2.2.1.1. Phương pháp thu mẫu tại hiện trường
- Mẫu tôm: thu chọn lọc 30 con tôm hùm bông nuôi ở Khánh Hòa và Phú Yên. Số lượng: 20 con tôm hùm bông bị bệnh sữa điển hình và 10 con tôm hùm bông khỏe mạnh.
+ Tôm bệnh sữa: Máu tôm được lấy trực tiếp tại nơi lấy mẫu. Cách lấy máu tôm: dùng kim tiêm loại 1 ml đâm vào gốc chân bò thứ 5 của tôm để lấy máu từ động mạch tôm hoặc lấy máu trực tiếp từ tim cho vào eppendorf vô trùng. Mẫu máu và mẫu tôm được chứa trong các túi vô trùng riêng biệt có nhãn ghi rõ ký hiệu mẫu, ngày lấy mẫu, địa điểm lấy mẫu... Mẫu được bảo quản lạnh trong thùng xốp đá rồi vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm.
+ Tôm khỏe: Vận chuyển sống về phòng thí nghiệm trong thùng xốp có sục khí.
- Mẫu thức ăn: thu các loại thức ăn thường được sử dụng cho nuôi tôm hùm bông thuộc ba nhóm đối tượng chính: giáp xác, nhuyễn thể, cá. Số lượng: 45 mẫu. Trong đó, số lượng mẫu mỗi nhóm gồm: 15 mẫu cá, 10 mẫu nhuyễn thể, 20 mẫu giáp xác.
- Mẫu sinh vật bám xung quanh lồng nuôi: thu ngẫu nhiên mẫu cua và hàu bám xung quanh lồng nuôi. Số lượng mẫu là 6 mẫu, trong đó có 3 mẫu cua và 3 mẫu hàu.
Mẫu thức ăn và mẫu sinh vật bám xung quanh lồng nuôi được thu và cho vào các túi nilon riêng biệt. Trên mỗi túi có nhãn ghi đầy đủ các thông tin về mẫu như ngày, địa điểm thu mẫu, đặc điểm mẫu... để tránh nhầm lẫn. Bảo quản trong thùng xốp lạnh và vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm.
2.2.1.2. Phương pháp thu mẫu trong phòng thí nghiệm
- Thu mẫu hemolymph tôm làm nguyên liệu cho tách chiết DNA tổng số: Lấy 100 µl hemolymph tôm cho vào eppendorf vô trùng.
- Thu mẫu thức ăn và sinh vật bám xung quanh lồng nuôi làm nguyên liệu cho tách chiết DNA tổng số:
+ Mẫu thức ăn sau khi vận chuyển về phòng thí nghiệm, một phần được bảo quản trong tủ âm (- 200C), một phần được phân loại, chụp ảnh và thu mẫu để tách chiết DNA tổng số làm nguyên liệu cho phản ứng PCR phát hiện RLB.
+ Rửa sạch bề mặt cơ thể mẫu bằng nước cất vô trùng. Dùng dụng cụ vô trùng tách lấy gan, thận (cá); gan tụy, màng áo và tuyến tiêu hóa (nhuyễn thể); mang, gan tụy (giáp xác). Mỗi mẫu khoảng 10 - 20 cá thể, nghiền đồng nhất sau đó lấy khoảng 0,1 g để tách DNA.
2.2.2. Phương pháp nuôi cấy RLB
Để tìm hiểu hình thái của RLB, cần phải tách được RLB ra khỏi dung dịch gồm nhiều nhóm vi khuẩn khác. Môi trường nuôi cấy tế bào Leibovitz L-15 được chọn làm môi trường nuôi cấy. Qua một số thử nghiệm, môi trường L-15 có bổ sung thêm NaCL 30 ppt, FBS 10%, 1% kháng sinh (penicillin và streptomycin), pH=7,5 là môi trường thích hợp nhất để nuôi cấy RLB.
Phương pháp nuôi cấy RLB trên môi trường L-15: lấy 500 µl mẫu hemolymph tôm hùm bị bệnh sữa cho vào eppendorf 1,5 ml; bổ sung 500 µl môi trường L-15; spin trong 5 phút, bỏ phần tủa tế bào máu; thu dịch chuyển vào trong bình nuôi tế bào 25cm2 với 10ml môi trường L-15, dịch đưa vào theo tỷ lệ 2%; nuôi ở 280C trong 72 giờ.
Dịch nuôi thu ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ tủa (vi khuẩn khác). Phần dịch nổi chứa RLB (tế bào có nhiều không bào nên có tỷ trọng nhẹ) ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Thu tủa hòa trong PBS (phosphate buffer saline), cấy
lên các môi trường agar dinh dưỡng: BHI, MA và môi trường TCBS, nuôi 48 - 96 giờ để kiểm tra sự tồn tại của các vi khuẩn khác. Nếu sau khi kiểm tra thấy không có mặt của các vi khuẩn khác, dịch ly tâm này là sinh khối RLB thu được.
Sơ đồ qui trình nuôi cấy RLB như sau:
Hình 2.1: Sơ đồ qui trình nuôi cấy RLB
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái của RLB
Đặc điểm hình thái, kích thước của RLB được xác định bằng cách quan sát trên kính hiển vi quang học (vật kính 1000x), kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và kính hiển vi điện tử quét (SEM).
Phương pháp kính hiển vi quang học: mẫu hemolymph của tôm bệnh và dịch nuôi cấy trên L-15 được nhuộm gram (theo bộ thuốc nhuộm gram của công ty Nam Khoa) và quan sát, chụp ảnh trên kính hiển vi quang học (vật kính 1000x).
Phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), kính hiển vi điện tử quét (SEM): mẫu hemolymph của tôm bệnh và dịch nuôi cấy trên L-15 được gửi sang phòng Kính Hiển vi Điện tử - Viện Vệ sinh Dịch tể Trung ương để chụp ảnh và phân tích.
2.2.4. Phương pháp PCR xác định RLB
2.2.4.1. Phương pháp tách chiết DNA của RLB
DNA trong hệ gen của RLB được chiết xuất để làm nguyên liệu cho giải trình tự gen và làm khuôn cho phản ứng PCR nhân đoạn gen cần nghiên cứu. DNA được tách theo kit Genomic DNA Purification Kit của hãng Fermentas. Trình tự tiến hành
Mẫu máu tôm Spin 5 phút để thu dịch Nuôi trong L-15 Ly tâm bỏ tủa Tách DNA tổng số Mẫu TH39
như sau (theo quy trình chỉ dẫn của hãng):
- Lấy mẫu vào ống eppendorf và nghiền kỹ bằng chày nghiền.
- Thêm 200 µl TE 1X, tiếp tục nghiền sau đó trộn đều, tránh tạo bọt.
- Thêm 400 µl dung dịch Lysis và ủ ở 65 0C trong 10 phút.
- Thêm 600 µl dung dịch chloroform vào ống đã ủ, lắc nhẹ vài lần. Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 3 phút.
- Hút toàn bộ dịch trên sang ống mới và thêm 800 µl dung dịch tủa DNA (720 µl dung dịch H2O khử ion + 80 µl dung dịch Supplied 10X). Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
- Ly tâm, loại dịch nổi. Hoà tủa DNA trong 100 µl dung dịch NaCl 1,2 M. Thêm 2 µl RNAse 10 mg/ml, ủ 370C trong 1 giờ.
- Thêm 300 µl cồn tuyệt đối vào ống và để -20 0C trong 3 giờ hoặc qua đêm.
- Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút, thu tủa. Rửa tủa hai lần bằng cồn 700:
+ Thêm 500 µl cồn 700, trộn đều
+ Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút
+ Làm khô DNA bằng máy hút chân không hoặc làm khô tự nhiên trong bốc sạch.
- Hoà tủa DNA trong 30-100 µl TE 1X, kiểm tra độ sạch và xác định hàm lượng DNA bằng đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 280 nm và 260 nm và điện di trên gel agarose 1%.
2.2.4.2. Thực hiện phản ứng PCR
Trình tự mồi: sử dụng cặp mồi 254f và 254r cho phát hiện RLB ở tôm hùm bông bệnh sữa MHD-SL theo khuyến cáo của OIE 2010. Trình tự của mồi như sau:
254F: 5’-CGA-GGA-CCA-GAG-ATG-GAC-CTT-3’
Thành phần phản ứng và chương trình chạy PCR Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nước cất khử ion 14.5 2 Buffer PCR KCl 10X 2.5 3 MgCl2 25mM 1.5 4 dNTPs 2mM 2.5 5 Mồi xuôi 254F 10mM 0.5 6 Mồi ngược 254R 10mM 0.5
7 Taq polymerase 1u/µ 1
8 DNA 2 Tổng 25 Bảng 2.2: Chu trình phản ứng PCR Bước Phản ứng Nhiệt độ (OC) Thời gian Chu Kỳ 1 Biến tính 94 5 phút 1 2 Biến tính 94 20 giây 3 Gắn mồi 64 30 giây
4 Kéo dài chuỗi 72 20 giây
30
5 Hoàn tất kéo dài 72 5 phút 1 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
Điện di
Điện di là một kỹ thuật rất quan trọng trong phản ứng PCR để làm cho các đoạn acid nucleic hiển thị trực tiếp dưới tác dụng của tia cực tím. Phương pháp này dựa vào đặc tính là các phân tử acid nucleic ở pH trung tính chúng tích điện âm nhờ các nhóm phosphat nằm trên khung phosphodieste của các acid nucleic. Khi đặt gel (đã cho sản phẩm PCR vào các giếng) trong điện trường, các acid nucleic sẽ chuyển dịch từ cực
âm về cực dương, các phân tử có kích thước (phân tử lượng) nhỏ sẽ chuyển dịch nhanh, các phân tử có kích thước lớn sẽ chuyển dịch chậm hơn.
Các bước tiến hành:
- Chuẩn bị thạch agarose 1% (0.8%): cân 1g (0.8g) agarose cho vào chai thủy tinh chịu nhiệt với 100 ml đệm điện di TAE 1x. Đun trong lò vi sóng cho tới khi gel chảy hoàn toàn trong suốt (không có bọt khí). Để nguội tới nhiệt độ 500C sau đó đổ gel vào khuôn có gài sẵn các lược để tạo giếng (gel có độ dày 2-3 mm). Sau khi gel đông (khoảng 30 phút ở nhiệt độ phòng) cẩn thận rút lược ra và có thể dùng để điện di (lưu ý: không để gel ở nhiệt độ phòng quá 4 giờ). Gel sau khi chuẩn bị phải ngâm chìm trong dung dịch đệm điện di TAE 1x.
- Trộn đều 5 µl sản phẩm PCR với 1 µl chỉ thị màu loading dye blue trên các khuôn bên ngoài rồi cho vào các giếng trên gel.
- Tra 4 – 6 µl DNA Marker vào giếng thạch khác để tạo thang chuẩn.
- Chạy điện di ở hiệu điện thế 100V trong vòng 30 – 40 phút.
- Nhuộm bản gel bằng Ethidium bromide (5 – 15 phút), rửa lại bằng nước rồi cho gel vào máy tử ngoại để đọc kết quả.
Đọc kết quả
Sau khi nhuộm với Ethidium bromide, lấy gel cho vào máy tử ngoại đọc kết quả (so sánh với đối chứng và ladder).
2.2.5. Phương pháp PCR nhân đoạn gen 16S rRNA
Đoạn gen 16S rRNA của mẫu RLB1 và RLB2 được nhân lên nhờ phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27f mồi chung cho vi khuẩn và mồi 254r đặc hiệu cho RLB (theo OIE khuyến cáo) và DNA tổng số của mẫu RLB1, RLB2 làm khuôn.
Trình tự cặp mồi
27f: 5’ - AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG - 3’
Thành phần và chu trình phản ứng
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng PCR nhân đoạn gen 16S rRNA của RLB
STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nước cất khử ion 14.5 2 Buffer PCR KCl 10X 2.5 3 MgCl2 25mM 1.5 4 dNTPs 2mM 2.5 5 Mồi xuôi 27F 10mM 0.5 6 Mồi ngược 254R 10mM 0.5
7 Taq polymerase 1u/µ 1
8 DNA 2
Tổng 25
Bảng 2.4: Chu trình phản ứng PCR nhân đoạn gen 16S rRNA của RLB
Bước Phản ứng Nhiệt độ (OC) Thời gian Chu Kỳ 1 Biến tính 94 3 phút 1 2 Biến tính 94 20 giây 3 Gắn mồi 60 30 giây
4 Kéo dài chuỗi 72 20 giây
35
5 Hoàn tất kéo dài 72 5 phút 1
6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
2.2.6. Phương pháp làm sạch sản phẩm PCR
Trước khi đem đi giải trình tự, sản phẩm PCR được làm sạch bằng bộ Kit Bioneer. Các bước làm sạch như sau:
- Điện di các mẫu cần làm sạch.
- Nhuộm bản gel, soi dưới đèn UV, cắt băng DNA với kích thước 1200 bp trên gel. Cân gel và cho vào ống eppendorf. Thêm dung dịch GB buffer với tỉ lệ 5 VGB: 1 Vgel (500 µl GB ≈ 100 mg gel).
- Ủ ở 600C trong 10 phút (hoặc cho đến khi gel tan hết).
- Sau khi tan hết, dung dịch sẽ có màu vàng. Nếu dung dịch có màu cam hoặc tím, cần bổ sung thêm 10 µl dung dịch CH3COONa 3M và trộn đều, dung dịch sẽ chuyển thành màu vàng.
- Đặt cột có màng lọc vào ống 2 ml.
- Hút toàn bộ dịch DNA cho vào cột (chú ý lượng lớn nhất cho vào cột không quá 750 µl, nếu dịch lớn hơn thì phải làm thêm 1 lần nữa), ly tâm 10.000 vòng/phút trong 2 phút.
- Bỏ dịch li tâm bên dưới, chèn cột lại.
- Thêm 500 µl GB vào cột, ly tâm lại như trên.
- Bỏ dịch, rửa cột 2 lần bằng dung dịch WB buffer (đã được pha với cồn tuyệt đối tỷ lệ 1/5 lần) mỗi lần 500 µl. Để trong 5 phút và li tâm lại như trên.
- Nhấc cột ra và đặt vào ống eppendorf 1,5ml mới.
- Thêm 30-50 µl dung dịch đệm EL. Để ở nhiệt độ phòng 5-10 phút, li tâm 13.000 vòng/phút trong 2 phút, chuyển dịch li tâm sang ống eppendorf 1,5 mới khác, giữ ở -200C.
Sau khi làm sạch, sản phẩm PCR được điện di để kiểm tra lại trên gel agarose 1,5%, đệm TAE 1X.
Sản phẩm PCR sau khi làm sạch có thể sử dụng để đọc trình tự trực tiếp.
2.2.7. Phương pháp tách dòng và xác định trình tự gen 16S rRNA của RLB 2.2.7.1. Tách dòng gen 16S rRNA trong vector pCR TOPO 2.1 2.2.7.1. Tách dòng gen 16S rRNA trong vector pCR TOPO 2.1
Sản phẩm PCR đã được tinh sạch của RLB1 có đầu dính Adenine được gắn trực tiếp vào vectơ tách dòng pCR TOPO 2.1 đã mở vòng có đầu dính Thyamine.
Bảng 2.5: Thành phần phản ứng tách dòng gen 16S rRNA bằng vector pCR TOPO 2.1 Thành phần Thể tích (µl) H2O khử ion vô trùng 3 Vector pCR TOPO 2.1 0.5 Sản phẩm PCR 1.5 Dung dịch muối 1 Tổng thể tích (cố định) 6
Cho các thành phần vào theo đúng trình tự trên, khuấy nhẹ, ủ ở 25oC trong 5 phút
2.2.7.2. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt
Các bước tiến hành:
- Lấy 4 µl dung dịch sau phản ứng nối ghép gen chuyển vào tế bào E. Coli
DH5α- T1 (tế bào khả biến). Để trên đá trong 45 phút. Chú ý trộn và khuấy thật nhẹ
nhàng tránh làm vỡ tế bào.
