Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của bò sữa chậm sinh và ứng dụng hormone để khắc phục

MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết Chăn nuôi bò sữa ở Việt Nam bắt đầu phát triển từ những năm 1960 và trở thành ngành sản xuất hàng hóa vào những năm 1990. Từ năm 1986 đến 1999, đàn bò sữa tăng trưởng trung bình 11% /năm. Năm 2001, Chính phủ đã có chủ trương đẩy mạnh phát triển ngành sữa của Việt Nam với Quyết định 167/2001/QĐ/TTg về “Một số chính sách phát triển chăn nuôi bò sữa trong giai đoạn 2001-2010”. Do đó, năm 2001 Việt Nam có 41.241 con, năm 2002 là 55.848 con, tăng trưởng đạt 35,42%/ năm; giai đoạn 2001-2005 tăng 41,89%, năm 2011 đạt 122.000 con và năm 2013 đạt 186.390 con, tăng 19,56%/năm. Dự báo đến năm 2015 đạt 291.646 con (tăng 15%) và đến năm 2020 lên 469.700 con (Hoàng Kim Giao, 2014). Để đạt được 469.700 con vào năm 2020, các nhà kỹ thuật và người chăn nuôi cần phải làm gì ?. Bò sữa ở nước ta chủ yếu là con lai HF (Holstein Friesian × Lai Zebu) chiếm trên 60%, còn lại là bò HF (Holstein Friesian) thuần. Bò HF thuần chủ yếu được nuôi tập trung với quy mô lớn ở một số doanh nghiệp, công ty lớn như: Công ty cổ phần giống bò sữa Mộc Châu Sơn La, Công ty cổ phần sữa Vinamilk (Tuyên Quang, Nghệ An…), Công ty cổ phần thực phẩm sữa TH (Nghệ An), Công ty cổ phần sữa Đà Lạt milk… Riêng với bò lai HF, 60% tổng đàn được nuôi trong nông hộ, gia trại với quy mô vừa và nhỏ (từ 5-20 con) trên khắp các vùng trong cả nước. Tuy nhiên, phía Nam nuôi tập trung ở vùng thành phố Hồ Chí Minh, miền Đông Nam bộ và đồng bằng sông Cửu Long…, phía Bắc nuôi tập trung ở vùng thành phố Hà Nội, Hưng Yên, Vĩnh Phúc… Có hai phương thức chăn nuôi chủ yếu là nuôi nhốt hoặc bán chăn thả. Năng suất sữa của đàn bò khá cao, từ 4.200 - 4.500 kg/chu kỳ, nhiều cá thể đạt trên 5.000 kg/chu kỳ. Chăn nuôi bò sữa thực sự đã đem lại hiệu quả kinh tế cao cho người chăn nuôi. Tuy nhiên hình thức chăn nuôi nhỏ lẻ, phân tán, trình độ hiểu biết về kỹ thuật chăn nuôi còn hạn chế; điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng, khẩu phần thức ăn xanh không đầy đủ, thiếu cân đối; phụ thuộc nhiều vào “thời vụ”; đồng cỏ chăn thả, bãi chăn hầu như không có đã làm ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sinh sản cũng như sức sản xuất sữa của đàn bò. Bình thường bò sữa có tuổi động dục lần đầu từ 16-18 tháng tuổi và sau khi đẻ động dục trở lại trong vòng 90 ngày. Những bò đẻ xong từ 91 đến 119 ngày mới động dục lại được coi là chậm sinh độ 2. Còn bò tơ trên 20 tháng và bò sau khi đẻ đến 120 ngày (4 tháng) hoặc bò phối giống trên 3 lần mà không đậu thai được coi là chậm sinh (Hoàng Kim Giao và Nguyễn Thanh Dương, 1997). Đối với bò sữa vùng Ba Vì, Hà Nội nói riêng và cả nước nói chung, trong điều kiện chăn nuôi nông hộ, các chỉ tiêu sinh sản thường không ổn định như: tuổi động dục lần đầu cao, phối giống nhiều lần không đậu thai, khoảng cách hai lứa đẻ dài, tỷ lệ viêm nhiễm đường sinh dục cao, bệnh sát nhau xảy ra nhiều (Trịnh Quang Phong và cs., 2012). Việc đánh giá đúng thực trạng hoạt động sinh sản thông qua các chỉ tiêu về sinh lý sinh sản của bò sữa là cách giúp chúng ta có thể nhìn nhận khách quan hơn cũng như có biện pháp tác động hiệu quả hơn. Những yếu tố gây ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của đàn bò sữa đó là: giống, thức ăn, chăm sóc nuôi dưỡng, mùa vụ, thời điểm phát hiện động dục, kỹ thuật phối giống, kỹ thuật chẩn đoán bệnh trên buồng trứng và phương pháp can thiệp các bệnh về sinh sản... Do đó, nghiên cứu để xác định đúng những nguyên nhân làm hạn chế khả năng sinh sản của bò sữa là việc làm cần thiết. Hoạt động sinh sản của gia súc mang tính chu kỳ và chịu sự điều tiết của hệ thần kinh và thể dịch. Yếu tố thần kinh điều khiển hoạt động có “định hướng”, còn yếu tố thể dịch tác động theo hướng bản năng sinh học thông qua sự hoạt động có tính quy luật của các hormone hướng sinh sản như: Follicle Stimulating Hormone (FSH), Luteinizing Hormone (LH), Gonadotropin Releasing Hormone (GnRH), Prostaglandin (PG), Progesterone… Trong số các hormone này, progesterone có ảnh hưởng nhiều đến hoạt động của buồng trứng. Việc xác định được hàm lượng hormone progesterone trong cơ thể bò cái là xác định được trạng thái hoạt động của buồng trứng, làm căn cứ để cải thiện khả năng sinh sản của chúng. Hướng này đang được nhiều nước quan tâm. Việc đánh giá tình trạng hoạt động của buồng trứng cũng như sử dụng các chế phẩm hormone hướng sinh dục để điều khiển nâng cao khả năng sinh sản của bò sữa theo ý muốn đã được nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước nghiên cứu, áp dụng có hiệu quả. Đối với ngành chăn nuôi bò sữa, việc rút ngắn tuổi động dục lần đầu, rút ngắn khoảng cách giữa hai lứa đẻ, tăng số con được sinh ra đồng nghĩa với tăng sản lượng sữa trong một đời con cái. Ngoài ý nghĩa kinh tế, tăng khả năng sinh sản cũng có nghĩa tăng nhanh số lượng đàn giống, tái sản xuất mở rộng... Đàn bò sữa lai HF vùng Ba Vì nói riêng và thành phố Hà Nội nói chung được chăn nuôi chủ yếu trong nông hộ, đã có những yếu tố không thuận lợi làm ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của đàn bò này, nhưng mức độ tốt hay xấu, những yếu tố nào đã ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của chúng và giải pháp nào có thể khắc phục hiện tượng chậm sinh cho đàn bò sữa là vấn đề được đặt ra. 2. Mục tiêu đề tài Đánh giá được thực trạng sinh sản của đàn bò sữa nuôi tại Ba Vì, Hà Nội và tình trạng hoạt động của buồng trứng ở bò chậm sinh, từ đó giúp cho người chăn nuôi có được thông tin và hướng tác động đúng nhằm nâng cao hiệu quả chăn nuôi. Đánh giá được động thái của hormone progesterone trong những trường hợp buồng trứng hoạt động không bình thường (không hoạt động, u nang, thể vàng tồn lưu), giúp cho việc chẩn đoán và điều trị bệnh sinh sản có hiệu quả. Sử dụng một số hormone hướng sinh sản điều trị bệnh buồng trứng không hoạt động, buồng trứng bị u nang và buồng trứng có thể vàng tồn lưu... để nâng cao khả năng sinh sản của bò sữa.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TĂNG XUÂN LƯU NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BÒ SỮA CHẬM SINH VÀ ỨNG DỤNG HORMONE ĐỂ KHẮC PHỤC LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH: SINH SẢN VÀ BỆNH SINH SẢN GIA SÚC HÀ NỘI, 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TĂNG XUÂN LƯU NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BÒ SỮA CHẬM SINH VÀ ỨNG DỤNG HORMONE ĐỂ KHẮC PHỤC CHUYÊN NGÀNH: SINH SẢN VÀ BỆNH SINH SẢN GIA SÚC Mã số: 62.64.01.06 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TSKH CÙ XUÂN DẦN PGS.TS TRẦN TIẾN DŨNG HÀ NỘI, 2015 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tôi, kết nghiên cứu trình bày luận án trung thực, khách quan chưa dùng bảo vệ để lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận án cảm ơn, thơng tin trích dẫn luận án rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Tác giả luận án Tăng Xuân Lưu i LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo, cô giáo Học viện Nông nghiệp Việt Nam, người giảng dạy dìu dắt tơi suốt hai năm học cao học đồng thời tạo điều kiện để tiếp tục học tập, nghiên cứu hoàn thành luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến GS.TSKH Cù Xuân Dần PGS.TS Trần Tiến Dũng, hai thầy hướng dẫn khoa học, tận tình động viên, giúp đỡ sống trình hồn thành luận án Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ban lãnh đạo toàn thể cán cơng nhân viên Trung tâm Nghiên cứu Bị Đồng cỏ Ba Vì - Viện Chăn ni, quan công tác tạo điều kiện thuận lợi để tơi vừa hồn thành nhiệm vụ cơng việc, vừa hồn thành cơng trình nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn đơn vị sau nhiệt tình giúp đỡ tơi hồn thành luận án này: - Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam - Bộ môn Ngoại sản, khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam - Bộ mơn Sinh lý, Sinh sản Tập tính vật ni, Viện Chăn nuôi - Trung tâm Phát triển chăn nuôi Hà Nội - Văn phòng tổ chức Jica – Viện Chăn ni Xin cảm ơn gia đình người thân động viên, tạo điều kiện cho suốt q trình cơng tác hồn thành luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Tác giả luận án Tăng Xuân Lưu ii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục ảnh viii Danh mục hình, sơ đồ ix MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết Mục tiêu đề tài 3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Những đóng góp luận án Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cơ sở khoa học việc nghiên cứu đặc điểm sinh sản bò 1.1.1 Đặc điểm sinh lý sinh sản bò 1.1.2 Sự điều hòa hoạt động sinh dục tuyến nội tiết 13 1.1.3 Hormone tuyến yên vai trò chúng sinh sản 15 1.1.4 Hormone buồng trứng, thai prostaglandin sinh sản 16 1.1.5 Đặc tính sinh học hormone sinh sản 17 1.1.6 Vai trò số hormone gia súc 17 1.2 Progesterone ứng dụng sinh sản 19 1.2.1 Vai trò progesterone 19 1.2.2 Progesterone hoạt động buồng trứng 24 1.2.3 Progesterone ứng dụng chăn nuôi 25 1.2.4 Định lượng progesterone để chẩn đốn có thai sớm 26 1.3 Một số nghiên cứu nước đặc điểm sinh sản điều tiết sinh sản bị có liên quan đến luận án 28 1.3.1 Những nghiên cứu nước 28 iii 1.3.2 Những nghiên cứu Việt Nam 31 Chương PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.1 Vật liệu, nội dung phương pháp nghiên cứu 37 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 37 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 37 2.1.3 Phương pháp nghiên cứu 38 2.2 Xử lý số liệu 47 2.3 Địa điểm nghiên cứu 47 2.4 Thời gian nghiên cứu 48 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49 3.1 Tình hình sinh sản đàn bị sữa vùng Ba Vì, Hà Nội 49 3.1.1 Tuổi phối giống lần đầu, tuổi đẻ lần đầu 49 3.1.2 Khối lượng thể bò đẻ lần đầu 53 3.1.3 Thời gian mang thai đàn bò sữa qua lứa đẻ 54 3.1.4 Thời gian động dục lại sau đẻ 56 3.1.5 Khoảng cách hai lứa đẻ 60 3.1.6 Tỷ lệ đẻ, sẩy thai, đẻ non, sát 63 3.1.7 Hệ số phối giống tỷ lệ thụ thai 65 3.1.8 Hiện tượng chậm sinh (rối loạn sinh sản) 67 3.2 Đánh giá tình trạng hoạt động buồng trứng bị sau đẻ 71 3.2.1 Động dục trở lại bò sữa đến 120 ngày sau đẻ 71 3.2.2 Nguyên nhân gây chậm động dục sau 120 ngày sau đẻ buồng trứng 73 3.2.3 Ảnh hưởng mùa vụ đến chức buồng trứng sau đẻ 77 3.2.4 Ảnh hưởng lứa đẻ đến chức buồng trứng 80 3.2.5 Ảnh hưởng thể trạng bò đến chức buồng trứng bò sữa sau đẻ 82 3.3 Định lượng progesterone phát bệnh buồng trứng chẩn đoán thai sớm nhằm nâng cao khả sinh sản bò sữa 84 3.3.1 Kết chẩn đoán nguyên nhân chậm sinh khám qua trực tràng 85 3.3.2 Kết chẩn đoán bệnh buồng trứng định lượng progesterone sữa 86 iv 3.3.3 Chẩn đốn có thai sớm định lượng progesterone sữa 90 3.4 Sử dụng hormone nhằm nâng cao khả sinh sản 92 3.4.1 Điều trị bệnh buồng trứng không hoạt động 92 3.4.2 Điều trị bệnh u nang buồng trứng 94 3.4.3 Điều trị bệnh thể vàng tồn lưu 96 3.4.4 Điều trị bị chậm sinh khơng rõ ngun nhân phác đồ tổng hợp (GnRH- PGF2α- PGF2α- GnRH) 98 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 102 Kết luận 102 Kiến nghị 104 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH Đà CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 105 TÀI LIỆU THAM KHẢO 106 PHỤ LỤC 117 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt AC ATP BCS CIDR InsP3 DAG EIA / ELISA FRH FAO FSH GTP GDP GHRF GnRH Ý nghĩa Adenylate Cyclase Adenosine Triphosphate Body Condition Score Controlled internal drug release Inositol triphosphat Diacylglycerol Enzyme ImmunoAssay/ Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Follitropin-Releasing Hormone Food and Agriculture Organization Follicle Stimulating Hormone Guanosine triphosphate Guanosine diphosphate Growth-Hormone-Releasing Factor Gonadotropin-Releasing Hormone h2 hCG HF HTNC IGF-1 IU THI LRH LH LTH ME P4 PG PRID Heritability (hệ số di truyền) Human Chorionic Gonadotropin Holstein Friesian Huyết ngựa chửa Insulin-like Growth Factor-1 International Unit Temperature humidity index Luteinizing Releasing Hormone Luteinizing Hormone LuteinTrofic Hormone Metabolizable Energy Progesterone (pregn-4-ene-3,20-dione) Prostaglandin Progesterone internal drug release PGF2a PRLH VDM Prostaglandin F2α Prolactin-Releasing Hormone Viet Nam dairy management vi DANH MỤC BẢNG Tên bảng STT 2.1 Trang Phương pháp chẩn đoán lâm sàng bệnh buồng trứng sau khám qua trực tràng hai lần liên tục cách đến 10 ngày 44 3.1 Tuổi phối giống lần đầu, tuổi đẻ lứa đầu 49 3.2 Khối lượng thể bò đẻ lần đầu 53 3.3 Thời gian mang thai qua lứa đẻ 55 3.4 Thời gian động dục lại sau đẻ 57 3.5 Khoảng cách hai lứa đẻ 60 3.6 Tỷ lệ đẻ, sẩy thai, đẻ non sát 63 3.7 Hệ số phối giống tỷ lệ thụ thai 65 3.8 Kết phân loại tượng chậm sinh 68 3.9 Kết theo dõi động dục trở lại bò sữa đến 120 ngày sau đẻ 72 3.10 Các nguyên nhân buồng trứng gây chậm động dục bò sữa 73 3.11 Ảnh hưởng mùa vụ đến chức buồng trứng 78 3.12 Yếu tố lứa đẻ ảnh hưởng đến hoạt động buồng trứng 80 3.13 Ảnh hưởng thể trạng bò đến chức hoạt động buồng trứng 82 3.14 Chẩn đoán lâm sàng bệnh buồng trứng khám qua trực tràng 85 3.15 Kết định lượng progesterone sữa bò chậm động dục vòng 120 ngày 86 3.16 Chẩn đoán thai sớm định lượng progesterone sữa 90 3.17 Kết điều trị bệnh buồng trứng không hoạt động 93 3.18 Kết điều trị bệnh u nang buồng trứng 95 3.19 Kết điều trị thể vàng tồn lưu 97 3.20 Kết điều trị bị chậm sinh khơng rõ ngun nhân phác đồ tổng hợp 99 vii DANH MỤC ẢNH STT Tên hình ảnh Trang 3.1 Bị đẻ sớm bị strees nhiệt 56 3.2 Buồng trứng hoạt động 74 3.3 U nang nang trứng thể vàng tồn buồng trứng 74 3.4 U nang thể vàng 75 3.5 Thể vàng sinh lý (bên trái), thể vàng tồn lưu (bên phải) 75 3.6 Thể vàng sinh lý ngày thứ 5-6 chu kỳ 87 3.7 Buồng trứng không hoạt động (thiểu năng) 88 3.8 U nang buồng trứng dạng tích nước 88 3.9 Thể vàng bị có thai 35- 60 ngày tuổi 91 viii Kiểm tra trạng thái hoạt động buồng trứng qua trực tràng Phân tích P4 phịng thí nghiệm Dụng cụ đặt âm đạo Vòng Prid 123 Vòng Cird Vòng Cird Vòng CUEMETE Thao tác tiêm đặt vòng Cird cho bò 124 Một số chế phẩm hormone dùng điều trị chậm sinh bò Dụng cụ hỗ trợ phát động dục bò - đo điện trở âm đạo 125 Phối giống cho bị thí nghiệm Chẩn đốn có thai siêu âm bê sinh từ can thiệp chậm sinh Bằng lễ trao giải thưởng cho tác giả thành phố Hà Nội về: Giải pháp hữu ích sinh sản bò sữa, bò thịt năm 2014 126 II PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG HORMONE PROGESTERONE Phương pháp lấy mẫu 1.1 Lấy mẫu máu - Thời gian lấy mẫu vào buổi sáng; - Lấy máu tĩnh mạch cổ động mạch đuôi xi lanh 5ml kim 18G vô trùng, lần lấy 3-5ml máu; - Đựng máu ống nghiệm vô trùng có chứa sẵn chất chống đơng; - Bảo quản mẫu hộp đá chuyển phịng thí nghiệm thời gian không sau lấy 1.2 Lấy mẫu sữa Thời gian lấy mẫu vào buổi sáng: vắt sữa vào xơ, thùng lắc đều, sau lấy 10 ml/con ống nghiệm vô trùng; bảo quản mẫu sữa đá lạnh (hộp xốp đá) chuyển đến phịng thí nghiệm vịng sau lấy Nguyên lý phương pháp ELISA định lượng progesterone phịng thí nghiệm Phương pháp ELISA định lượng progesterone đề tài nghiên cứu dựa nguyên lý phản ứng cạnh tranh gián quy trình Tổ chức nghiên cứu khoa học động vật, trường Đại học tổng hợp Hiroshima, Nhật Bản Các bước tiến hành sau: - Cho vào giếng nhựa gắn trước kháng kháng thể đặc hiệu progesterone: + Một lượng mẫu định có chứa progesterone cần chẩn đốn + Một lượng định dung dịch progesterone gắn enzyme (Horse Radish Peroxydase) + Một lượng kháng thể đặc hiệu kháng progesterone - Để cho trình gắn progesterone-kháng thể-kháng kháng thể xảy ra, ta đem ủ giếng thời gian định sau đổ bỏ dung dịch giếng rửa để loại bỏ phần không gắn kết - Cho chất vào giếng ủ lần thứ hai để tạo phản ứng cạnh tranh Phản ứng cạnh tranh chất enzyme tạo màu cho dung dịch 127 Kháng kháng thể P4 Kháng th khỏng P4 P4 đà gắn enzyme Hỡnh 1.1 C chế cạnh tranh progesteroneC¬ chÊt phản ứng ELISA (OPD) Căn vào mức độ biểu màu dung dịch cần định lượng so với màu dãy dung dịch chuẩn, nhận biết nồng độ progesterone thông qua quan sát khác màu sắc dung dịch giếng mắt thường máy so màu quang phổ Lượng progesterone gắn enzyme lượng progesterone có mẫu cần định lượng có mối tương quan tỷ lệ nghịch gắn kháng thể giếng Nồng độ progesterone mẫu cần phân tích cao có progesterone-enzyme gắn vào kháng thể giếng, màu phản ứng có chất vào giếng nhạt (Hình 1.2) NẾU NỒNG ĐỘ P4 TRONG MÁU CAO NẾU NỒNG ĐỘ P4 TRONG MÁU CAO Mẫu Mẫu Rửa bỏ phần khơng gắn OPD (0-Phenylenalamine) HRA-P4 HRA-P4 Nhạt màu Hình 1.2 Trường hợp nồng độ progesterone máu cao 128 Nếu nồng độ progesterone mẫu cần phân tích thấp, có nhiều progesterone-enzyme gắn vào kháng thể giếng, màu phản ứng cho chất vào giếng sẫm màu (Hình 1.3) NẾU NỒNG ĐỘ P4 TRONG MÁU THẤP NẾU NỒNG ĐỘ P4 TRONG MÁU THẤP Mẫu MÉu Rửa bỏ phần không gắn OPD (0-Phenylenalamine) HRA-P4 HRA-P4 Sẫm màu Hình 1.3 Trường hợp nồng độ progesterone máu thấp 2.1 Các bước tiến hành phản ứng ELISA Bước 1: Chuẩn bị - Chuẩn bị thiết bị phục vụ (Bảng 1) - Chuẩn bị hoá chất (Bảng 2) - Chuẩn bị dụng cụ: + Pipét loại + Đĩa nhựa có giếng, đĩa chứa 96 giếng; ống nghiệm, cốc thuỷ tinh - Chuẩn bị Kít định lượng: Bộ Kít chuẩn phản ứng ELISA để định lượng progesterone bao gồm: + Kháng kháng thể progesterone (Second antibody): kháng thể dễ kháng lại kháng thể (IgG) thỏ, sản phẩm trường Đại học tổng hợp Hiroshima (Nhật Bản) sản xuất + Kháng thể kháng progesterone (First antibody) + Progesterone gắn enzyme HRP_P4 (Horse Radish Peroxydase Progesterone) - Chuẩn bị mẫu định lượng: Mẫu để phân tích hàm lượng progesterone huyết (được lấy từ máu) sữa 129 + Phương pháp lấy mẫu huyết thanh: Chọn đối tượng gia súc cần kiểm tra, lấy 5-10ml máu từ tĩnh mạch cổ đuôi vào buổi sáng sớm chiều tối Huyết cần tách khỏi máu sớm tốt sau bảo quản nhiệt độ lạnh sâu (-300C) Có hai phương pháp tách huyết thanh: Cách thứ nhất: Máu sau lấy khỏi tĩnh mạch, để ống nghiệm vị trí cố định, sau thời gian phía ống nghiệm xuất phần dịch màu vàng, phía bên phần kết tủa tế bào máu Gạt bỏ lớp gellatin bề mặt lớp dịch hút lấy phần dịch lỏng màu vàng mẫu huyết cần định lượng Cách thường áp dụng để lấy huyết ngựa Cách thứ hai: Lấy máu từ tĩnh mạch cho vào ống nghiệm, bổ sung thêm 20ml Heparin lắc cho tan sau đưa lên máy ly tâm 3.000 vòng/phút để tách huyết tương Huyết tương thu đem bảo quản nhiệt độ lạnh sâu (-300C) + Đối với mẫu sữa, bảo quản K2Cr2O8 sau ly tâm (3.000 vịng/phút) để tách bơ khỏi sữa Bước 2: Làm phản ứng ELISA Phản ứng ELISA thực giếng đĩa nhựa cứng, đĩa có 96 giếng Q trình phản ứng trải qua ba giai đoạn: Gắn kháng thể vào giếng nhựa, tạo phản ứng kết hợp đặc hiệu kháng kháng thể-kháng thể-kháng nguyên phản ứng cạnh tranh enzyme với chất * Giai đoạn gắn kháng thể vào giếng (hay gọi “coat” đĩa hay “cốt” giếng): - Pha lỗng kháng kháng thể đến nồng độ 4l/ml dung dịch đệm carbonat (Carbonate buffer) - Cho 100l kháng kháng thể pha loãng vào giếng đĩa nhựa (giếng chưa sử dụng) - Ủ giếng nhựa có chứa kháng kháng thể nhiệt độ phòng 48 giờ, thời gian kháng kháng thể bám vào bề mặt đáy thành giếng 130 Lưu ý: Để tránh tượng bay dung dịch giếng, sau cho kháng kháng thể vào giếng, sử dụng miếng film dính dán kín mặt đĩa nhựa miệng giếng - Sau 48 lấy đĩa nhựa ra, bóc miếng film dán bề mặt, đổ bỏ dung dịch giếng, rửa ba lần giếng nhựa dung dịch nước sinh lý - Cho vào giếng nhựa 200l dung dịch Blocking, dán film dính lên mặt đĩa tiếp tục ủ nhiệt độ phòng 24 Trong thời gian dung dịch Blocking gắn chặt kháng kháng thể vào đáy thành giếng - Sau ủ xong 24 giờ, đổ bỏ dung dịch giếng Làm khơ giếng đĩa nhựa nhiệt độ phịng sau dùng film dính dán kín để tránh hút ẩm đem bảo quản 40C chuẩn bị cho phản ứng ELISA Lưu ý: Các giếng làm khơ hồn tồn kháng kháng thể gắn chặt vào đáy thành giếng * Giai đoạn tạo phản ứng kết hợp đặc hiệu kháng kháng thể - kháng thể kháng nguyên: - Tách Progesterone khỏi mẫu: + Tráng ống nghiệm dung dịch hỗn hợp cồn Methanol Diethyl ether với tỷ lệ pha trộn 1:1 (1ml hỗn hợp cho ống nghiệm) Để khô ống nghiệm tủ sấy + Lấy ống nghiệm tủ sấy ra, cho vào ống 100l huyết + Cho thêm 3ml Petrolium ether, đậy nắp ống nghiệm lắc máy Sheker thời gian 10 phút (có thể lắc tay 30 lần sau đưa vào máy lắc nhỏ Vortex thời gian phút) cho progesterone hoà tan hết petrolium ether + Mở nắp để cố định ống nghiệm vòng 10 phút cho phần không tan lắng hết xuống đáy + Để ống nghiệm theo chiều thẳng đứng ngâm cồn lạnh (cồn Methanol 50%) 30oC thời gian 1-3 phút để phần không tan đáy ống nghiệm đơng cứng lại + Đổ phần dung dịch có ether phía sang ống nghiệm khác 131 + Ngâm ống nghiệm có dung dịch chứa ether vào cốc nước, nâng từ từ nhiệt độ nước lên 60oC để dầu ether bay hết Lúc