bệnh sữa, 10 mẫu tôm khỏe đều cho kết quả âm tính với RLB, 1 mẫu tôm bị bệnh sữa (TH29) cho kết quả âm tính với RLB.
Như vậy, đa số các mẫu hemolymph của tôm hùm bông bị bệnh sữa đều cho kết quả dương tính với RLB thể hiện ở băng có kích thước 254 bp. Điều này có nghĩa là trong hemolymph của tôm hùm bông bị bệnh sữa có sự tồn tại của RLB. Kết quả này phù hợp với những nghiên cứu trước đây của Đỗ Thị Hòa và cộng sự (2009). Nghiên cứu mô học của tôm hùm bị bệnh sữa của tác giả này cho thấy bệnh sữa ở tôm hùm bông là một bệnh nhiễm trùng hệ thống gây ra bởi tác nhân có tên RLB. Theo tác giả, khi xuất hiện dấu hiệu bệnh lý, RLB tồn tại nhiều trong hemolymph, gan tụy, mang, mô cơ, mô mắt... của tôm hùm bị bệnh.
Từ kết quả chạy PCR chúng tôi chọn 1 mẫu TH42 bị bệnh sữa để đọc trình tự. Để đọc trình tự đoạn gen 16S rRNA của mẫu tôm hùm 42 chúng tôi tiến hành làm sạch sản phẩm PCR. Trên hình 3.16, sản phẩm làm sạch của phản ứng PCR là 1 băng vạch rõ nét, có trình tự khoảng 254 bp đúng với tính toán lý thuyết. Như vậy, sản phẩm làm sạch có đủ chất lượng để tiến hành đọc trình tự.
Hình 3.16: Kết quả điện di sản phẩm PCR trên agarose 1,5% M: thang chuẩn; RLB42: sản phẩm làm sạch từ mẫu PCR TH42 Trình tự chủng RLB42 sau khi xử lý số liệu như sau:
CGAGGACCAGAGATGGACCTTTTCAGTTCGGCTGGATCGGAGACAGGTGC TGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAA CGAGCGCAACCCTCGCCCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGG GGACTGCCGGTGATAAGCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCA TGGCCCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGGTGACAATGAGC
So sánh trình tự gen của chủng RLB42 với các trình tự gen của các chủng RLB đã được công bố trên các vật chủ khác nhau như tôm hùm, tôm sú, phân tích bằng
phần mềm Clustal, đồng thời sử dụng chương trình Blast, độ tương đồng giữa chủng RLB42 với một số chủng vi sinh vật khác như sau:
Bảng 3.7: Mức độ tương đồng đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng RLB4 với một số chủng RLB trên các đối tượng khác nhau
Tên vi sinh vật Mức độ tương đồng
Uncultured bacterium clone VIETMHD 16S ribosomal RNA gene, partial sequence (Tôm hùm)
100%
Uncultured bacterium clone TANMHD 16S ribosomal RNA gene, partial sequence (Tôm sú)
96%
Uncultured bacterium clone MOZMHD 16S ribosomal RNA gene, partial sequence (Tôm sú)
86,6%
Kết quả so sánh trình tự nucleotit của chủng RLB42 với chủng RLB VIETMHD, TANMHD, MOZMHD cho thấy có sự khác nhau khá lớn ở chủng RLB được tách từ mẫu tôm sú. Trình tự RLB42 chỉ giống 96%, 86,6% đối với hai chủng tôm sú được lấy từ mẫu ở Tanzania, Mozambique.
3.3.2. Kết quả khảo sát sự phân bố của RLB trên một số loại thức ăn nuôi tôm và các sinh vật bám xung quanh lồng nuôi tôm
Để phát hiện sự tồn tại của RLB trên các loại thức ăn thu được cũng như trên các sinh vật bám xung quanh lồng nuôi tôm hùm, chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số. Phương pháp tách chiết được mô tả ở phần phương pháp, sản phẩm được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả điện di thể hiện ở hình 3.17.
Hình 3.17: Phổ điện di DNA tổng số của các mẫu thức ăn tôm hùm.
M: thang chuẩn; Giếng 1 – 16: Mẫu thức ăn TA1 – TA16 (Bảng 3.2); Giếng 17, 18, 19: Mẫu SV1, SV2, SV3 (Bảng 3.3).
Để phát hiện RLB có tồn tại trên các mẫu thức ăn và mẫu sinh vật bám xung quanh lồng nuôi tôm hay không chúng tôi tiến hành phản ứng PCR để khuếch đại đoạn gen của RLB. Phản ứng PCR được thực hiện theo chu trình nhiệt như đã trình bày ở