- Sốc nhiệt 42oC trong 45 giây trong bể ủ nhiệt. Lấy nhanh chuyển sang đặt trên đá 2 phút.
- Thêm vào mỗi ống 100 µl SOC, đặt vào tủ lắc 200-220v/p ở 37oC trong 1giờ.
- Trải đĩa Agar- plate. Cấy trải 10 µl dịch tế bào trên đĩa môi trường LB đặc có bổ sung Kanamycin 40 µg/ml, X-gal.
- Đặt trong tủ ủ 37oC qua đêm (20 - 22 giờ).
- Chọn khuẩn lạc trắng (tốt nhất là khuẩn lạc màu trắng ngà), làm giàu trong 5ml môi trường LB có chứa Kanamycin và X-gal, nuôi cấy 37oC qua đêm. Tiến hành tách chiết DNA plasmid.
2.2.7.3. Tách plasmid DNA bằng Qiagen Miniprep Kit
Trong vi khuẩn tái tổ hợp sẽ có hai hệ gen được nhân lên, đó là hệ gen của chính vi khuẩn chủ và hệ gen của vi khuẩn tái tổ hợp. Tách plasmid DNA tái tổ hợp chính là thu nhận hệ gen của plasmid và loại trừ hệ gen vi khuẩn chủ mà chúng ta không cần. Các bước tiến hành như sau:
- Lấy 1,5 ml dung dịch tế bào đã nuôi cấy 37oC qua đêm cho vào ống eppendorf. Ly tâm 10000 v/p, thu cặn tế bào, bỏ phần dung dịch.
- Thêm 250 µl đệm P1, hoà tan cặn tế bào (trong thành phần P1 có bổ sung RNase A).
- Thêm 250 µl đệm P2, vortex 15 giây, để ở nhiệt độ phòng 4 phút 44 giây.
- Thêm 350 µl đệm N3, ly tâm 13000 v/p trong 10 phút ở 4oC.
- Chuẩn bị các cột có màng lọc. Thu dịch trong sau khi ly tâm. Cho dịch trong qua cột. Ly tâm cột 13000v/p. Bỏ nước dưới cột lọc.
- Thêm 500 µl đệm PB. Ly tâm 13000v/p. Bỏ nước dưới cột lọc.
- Thêm 750 µl đệm PE. Ly tâm 13000v/p. Bỏ nước dưới cột lọc (2 lần).
- Chuyển sang ống Eppendorf mới, thêm 50 µl đệm EB. Để ở nhiệt độ phòng 2 phút. Ly tâm 13000v/p. Thu được plasmid DNA.
Trong quá trình tách plasmid thì đệm P1 có tác dụng làm đồng nhất các tế bào, giúp các tế bào phân bố đồng đều trong toàn bộ mẫu. Đệm P2 có tác dụng phá vỡ tế bào và giải phóng DNA. Đệm N3 có tác dụng loại ARN, protein và một số tạp chất khác.
2.2.7.4. Cắt kiểm tra DNA plasmid bằng EcoRI
Plasmid thu được ở trên là plasmid tái tổ hợp được cắt bằng EcoRI nhằm khẳng định chắc chắn được đoạn gen mong muốn (đoạn ORF 110) có được gắn vào vectơ pCR TOPO 2.1. Phản ứng cắt EcoRI gồm những thành phần như sau:
Bảng 3.6: Hỗn hợp phản ứng cắt EcoRI Thành phần Thể tích (µl) H2O khử ion vô trùng 16 Đệm EcoRI 2 Enzym EcoRI 1 Plasmid DNA 1 Tổng thể tích 20
Theo lý thuyết khi plasmid tái tổ hợp cắt bằng EcoRI sẽ thu đuợc hai băng, một băng khoảng 3,9 Kb là vectơ pCR TOPO 2.1, băng thứ hai khoảng 1 Kb là đoạn gen (ORF110) cần tách dòng.
2.2.7.5. Giải trình trình tự đoạn gen 16S rRNA
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc của phương pháp Sanger có sử dụng 4