Mẫu hemolymph từ tôm bị bệnh sữa được chọn để nuôi cấy trên môi trường L- 15. Kết quả quan sát sau 7, 15, 21 ngày nuôi cấy cho thấy môi trường có màu hồng nhạt (không thay đổi màu so với màu của môi trường gốc) và không lắng tủa với pH = 7,5 (Hình 3.4). Điều này cho thấy RLB cũng như các vi khuẩn khác không tăng sinh trong môi trường nuôi cấy L-15.
Hình 3.4: Hình bình nuôi cấy tế bào 25cm2 trước (A) và sau khi nuôi cấy 7 ngày (B).
Để kiểm tra dịch nuôi cấy trên có tồn tại của các vi khuẩn khác không, chúng tôi lấy dịch ở môi trường L-15 cấy trên các môi trường thạch dinh dưỡng: MA, BHI và TCBS nuôi ở nhiệt độ 28 – 300C trong 48 – 96 giờ. Kết quả cho thấy không thấy xuất hiện tế bào vi khuẩn nào trên tất cả các môi trường thạch (Hình 3.5). Như vậy, dịch nuôi cấy RLB không có mặt của các vi khuẩn thường thấy ở nước mặn khác.
Môi trường MA Môi trường BHI+3%NaCl Môi trường TCBS
Hình 3.5: Kết quả nuôi cấy của dịch L-15 trên môi trường MA, BHI và TCBS sau 48 giờ.
Dịch chứa RLB nuôi trong L-15 ly tâm 10.000 v/ph trong 10 phút, thu tủa đem nhuộm gram và quan sát dưới kính hiển vi quang học, chụp hình kính hiển vi điện tử. Kết quả quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 1000x cho thấy tế bào giống vi khuẩn gram âm, có hình hạt đậu (Hình 3.6).
Mẫu TH42 3/7/2010 A Mẫu TH42 3/7/2010 B
A B C
Hình 3.6: Ảnh RLB nhuộm Gram và quan sát KHV vật kính dầu 1000x
Trên ảnh chụp kính hiển vi điện tử truyền qua TEM (Hình 3.7 A) và ảnh chụp KHV điện tử quét SEM (Hình 3.7 B) cho thấy tế bào có hình dạng hơi cong, kích thước 500 x 1500 nm, không có tiêm mao, không có lông (thể pili).
Hình 3.7: Hình kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) của RLB (A) và hình chụp RLB trên kính hiển vi điện tử quét (SEM) (B)
Quan sát ảnh kính hiển vi quét cho thấy quá trình sinh sản của RLB theo hai dạng cơ bản là phân đôi và phân 4 đồng tâm. Sự sinh sản theo cách phân đôi tế bào (trực phân) ở RLB cũng tương tự như ở vi khuẩn (Hình 3.8).
Hình 3.8: Ảnh quá trình sinh sản của RLB chụp kính hiển vi điện tử quét (SEM). (A): RLB tương tự trực khuẩn. (B): Phân chia đôi đều 2 cực. (C): Phân chia 4 tế bào 2 cực.
B A
Như vậy, RLB mà chúng tôi quan sát được có dạng hình cong, có kích thước 0.5 µm x 1.5 - 2.0 µm. Đặc điểm này có sự tương đồng với RLB theo thông báo của OIE (2010) khi nghiên cứu RLB từ tôm hùm Việt Nam và tương tự RLB từ loài cua châu Âu (Carcinus maenas) bị bệnh sữa được phát hiện bởi Eddy và cộng sự (2007); RLB từ tôm sú (Penaeus monodon) nuôi ở Madagasca được phát hiện bởi Nunan và cộng sự (2003) và RLB từ tôm hùm bị bệnh sữa nuôi ở các tỉnh miền Trung Việt Nam được phát hiện bởi Đỗ Thị Hòa và cộng sự (2009).