1.3.1. Phương pháp chẩn đoán lâm sàng
Đây là phương pháp chẩn đoán nhanh dựa trên những biểu hiện bệnh lý thể hiện ra bên ngoài của vật chủ bị nhiễm vi khuẩn. Tôm hùm mắc bệnh sữa thường kém hoạt động, ăn kém đến bỏ ăn hoàn toàn. Trong vòng 3 – 5 ngày mắc bệnh, tôm có biểu hiện máu đục như sữa và khó đông; cơ ở các đốt bụng chuyển sang trắng đục và chết khi các dấu hiệu bệnh lý này thể hiện ra bên ngoài [44]. Dựa vào đó có thể nhận biết được tôm hùm có nhiễm RLB hay không.
Phương pháp chẩn đoán lâm sàng có ưu điểm là dễ thực hiện vì chỉ phụ thuộc vào kinh nghiệm của người nuôi. Tuy nhiên, phương pháp có nhiều nhược điểm như độ chính xác không cao vì các biểu hiện khi nhiễm các loại vi khuẩn khác nhau ở cùng một loại thể vật chủ có thể giống nhau, chính vì vậy không xác định chính xác được tác nhân nào gây bệnh. Ngoài ra, khi phát hiện bằng chẩn đoán lâm sàng, vật chủ đã bị nhiễm vi khuẩn rất nặng (khi đó các dấu hiệu bệnh mới thể hiện ra bên ngoài), vì vậy rất khó có thể phòng chữa và ngăn chặn kịp thời dịch bệnh.
1.3.2. Phương pháp mô bệnh học
Phương pháp dựa trên những thay đổi về tế bào, tổ chức mô của vật chủ để có thể nhận biết được các tác nhân đã xâm nhiễm và gây bệnh đối với vật chủ. Phương pháp có ưu điểm là đơn giản, phát hiện sớm được bệnh, tuy nhiên nếu chỉ dùng duy nhất phương pháp mô học để chẩn đoán thì kết quả nhiều khi không chính xác, bởi mô và tổ chức mô có thể biến đổi do nhiều tác nhân khác nhau cũng có thể có những thay đổi giống nhau. Chính vì vậy, sau khi đã tiến hành phân tích mô bệnh học cũng cần phân tích mẫu bằng các phân tích khác nữa (PCR, miễn dịch học …) để khẳng địch chắc chắn tác nhân gây bệnh.
Để nghiên cứu biến đổi mô học của vật chủ bị bệnh, các mẫu cơ quan đích thường được thu và bảo quan trong dung dịch Davidson, hoặc Bouin hoặc Formaldehyde. Sau đó mẫu được làm mất nước và đúc paraffin. Mẫu được cắt với các độ dày khác nhau rồi nhuộm H & E hoặc nhuộm gram và quan sát dưới kính hiển vi.
Nghiên cứu mô học trên mẫu tôm hùm bị bệnh sữa của Đỗ Thị Hòa và cộng sự (2009) cho thấy ở những con tôm bị bệnh nặng, RLB tồn tại rất nhiều và gây biến đổi các cơ quan như mang, mô liên kết của cơ quan gan tụy, mô dạ dày, mô mắt, biểu mô dưới vỏ... RLB bắt màu tím của thuốc nhuộm Hematoxylin.
1.3.3. Phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
Kính hiển vi điện tử truyền qua TEM (Transmision electron microscopy) là một thiết bị được sử dụng để nghiên cứu siêu cấu trúc của vật rắn. Phương pháp này sử dụng chùm điện tử có năng lượng cao chiếu xuyên qua mẫu vật rắn mỏng và sử dụng các thấu kính từ để tạo ảnh với độ phóng đại lớn (có thể lên tới hàng triệu lần).
Bonami và cộng sự (1980) đã sử dụng phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua để nghiên cứu siêu cấu trúc của RLO gây bệnh trên loài cua Carcinus mediterraneus. Mẫu được cố định trong dung dịch gồm 3% glutaraldehyde và 2%
osmium tetroxide 12 và được gắn epon. Cắt thành các phần siêu mỏng và nhuộm theo phương pháp của Reynold. Kết quả quan sát dưới kính hiển vi điện tử cho thấy có sự tồn tại của rất nhiều vi sinh vật ký sinh bên trong các không bào trong nguyên sinh chất. Chúng được phân biệt bởi một màng nguyên sinh chất và một vách tế bào. Chúng có dạng hình que, một vài trong số chúng phân đôi theo hình thức nhị phân [10].
Rena và cộng sự (1990) cũng đã sử dụng phương pháp kính hiển vi điện tử để nghiên cứu bệnh hoại tử gan tụy trên tôm thẻ chân trắng (P. vannamei). Kết quả quan sát dưới kính hiển vi điện tử (TEM) cho thấy sự tồn tại của 3 nhóm vi sinh vật chính là: RLO, vi khuẩn có dạng hình xoắn ốc và vi khuẩn dạng sợi. RLO gây bệnh trên đối tượng này có dạng hình que, kích thước 0,3 x 0,9 µm, tồn tại trong nguyên sinh chất, có một màng nguyên sinh chất và một vách tế bào [48].
Trong nghiên cứu về bệnh do RLB gây ra trên tôm sú (P. monodon), Nunan và cộng sự (2003) đã dùng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) để phát hiện RLB. Tác giả đã phát hiện tế bào RLB có dạng que, kích thước 0,45 µm – 1,5 µm. RLB phân chia theo hình thức nhị phân [39].
Phương pháp kính hiển vi điện tử cũng được sử dụng trong nghiên cứu bệnh sữa ở loài cua châu Âu (Carcinus maenas) bởi Fiona Eddy và cộng sự (2007). Kết quả quan sát bằng kính hiển vi điện tử cho thấy các tác nhân gây bệnh sữa tồn tại trong các
đại thực bào trong các mô liên kết xung quanh các ống gan tụy. RLB nhân lên trong nguyên sinh chất của các đại thực bào cố định. Bên trong không bào của các tế bào bị nhiễm có các thể sợi myelin, còn RLB lại chiếm ưu thế ở vùng ngoại vi của màng nguyên sinh chất. Một số lượng lớn RLB cũng tồn tại tự do bên trong máu cua bệnh, số ít còn lại (<0.01 % tế bào kiểm tra) được tìm thấy bên trong nguyên sinh chất của tế bào máu [28].
Ở nước ta, nhóm nghiên cứu của Đỗ Thị Hòa và cộng sự (2009) cũng đã phát hiện RLB bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM). Theo kết quả của nhóm nghiên cứu, RLB gây bệnh sữa trên tôm hùm bông nuôi ở các tỉnh miền Trung Việt Nam có dạng cong nhiều như vành trăng khuyết, kích thước 1,5 – 2,5 µm, không có tiên mao, không có lông [2].
1.3.4. Phương pháp phân lập RLB
RLB là vi sinh vật ký sinh nội bào bắt buộc và không phát triển trên các môi trường nuôi cấy vi khuẩn nhân tạo thông thường do đó để nuôi cấy và phân lập RLB bắt buộc phải sử dụng dòng tế bào để nuôi. Vi khuẩn được phân lập từ mô những cơ quan bị nhiễm, sau đó được nuôi trong những dòng tế bào. Phương pháp có nhược điểm là rất khó thực hiện bởi thao tác khó và chi phí thiết bị cũng như hóa chất tốn kém.
Trong các nghiên cứu về RLO trên cá, các dòng tế bào cá được sử dụng trong nuôi cấy P. salmonis như: phôi cá hồi chinook (CHSE-214), phôi cá hồi Oncorhyncus (CHH-1), phôi cá hồi coho (CSE-119), tế bào tuyến sinh dục của cá hồi vân (RTG-2).
P. salmonis cũng được nuôi cấy trên tế bào của các loài cá khác như cá chép Cyprinus carpio...
RLO gây bệnh trên cá rô phi ở Đài Loan được nuôi cấy trên các tế bào có nguồn gốc từ buồng trứng của cá rô phi (TO-2) ở 25°C [19]. Sinh khối RLO gây bệnh trên cá hồi Atlantic nuôi ở Scotland từ việc nuôi cấy tế bào bằng dòng tế bào CHSE- 214 tăng gấp 100 lần sau 14 đến 21 ngày nuôi cấy ở 18°C và độc lực của RLO vẫn tồn tại.
Hiện tại ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào được tiến hành nhằm nuôi cấy RLB bằng phương pháp nuôi cấy tế bào do những khó khăn hiện tại về trang thiết bị cũng như trình độ của kỹ thuật viên. Do vậy, phương pháp sinh học phân tử như phương pháp PCR được xem là phương pháp hữu hiệu trong việc phát hiện RLB.
1.3.5. Phương pháp PCR phát hiện RLB
Được phát minh vào năm 1985 và được thừa nhận chính thức năm 1993 qua giải thưởng Nobel y dược và sinh lý cho Kary Mullis - người phát minh ra nó. PCR hiện đang được ứng dụng rộng rãi tại Việt Nam.
Nguyên lý của phản ứng PCR
PCR là một phản ứng phụ thuộc nhiệt độ, sử dụng đặc điểm của quá trình sao chép DNA với sự tham gia của enzyme DNA – polymerase chịu nhiệt, có hai đoạn DNA làm mồi và dùng các đoạn DNA mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi bổ sung với nó. Vì vậy, để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA cần cung cấp đoạn mồi oligonucleotit (có độ dài từ 6 – 30 nucleotit). Đoạn này gắn kết với DNA khuôn tại điểm khởi đầu sao chép và được enzyme DNA – polymerase điều khiển tổng hợp một đoạn DNA đặc thù. Các sợi DNA mạch đơn làm khuôn được tạo ra theo cách đơn giản là nâng nhiệt độ lên trên 90°C (92 – 98°C) cho mạch xoắn kép bung ra [3].
Cả hai sợi DNA đều được dùng làm khuôn cho quá trình tổng hợp nếu các đoạn mồi (primer) được cung cấp để bám vào vị trí tương ứng cho cả hai sợi. Trong kỹ thuật PCR, các đoạn mồi được chọn nằm ở hai đầu đoạn DNA cần nhân lên sao cho các sợi DNA tổng hợp mới được bắt đầu tại vị trí bám của mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia, cho sản phẩm có độ dài giới hạn giữa hai đoạn mồi này. Độ dài sản phẩm của PCR có thể vài trăm cho đến hàng ngàn, thậm chí hàng chục ngàn cặp nucleotit. Như vậy, sau mỗi chu kỳ các điểm bám cho mồi lại xuất hiện trên mỗi sợi DNA mới được tổng hợp. Hỗn hợp phản ứng lại được nâng nhiệt độ thích hợp sao cho các sợi ban đầu tách khỏi sợi mới được tổng hợp, các sợi này sau đó còn được dùng tiếp cho chu kỳ tiếp theo bao gồm các bước gắn mồi, tổng hợp DNA và tách rời các đoạn [3].
Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ của phản ứng, tính theo lý thuyết ta sẽ có 2n bản sao các phân tử DNA mạch kép nằm giữa hai đoạn mồi. Đó là một đặc điểm quan trọng của kỹ thuật.
PCR dẫn đến kết quả là một đoạn DNA định trước được nhân lên với một lượng rất lớn. Ví dụ sau 30 chu kỳ số lượng bản sao DNA của PCR sẽ là 1.073.741.824 [3].
Cách tiến hành phản ứng PCR
PCR là một kỹ thuật phòng thí nghiệm rất đa năng và được ứng dụng rất rộng rãi. Vật liệu khởi đầu cho PCR là DNA có chứa đoạn gen mà ta cần nhân lên gọi là khuôn. Các đoạn mồi dùng trong phản ứng sẽ xác định vị trí bám để thực hiện phản ứng. Hàm lượng DNA làm khuôn cần rất nhỏ. Trong thí nghiệm bình thường ở phòng thí nghiệm chỉ cần 100 nanogram (ng) DNA làm khuôn là đủ. Tuy nhiên trong nhiều trường hợp, phản ứng PCR có thể thực hiện thành công chỉ từ một phân tử DNA riêng lẻ, tức là chỉ cần DNA làm khuôn từ duy nhất một tế bào cơ thể [3].
Thành phần chủ yếu của phản ứng PCR bao gồm:
- DNA làm khuôn.
- Hai đoạn mồi để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp DNA.
- Enzyme chịu nhiệt DNA – polymerase (hiện nay được dùng phổ biến nhất là taq – Polymerase, chiết xuất từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus).
- Hỗn hợp của tất cả bốn tiền chất deoxynucleotit ở dạng (dNTP).
- Môi trường đệm cung cấp ion Magie (Mg++).
- Nước tinh khiết (không có DNAaza, RNAaza,…).
Dung tích tổng số cho phản ứng PCR thông thường là 50µl hoặc 25µl.
PCR là chuỗi phản ứng gồm nhiều chu kỳ lặp đi lặp lại, mỗi chu kỳ gồm có ba bước:
- Bung liên kết của khuôn DNA (denaturation): Được thực hiện ở nhiệt độ 92 – 95°C trong vài giây đến vài phút. Tại nhiệt độ này, các phân tử DNA mạch kép sẽ bị tách tạo nên các sợi đơn dùng để làm khuôn cho các đoạn mồi bám vào và enzyme Taq – polymerase xúc tác tổng hợp.
- Mồi bám (annealing): Sau bước một, ngay lập tức nhiệt độ được hạ xuống 36 – 65°C để các đoạn mồi bám vào với các trình tự bổ sung tương ứng trên các phân tử DNA làm khuôn.
- Tổng hợp (hay còn gọi là kéo dài – extension): Nhiệt độ ngay lập tức được nâng lên 68 – 72°C trong vài chục giây đến vài chục phút để các sợi DNA vừa được tổng hợp xoắn vào nhau tạo nên DNA mạch kép, chính là sản phẩm của PCR [3].