ống nghiệm lại progesterone bám vào thành đáy ống nghiệm + Cho vào ống nghiệm 100l dung dịch Assay buffer, lắc kỹ máy Vortex thời gian phút để progesterone hoà tan dung dịch đệm thu dung dịch mẫu cần định lượng - Thực phản ứng kết hợp đặc hiệu theo chế cạnh tranh + Cho vào giếng 50l dung dịch mẫu dung dịch chuẩn + Cho vào giếng 5l dung dịch HRP-P4 (progesterone gắn enzyme) + Cho thêm vào giếng 50l dung dịch kháng thể progesterone + Dùng film dính dán kín miệng giếng để tránh bay đồng thời đưa đĩa nhựa lên máy Vortex lắc nhẹ vòng phút + Đem giếng ủ nhiệt độ phòng thời gian ủ qua đêm tủ lạnh 4oC Lưu ý: Vì thí nghiệm địi hỏi độ xác cao nên mẫu cần lặp lại lần (mỗi mẫu làm vào giếng) theo sơ đồ sau: 10 11 12 A S1 S1 1 9 17 17 25 25 33 33 B S2 S2 2 10 10 18 18 26 26 34 34 C S3 S3 3 11 11 19 19 27 27 35 35 D S4 S4 4 12 12 20 20 28 28 36 36 E S5 S5 5 13 13 21 21 29 29 37 37 F S6 S6 6 14 14 22 22 30 30 38 38 G H H 7 15 15 23 23 31 31 39 39 H L L 8 16 16 24 24 32 32 40 40 Ghi chú: - Các giếng nhựa cột dọc chứa mẫu chuẩn để so sánh, đó: S1-S2: Dãy dung dịch progesterone chuẩn có nồng độ (ng/ml) là: 0; 0,1; 0,3; 1; 3; 10 (ng/ ml) 132 H: Mẫu chuẩn có nồng độ progesterone cao L: Mẫu chuẩn có nồng độ progesterone thấp H L ln đo lần thí nghiệm nhằm tính hệ số sai khác độ lệch chuẩn lần thí nghiệm - Các giếng cịn lại có số từ đến 40 thuộc cột dọc từ đến 12 mẫu chứa progesterone cần định lượng, mẫu giếng đánh số thứ tự giống * Giai đoạn thực phản ứng cạnh tranh enzyme chất - Đổ bỏ dung dịch giếng sau ủ, rửa giếng nước cất để loại bỏ phần không kết hợp - Cho vào giếng 150l dung dịch OPD (cơ chất) - Ủ giếng thời gian 30 phút nhiệt độ phòng để phản ứng chất enzyme xảy - Cho vào giếng 50l dung dịch H2SO4 6N để dừng phản ứng, lúc màu dung dịch giếng chuyển từ màu vàng sang màu da cam - Đưa đĩa vào đầu đọc để đọc màu quang phổ kế với bước sóng 490nm Từ kết thu được, tiến hành vẽ đường cong chuẩn biểu thị mối tương quan mật độ quang học (Optical Density-OD) với nồng độ dãy dung dịch chuẩn Đường cong có dạng sau: 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0 0,1 1,0 10 Nồng độ progesterone (ng/ml) 133 100 Đại lượng biểu thị mật độ quang học tỷ lệ nghịch với đại lượng biểu thị nồng độ progesterone có mẫu cần đo Khi giá trị đại lượng biểu thị mật độ quang học cao nồng độ progesterone mẫu thấp ngược lại Đối chiếu kết mật độ quang học với đường cong chuẩn biểu thị nồng độ progesterone dãy dung dịch chuẩn để xác định nồng độ progesterone mẫu cần định lượng Bảng 1: Các thiết bị phục vụ cho phản ứng ELISA Tên thiết bị Chức Ly tâm mẫu để tách huyết Máy ly tâm (Centrifuge) máu tách bỏ bơ sữa Tủ lạnh sâu (Frizer) Bảo quản mẫu kháng thể Tủ lạnh dương (Refrigerator) Bảo quản Kít hố chất 40C Máy rửa siêu âm (Ultrasonic washer) Rửa ống nghiệm Tủ sấy (Dryer) Sấy ống nghiệm Máy lắc lớn (Shaker) nhỏ (Vortex) Lắc dung dịch mẫu cho tan Quang phổ kế (Opsys MRTM DYNEX) Đo mật độ quang học phản ứng tạo màu Máy tính có phần mềm điều kèm máy vi tính khiển quang phổ kế Bảng 2: Hoá chất cho phản ứng ELISA Số TT Cơng thức hóa chất (C2H2)2O CH3OH C2H5OH 134 III Phương pháp phát động dục phối giống cho bị thí nghiệm (Phương pháp Saito cộng sự, 1992) Phương pháp quan sát mắt thường (căn vào triệu chứng động dục bị cái) Chu kì động dục bò từ 19-22 ngày (chủ yếu 21 ngày), thời gian bị có biểu động dục bên ngồi quan sát từ 1-2 ngày, gọi thời gian động dục chia giai đoạn: - Giai đọan