Để tách dòng và xác định trình tự gen, thường sử dụng một số loại vector, trong đó vectơ pCR TOPO 2.1 được sử dụng phổ biến. Đây là một trong những vectơ có hiệu quả rất cao. Vectơ pCR TOPO 2.1 có kích thước 3,9 Kb (hình 1.7). Các thành phần chính trong vectơ được thể hiện ở bảng 1.2.
Bảng 1.2: Các thành phần chính trong vectơ pCR TOPO 2.1
Thành phần Vị trí Gen lac Z 1-57 Vị trí tạo dòng 269-381 T7 promotor 388-407 F1 ori 572-986 Gen kháng Kanamycin 987-2114 Gen kháng Ampixilin 2133-2992 Col E1 ori 3182-3765
Vectơ pCR TOPO 2.1 có mang operon Lac. Tại vùng ranh giới giữa promotor của operon này và gen cấu trúc mã hóa cho enzym β- galactosidaza có vùng cắt đa vị với 17 vị trí cắt cho các enzym giới hạn EcoRI, HindIII, NsiI, KpnI, SacI, BamHI, SpeI, BstXI, EcoRV, NotI, AvaI, PaeRI, XhoI, XbaI, ApaI. Trong đó EcoRI và BstXI
có 2 vị trí cắt còn các enzym khác chỉ có một vị trí cắt. Với vị trí của vùng cắt đa vị như vậy, enzym β-galactosidaza có thể được tạo ra (nếu vectơ không được dính đoạn DNA ngoại lai) hoặc không được tạo ra (nếu vectơ có dính đoạn DNA ngoại lai). Dựa vào dấu chuẩn đó ta có thể chọn lọc được các virus mang vectơ tái tổ hợp.
Mặt khác, vectơ pCR TOPO 2.1 cũng mang gen kháng Ampixilin và Kanamycin do đó ta cũng có thể chọn lọc sơ bộ các tế bào biến nạp trên môi trường chứa chất kháng sinh với nồng độ ức chế tối thiểu.
Hình 1.7: Sơ đồ cấu trúc vectơ pCR TOPO 2.1
Sau khi tạo được dòng tế bào mang đoạn gen, tế bào được nhân sinh khối tách plasmid và đọc trình tự trên mấy tự động.
Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU