Tuyển chọn vi khuẩn bacillus sinh enzyme phytase

Sơ bộ đánh khả năng sinh enzyme phytase của vi khuẩn phân lập được trên bã sắn...27 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN...28 3.1.. Các chủng vi khuẩn như: Bacillus, Lactobacillus

LỜI CẢM ƠN

Sau gần 3 tháng thực tập tại phòng vi sinh vật – Khoa Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Nha Trang, dưới sự hướng dẫn của TS.Nguyễn Minh Trí nên tôi đã hoàn thành tốt cuốn luận văn này

Qua đây tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Minh Trí người đã quan tâm và tận tình chỉ bảo cho tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp, cùng các cán bộ nghiên cứu phòng vi sinh vật, những người đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt nhiệm vụ của mình

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Nha Trang, cùng toàn thể các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ thực phẩm đã tận tình chỉ bảo và truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong những năm học vừa qua

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn tới gia đình cùng toàn thể bạn bè thân thiết, những người đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Nha Trang,tháng 6-2012

Sinh viên

Nguyễn Thị Thư Thảo

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Phytase 3

1.1.1 Định nghĩa 3

1.1.2 Phân loại 3

1.1.2.1 Dựa trên vị trí của nhóm phospho đầu tiên bị tác động 3

1.1.2.2 Dựa trên sự khác biệt về cấu trúc và đặc trưng thủy phân của phytase 4

1.1.3 Các nguồn thu nhận enzyme phytase 5

1.1.3.1 Nguồn vi sinh vật 5

1.1.3.2 Nguồn thực vật 6

1.1.3.3 Nguồn động vật 6

1.1.4 Cơ chất đặc hiệu của phyase 8

1.1.4.1 Acid phytic và phytat 8

1.1.4.2 Các cơ chất khác 9

1.1.5 Các đặc tính lý hóa của phytase 10

1.1.5.1 Cấu tạo và trọng lượng phân tử 10

1.1.5.2 Nhiệt độ 10

1.1.5.3 pH 11

1.1.5.4 Ảnh hưởng của các ion kim loại và một số chất hóa học lên hoạt độ phytase 11

1.1.6 Các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình sinh tổng hợp phytase ở vi sinh vật 12

1.1.7 Ứng dụng của enzyme phytase 13

1.1.7.1 Ứng dụng phytase trong sản xuât thức ăn gia súc, gia cầm 13

1.1.7.2 Ứng dụng phytase trong sản xuất thực phẩm 14

1.1.7.3 Ứng dụng phytase trong sản xuât myo-inositol phosphat 14

1.1.7.4 Ứng dụng phytase trong sản xuất bột giấy và công nghiệp giấy 15

1.2 Đại cương về Bacillus sinh enzyme phytase 15

1.2.1 Vài nét về Bacillus 15

1.2.2 Phân loại phytase của Bacillus 16

1.2.3 Cơ chất đặc hiệu 17

1.3.Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất ở Việt Nam 17

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng và vật liệu 18

2.1.1 Đối tượng 18

2.1.2 Vật liệu 18

2.1.2.1 Hóa chất 18

2.1.2.2 Thuốc nhuộm 18

2.1.2.3 Thiết bị 18

2.1.3 Môi trường nuôi cấy 19

2.1.3.1 Môi trường phân lập, giữ giống và nuôi cấy 19

2.1.3.2 Môi trường tăng sinh: môi trường BHB (g/l) 19

2.1.3.3 Môi trường nuôi cấy xác định khả năng sinh phytase 19

2.3.3.4 Môi trường để xác định các yếu tố ảnh hưởng (Nhiệt độ, pH, thời gian) 19

2.1.3.5 Cách chuẩn bị môi trường 20

2.2 Các phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus từ Natto 20

2.2.2 Phương pháp xác định khả năng sinh phytase 20

2.2.3 Phương pháp xác định hoạt độ phytase 21

2.2.3.1 Phương pháp định lượng phosphate (phương pháp Fiske và Subbarow) 21

2.2.3.2 Cách tính hoạt độ enzyme phytase 24

2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến enzyme phytase sinh ra 24

2.2.5 Khảo sát các ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến khả năng thủy phân hytate của enzyme phytase 25

2.2.5.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ phytase 25

2.2.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt độ phytase 26

2.2.6 Sơ bộ đánh khả năng sinh enzyme phytase của vi khuẩn phân lập được trên bã sắn 27

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Phân lập chủng Bacillus 28

3.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 28

3.3 Đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn 29

3.4 Nghiên cứu khả năng sinh enzyme phytase của các chủng Bacillus 31

3.5 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp phytase của Bacillus trên môi trường lỏng 32

3.5.1 Xây dựng đường chuẩn định lượng phospho 33

3.5.2 Khảo sát hoạt độ phytase của chủng Bacillus trên môi trường lỏng 34

3.5.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến enzyme phytase sinh ra 35

3.6 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến khả năng thủy phân phytate của enzyme phytase 36

3.6.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ phytase 36

3.6.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt độ phytase 37

3.7 Kết quả đánh giá sơ bộ khả năng thủy phân của enzyme phytase của vi khuẩn ở trên bã sắn 38

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Phân loại một số phytase 5

Bảng 1.2: Các nguồn cung cấp phytase 7

Bảng 1.3: Hàm lượng phytat và phospho trong các sản phẩm cây trồng 9

Bảng 2.1: Bảng dung dịch đường chuẩn 23

Bảng 2.2: Bảng xác định lượng phosphat trong dịch enzyme 23

Bảng 3.1: Đo đường kính của vòng phân giải của enzyme trong môi trường thạch 32

Bảng 3.2: Tương quan giữa giá trị ∆OD với hàm lượng phospho giá trị ∆OD700 với hàm lượng phospho 33

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Phản ứng thủy giải phytase bởi enzyme phytase 3

Hình 1.2: Phản ứng thủy giải 3-phytase 4

Hình 1.3: Phản ứng thủy giải 6-phytase 4

Hình 1.4: Cấu trúc acid phytic 8

Hình 2.1: Sơ đồ của quá trình phân lập vi khuẩn Bacillus từ Natto 20

Hình 2.2: Sơ đồ xác định khả năng sinh enzyme phytase 21

Hình 2.3: Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến enzyme phytase 24

Hình 2.4: Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ phytase 25

Hình 2.5: Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt độ phytase 26

Hình 3.1: Phân lập khuẩn lạc chủng Bacillus 28

Hình 3.2: Các chủng Bacillus phân lập được 29

Hình 3.3: Hình thái tế bào của chủng Bacillus 30

Hình 3.4: Hình thái tế bào của chủng Bacillus (có sinh bào tử) 30

Hình 3.5: 3 chủng vi khuẩn không xuất hiện vòng phân giải 31

Hình 3.6: Hoạt tính phân giải enzyme phytase của 3 chủng Bacillus 32

Hình 3.7: Đường biểu diễn sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ phospho và giá trị ∆OD700 33

Hình 3.8: Hoạt độ chung của phytase của 3 chủng Bacillus nuôi cấy trong môi trường lỏng, cơ chất cảm ứng là sodium phytase 34

Hình 3.9: Đường biến thiên hoạt độ phytase của B7 theo thời gian nuôi cấy 35

Hình 3.10: Đường biến thiên hoạt độ phytase của B7 theo nhiệt độ nuôi cấy 36

Hình 3.11: Đường biến thiên hoạt độ phytase của B7 theo pH nuôi cấy 37

OD : Độ hấp thụ của dung dịch (giá trị mật độ quang)

ODo : Giá trị mật độ quang của ống thử không

ODt : Giá trị mật độ quanh của ống thử thật

∆OD : Hiệu số mật độ quang (∆OD = ODt – ODo) đvhđ : Đơn vị hoạt độ

Từ xưa, con người đã biết ứng dụng những hoạt tính có lợi của vi sinh vật phục vụ cho đời sống của mình như là tạo ra các loại rượu nhờ quá trình lên men của vi sinh vật, tạo ra các loại thức ăn từ quá trình lên men như đậu tương lên men (natto) của Nhật, tạo ra loại nước giải khát lên men, các chế phẩm enzyme lấy từ vi sinh vật phục vụ cho trồng trọt, chăn nuôi

Ngày nay khi chúng ta đang sống ở thế kỷ XXI, thế kỷ của khoa học và kỹ thuật ngày càng phát triển thì công nghệ vi sinh càng ngày càng chứng tỏ được ưu thế của mình

Hiện nay đã có rất nhiều chất có hoạt tính sinh học khác nhau đã được tổng hợp từ vi sinh vật đã được đưa vào sản xuất ở mức độ công nghiệp để phục vụ cho nghiên cứu, công – nông nghiệp, y học và cả đời sống của con người

Các chủng vi khuẩn như: Bacillus, Lactobacillus … đã và đang được sử

dụng trong chế phẩm sinh học để phục vụ cho các ngành sản xuất như: bia, rượu, y học, công nghiệp dệt, bổ sung vào thức ăn gia súc, thức ăn trong nuôi trồng thủy sản, phân hủy thức ăn của vật nuôi

Xuất phát từ thực tiễn đó tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tuyển chọn vi

khuẩn Bacillus sinh enzyme phytase” với các nội dung sau:

1 Tuyển lựa vi khuẩn Bacillus mẫu thực phẩm lên men (Natto) để chọn các chủng Bacillus ở các mẫu khác nhau

2 Nghiên cứu các đặc điểm về hình thái tế bào khuẩn lạc, nghiên cứu một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng đã được tuyển chon

3 Xác định một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng thủy phân của enzyme thu được

4 Sơ bộ đánh giá khả năng thủy phân của enzyme thu nhận được trên bã sắn

Để tài này được thực hiện tại phòng Vi sinh vật của Khoa công nghệ thực phẩm thuộc trường Đại học Nha Trang

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Phytase

1.1.1 Định nghĩa [6][17]

Phytase (myo-inositol hexakisphosphat phosphohydrolase) là enzyme xúc tác

cho phản ứng thủy giải liên kết monophosphoester của acid phytic hoặc muối

phytat, giải phóng orthophosphat và các dẫn xuất myo-inositol chứa ít nhóm phosphat hơn hay các myo-inositol tự do

Phản ứng có thể khái quát như sau:

1,2,4,5,6-pentakisphosphat + phosphat

Hình 1.1: Phản ứng thủy giải phytase bởi enzyme phytase

1.1.2 Phân loại [6][17]

1.1.2.1 Dựa trên vị trí của nhóm phospho đầu tiên bị tác động

Các tổ chức nghiên cứu về sinh hóa như IUBMB (International Union of Biochemistry and Molecular Biology), IUPAC-IUB, JCBN (Joint Commission on Biochemical Nomenclature) đã chia phytase thành 2 loại:

EC 3.1.3.8: tên thông thường là 3-phytase, tên hệ thống là

myo-inositolhexakisphosphat-3-phosphohydrolase Enzyme loại này thủy giải liên kết

ester tại vị trí thứ 3 của myo-inositolhexakisphosphat, cho sản phẩm là

D-myo-Ins-1,2,4,5,6-pentakisphosphat và orthophosphat Đây là dạng thường gặp đối với các phytase có nguồn gốc vi sinh vật

Hình 1.2: Phản ứng thủy giải 3-phytase

EC 3.1.3.26: tên thông thường là 6-phytase, tên hệ thống là

myo-inositolhexakisphosphat-6-phosphohydrolase Enzyme loại này thủy giải liên kết

ester tại vị trí thứ 6 của myo-inositolhexakisphosphat, cho sản phẩm là

D-myo-Ins-1,2,3,4,5-pentakisphosphat và orthophosphat 6-phytase là dạng thường gặp đối với phytase có nguồn gốc thực vật

Nhóm thứ 1 (EC3.1.3.2): Bao gồm các acid phosphatase hoặc histidin acid

phosphat (HAPs) Đặc điểm chung có trung tâm hoạt động là RHGXRXP và quá trình thủy giải phosphomonoester gồm các bước giống nhau

Nhóm thứ 2 (EC3.1.3.8): Là các β-propeller phytase (BPP), chủ yếu là các

enzyme của Bacillis Cho đến nay việc phân lập, xác định các gen điều khiển hoạt

động của phytase thuộc nhóm này chưa đầy đủ Các nghiên cứu cho thấy, hiện có 2

loại phytase của Bacillus đã được xác định, đó là phyC do Kerovuo và các cộng sự

phát hiện vào năm 1998 và TS-phy do Kim và các cộng sự phát hiện vào năm 1998

Nhóm thứ 3 (EC3.1.3.2): Bao gồm các purple acid phosphatase (PAP)

Gmphy được chiết tách từ lá mầm của đậu nành nảy mầm thuộc nhóm enzyme này Người ta đã xác định được cấu trúc không gian 3 chiều và cơ chế xúc tác của Gmphy

Bảng 1.1: Phân loại một số phytase [12]

STT Gen Nguồn cung cấp Nhóm phân loại

7 KBPAP Đậu trắng (Phaseolus vulgaris) Purple acid phosphatase

1.1.3 Các nguồn thu nhận enzyme phytase [6][20]

1.1.3.1 Nguồn vi sinh vật

Năm 1968, Shieh và Ware đã tiến hành phân lập từ đất hơn 2.000 chủng vi sinh vật có khả năng tạo phytase Hầu hết các chủng được phân lập cho sản phẩm enzyme nội bào Chỉ có khoảng 30 chủng đã phân lập cho sản phẩm phytase ngoại

bào Tất cả các phytase ngoại bào đều là sản phẩm của vi nấm, 28 chủng thuộc

giống Aspergillus, một thuộc giống Penicillium và một thuộc giống Mucor Các nghiên cứu khác đã khẳng định A.niger sinh tổng hợp phytase ngoại bào tốt nhất

Các nghiên cứu của Powar và Jagannathan (1982), Shimizu (1992) cho thấy

Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp phytase và đây là enzyme ngoại bào

Đến năm 1998, Kim và các cộng sự nghiên cứu và chứng minh Bacillus

amyloliquefaciens cũng có khả năng sinh tổng hợp phytase Bên cạnh đó, các chủng

như Aerobacter aerogenes, Pseudomonas sp, Escherichia coli, Enterobacter sp

cũng có khả năng sinh tổng hợp phytase

Một số nấm men cũng có khả năng sinh tổng hợp phytase, trong đó, các

chủng như Schwanniomyces castellii, Arxula adenivorans, Pichia spartinae và

Pichia rhodannesis cho sản phẩm phytase ngoại bào Ngược lại, Saccharomyces cerevisiae và Pichia anomala sinh tổng hợp enzyme phytase nội bào

1.1.3.2 Nguồn thực vật

Phytase được tìm thấy ở nhiều thực vật Ví dụ như phytase từ ngũ cốc: lúa

mì, bắp vàng, lúa mạch, lúa gạo và từ các loại đậu: đậu xanh, đậu lùn và đậu trắng California loại nhỏ Hoạt độ phytase cũng đã được xác định ở cải trắng, khoai tây,

củ cải, rau diếp, rau bina, cỏ và phấn hoa Lily Một số tác giả đã tinh sạch và xác định các đặc tính của phytase chiết tách từ hạt bắp vàng đang nảy mầm Rễ cây của một số thực vật có chứa phytase, tuy hàm lượng thấp nhưng cũng được nghiên cứu, xác định

1.1.3.3 Nguồn động vật

Phytase được tìm thấy ruột của một số động vật, đặc biệt là các động vật nhai lại Tuy nhiên, phytase trong ruột không đóng vai trò quan trọng trong việc tiêu hóa các dẫn xuất phytat trong thức ăn Năm 1997, Craxton và các cộng sự đã phân lập

và cho thấy biểu hiện hoạt động của phytase trên một nhánh gan của chuột Một enzyme có chức năng giống phytase cũng đã được tìm thấy ở động vật đơn bào

Paramecium

Bảng 1.2: Các nguồn cung cấp phytase [6]

Nguồn Vị trí enzyme

Dịch nhờn trong ruột loài gặm nhấm IN2

Động vật

1: trong tế bào chất 2: trong lưới nội chất

1.1.4 Cơ chất đặc hiệu của phyase

1.1.4.1 Acid phytic và phytat [6][19]

Acid phytic (myo-inositol hexakisphosphat) là ester của rượu inositol và acid

phosphoric Công thức tổng quát là C6H18O24P6 Cấu trúc hóa học của acid phytic rất ổn định, hàm lượng phosphat cao, do đó nó có tích điện âm và có khả năng tồn tại trong phổ pH rộng