Ứng dụng
Phương pháp PCR đã được ứng dụng bởi Fiona và cộng sự (2007) để phát hiện RLB gây bệnh sữa trên loài cua châu Âu. DNA làm nguyên liệu cho phản ứng PCR được tách chiết từ khoảng 300 µl hemolymph cua bị bệnh sữa sử dụng bộ kít GenElute bacterial genomic DNA kit. Cặp mồi 27f (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'), 1387r (5'-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3') được sử dụng trong phản ứng này. Bằng phản ứng PCR, khuếch đại và giải trình tự đoạn gen 16S rRNA và sử dụng kỹ thuật lai, nhóm nghiên cứu đã xác định tác nhân gây bệnh sữa trên loài cua này thuộc nhóm
-proteobacteria, bộ Rickettsiales [28].
1.3.6. Một số phương pháp phân loại vi sinh vật 1.3.6.1. Phân loại theo phương pháp cổ điển 1.3.6.1. Phân loại theo phương pháp cổ điển
Phương pháp phân loại cổ điển dựa trên các đặc điểm về hình thái, sinh lí-sinh hóa.
Các đặc điểm hình thái như kích thước, hình dạng, màu sắc của khuẩn lạc, hình dạng, kích cỡ của tế bào vi sinh vật; cách sắp xếp của tế bào (đơn, kép hay dạng chùm, dạng chuỗi ...); khả năng bắt màu khi nhuộm Gram; các đặc điểm vi cấu trúc như có tiên mao, tiêm mao hay không, số lượng của tiên mao, tiêm mao, cách thức di chuyển của tế bào; hình dạng và vị trí của các cơ quan trong tế bào ...
Các đặc điểm về sinh lý và trao đổi chất như nguồn năng lượng, nguồn cacbon và nitơ mà sinh vật sử dụng, kiểu dinh dưỡng, các sản phẩm lên men, giới hạn về nhiệt độ và nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng và phát triển; dải pH và pH tối thích cho sinh trưởng, các sản phẩm trao đổi thứ cấp ...
Khóa phân loại vi khuẩn của Bergey là ví dụ điển hình của phương pháp phân loại vi sinh vật theo phương pháp truyền thống, khóa phân loại này hiện vẫn đang được cập nhật và được nhiều nhà vi sinh vật sử dụng.
1.3.6.2. Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử
Phân loại bằng sinh học phân tử là phương pháp mới nhưng có độ chuẩn xác cao. Phương pháp này có thể phát hiện mô tả và giải thích tính đa dạng sinh học ở mức phân tử và quan hệ giữa các loài và trong phạm vi loài [1].
Bảng 1.1: Phân tích các thành phần hóa học của tế bào theo hệ thống hóa học Thành phần tế bào Phương pháp phân tích Phạm vi Phân loại Thành phần bazơ(%G+C) Chi
Biến tính DNA:DNA Loài
Các phần DNA được cắt bằng enzyme giới hạn DNA
nhiễm sắc thể
Đa hình chiều dài các đoạn giới hạn của RNA riboxome
Loài và dưới loài
Trình tự nucleotid RNA riboxom
Lai DNA: rRNA
Loài, chi và Trên chi
Trình tự amino acid Loài, chi và trên chi
So sánh bằng phản ứng huyết thanh
Các kiểu điện di
Loài và chi Protein
Điện di enzyme đa vị trí Các dòng trong loài Cấu trúc peptidoglycan Polysaccharid Thành tế bào Acid teichoic Loài và chi Acid béo Lipid phân cực Acid mycolic Màng Isoprenoid quinones Loài và chi
Ngày nay phương pháp phân loại vi khuẩn bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA đang được áp dụng phổ biến. Việc nghiên cứu phân tử rRNA là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ, tiến hóa của các vi sinh vật, vì rRNA có mặt ở tất cả các loại vi sinh vật, có khả năng xác định, có tính bảo thủ cao, chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm vi sinh vật. Tuy nhiên, dựa
vào sự khác nhau này, người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại vi sinh vật.
Trong ba gen mã hóa rRNA của vi khuẩn 5S rRNA, 16S rRNA và 23S rRNA thì gen 16S rRNA là phù hợp nhất cho việc nghiên cứu phân loại hiện nay. Gen mã hóa 5S rRNA có kích thước khoảng 120 nucleotid, do có kích thước nhỏ nên thông tin chứa đựng ít do đó khó phân biệt được chính xác sự khác nhau giữa chi, giữa loài và trong loài của vi sinh vật cũng như vị trí phân loại của chúng. Gen mã hóa 23S rRNA có kích thước khoảng 2900 bp quá lớn cho nên không thuận lợi cho tách dòng, xác định trình tự và phân loại vi khuẩn. Gen mã hóa 16S rRNA có kích thước khoảng 1500 nucleotid vừa đủ để phân loại chi tiết giữa các chủng vi sinh vật không gây khó khăn trong các bước xác định trình tự gen và được ưu tiên chọn lựa trong phân loại vi khuẩn.
Cấu trúc của gen mã hóa 16S đã được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ và đã