trước động dục đứng yên (hay trước chịu đực): Bò có biểu sau: + Ngửi bị khác, tâm trạng bồn chồn, lại để tìm kiếm bị bò đực khác; + Cố nhảy lên khác khơng đứng n bị bị khác bị đực nhảy lên lưng; + Thích gần người, gần bò khác thường lệ; + Thỉnh thoảng kêu rống lên; + Âm hộ ướt, đỏ phồng lên (phù nề); + Bò giảm ăn, sữa giảm; + Đi lại nhiều; Các biểu giai đoạn thay đổi nhiều khơng giống bị điều kiện chăm sóc - Giai đọan động dục đứng yên (chịu đực): kéo dài khoảng 10-19 bò có biểu sau: + Đứng n cho bị khác nhảy lên lưng mà không nhảy lên lưng khác; + Bồn chồn kêu rống thường xuyên, thích ngửi quan sinh dục bò khác; + Tai dựng lên, dễ gần hơn; + Lưng cong lên, phần thắt lưng lõm xuống, xương khum cong lên; + Âm hộ phồng lên dịch nhờn tiết (lúc đầu dịch tiết lỏng, sau dịch đặc lại kéo thành sợi dài 20-30 cm màu trắng đục; + Tính thèm ăn giảm, sản lượng sữa giảm; + Thân nhiệt cao bình tường (10C); 135 + Đứng yên bị khác nhảy lên lưng bị vỗ vào mơng; + Điện trở âm đạo tăng cao so với bình thường; + Khi khám quan sinh dục thấy thân sừng tử cung bớt căng có độ đàn hồi; kiểm tra buồng trứng thấy nang trứng lên bề mặt Thời gian động dục đứng yên (thời gian chịu đực) phụ thuộc vào giống khí hậu Bị sữa, bị chun thịt, thời gian ngắn so với bị địa phương Bị HF ni xứ nóng thời gian chịu đực ngắn so với nuôi xứ lạnh - Giai đoạn sau động dục đứng yên (sau chịu đực) Sau giai đoạn động dục đứng yên, số bò tiếp tục hoạt động Những hoạt động chủ yếu thụ động có biểu sau: + Khơng cho khác nhảy lên lưng; + Ngửi bò khác bị bò khác ngửi; + Dịch keo đặc từ âm hộ dính lên mơng có màu nâu; Khoảng 2-3 ngày sau kết thúc giai đoạn động dục, nhiều bị quan sát thấy có máu chảy dịch nhầy từ âm hộ Điều sinh lý bình thường, khơng liên quan đến đậu thai hay rụng trứng, có ý nghĩa bị động dục trước 2-3 ngày * Thời điểm phối giống thích hợp Trong TTNT, thời điểm phối giống thích hợp từ nửa sau giai đoạn động dục đứng yên (chịu đực) khoảng sau kết thúc giai đoạn động dục đứng yên Cần phải kiểm tra thường xuyên để biết bò bắt đầu động dục Trong thực tế thường áp dụng quy tắc phối giống “sáng-chiều”, có nghĩa là: Nếu phát thấy bò giai đoạn động dục đứng yên vào sáng sớm phối giống vào buổi chiều ngày; bò động dục vào buổi chiều buổi tối phối giống vào sáng hơm sau Hình ảnh minh họa quy luật phối giống “sáng-chiều” thời gian động dục để phối giống 136 Điểm đổ tinh xác định điểm tiếp giáp cổ tử cung thân tử cung (mặt trước cổ tử cung mặt sau thân tử cung) Phương pháp phát bò động dục thí nghiệm Dùng phương pháp quan sát mắt thường kết hợp với đo điện trở âm đạo Căn vào triệu chứng động dục bò mơ tả kết hợp với sử dụng dụng cụ đo điện trở âm đạo thiết bị cộng hòa liên bang Đức (electronics in agriculture- estrous detecter) Thiết bị đo điện trở âm đạo bò phát bò động dục 137 ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TĂNG XUÂN LƯU NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BÒ SỮA CHẬM SINH VÀ ỨNG DỤNG HORMONE ĐỂ KHẮC PHỤC CHUYÊN NGÀNH: SINH. .. dùng giảng dạy, học tập, nghiên cứu ứng dụng thực tiễn sản xuất Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cơ sở khoa học việc nghiên cứu đặc điểm sinh sản bò 1.1.1 Đặc điểm sinh lý sinh sản bò 1.1.1.1 Sự thành... cứu đặc điểm sinh sản biện pháp kỹ thuật để nâng cao khả sinh sản bị Việc sử dụng kích tố hướng sinh sản để nâng cao khả sinh sản, khắc phục tượng chậm sinh, vô 31 sinh tạm thời nhà khoa học nước