Hình 1.4: Cấu trúc acid phytic

Acid phytic chiếm từ 1-5% trọng lượng trong ngũ cốc, cây họ đậu, hạt cho dầu và các loại quả hạch Trong cỏ làm thức ăn cho động vật, 1/3 là các ion phospho (P) có thể tiêu hóa được, trong khi đó 2/3 còn lại là các P vô cơ tồn tại dưới dạng phytin, một dạng hỗn hợp của muối canxi, magie với acid inositol hexaphosphoric được biết đến như là một dạng muối của acid phytic Ngoài ra, trong tự nhiên, acid phytic tồn tái chủ yếu dưới dạng muối phytat với các ion kim loại như kẽm, sắt (II)… phytat là loại hợp chất phức tạp, khó tan, cơ thể người và

động vật không thể phân giải, do đó không thể hấp thụ được phospho và các nguyên

tố cần thiết cho cơ thẻ Trong trường hợp này acid phytic là nguyên nhân gây nên hiện tượng kháng dưỡng, hầu như không có enzyme nào có khả năng phân cắt các liên kết phosphodiester trong phân tử acid phytic, ngoại trừ phytase

Bảng 1.3: Hàm lượng phytat và phospho trong các sản phẩm cây trồng [9]

Nguồn Tỷ lệ phospho

tổng số (%)

Hàm lượng phospho trong muối phytat (g/100g)

Tỷ lệ % phospho trong phytat đối với phospho tổng

Bacillus và alkaline phytase được phân lập từ hạt phân hóa Lily

Dựa trên cơ chất đặc trưng, phytase có thể được phân chia thành 2 loại là phytase có lượng cơ chất đặc trưng khá rộng và phytase đặc hiệu cao với acid phytic Phytase phù hợp với nhiều cơ chất đặc hiệu thì lại có tính đặc hiệu thấp với

acid phytic (23 - 43U/mg) Ngược lại, phytase có lượng cơ chất đặc hiệu hẹp thì cho hoạt độ cao hơn, từ 103 - 811U/mg

1.1.5 Các đặc tính lý hóa của phytase

1.1.5.1 Cấu tạo và trọng lượng phân tử

Hầu hết các phytase đã được xác định là enzyme đơn phân tử Ví dụ như

phytase của vi nấm, E.coli, Klebsiella terrigena, Bacillus subtilis Tuy nhiên,

phytase của một số động thực vật được hình thành từ nhiều tiểu đơn vị Phytase được hình thành trong quá trình nảy mầm của hạt bắp được xác định là một enzyme gồm 2 tiểu đơn vị có trọng lượng 38 kDa Phytase được tinh sạch từ ruột của chuột, qua kết quả điện di cho thấy có 2 loại protein với kích thước 70 và 90 kDa

Phytase của Klebsiella aerogenes có 2 dạng khác nhau, một là dạng enzyme

tự nhiên, có kích thước khá lớn, 700kDa, dạng còn lại cũng có đầy đủ các phần đảm bảo cho hoạt động của enzyme và có trọng lượng phân tử rất thấp, chỉ từ 10-13kDa Phytase của vi khuẩn hầu hết có trọng lượng phân tử nhỏ hơn phytase của nấm Theo tính toán lý thuyết, phytase của nấm có trọng lượng phân tử khoảng 50kDa, kết quả nghiên cứu thực nghiệm cho kết quả trong khoảng 65-70 kDa, trong đó phần nặng nhất là các gốc glycosy hóa

Trọng lượng và kích thước phân tử tính toán theo lý thuyết của các protein hoàn chỉnh và số lượng các tiểu đơn vị của phytase từ nhiều nguồn khác nhau

enzyme Phytase của A.fumigatus cũng không có khả năng chịu nhiệt, nhưng có một

đặc tính đáng chú ý là có khả năng hồi tính, đảm bảo đầy đủ hoạt độ sau khi bị biến tính ở 90oC

Một vài nghiên cứu cho thấy có thể dùng kỹ thuật protein để tăng tính ổn định nhiệt của phytase như thay thế prolin và tạo cầu disulfit hay dùng kỹ thuật sinh

học phân tử để tạo dòng phytase từ những nấm chịu nhiệt như M.thermophila,

T.thermophilus … Ngoài ra, cũng có thể sử dụng một số hóa chất đặc biệt như

polyol, dịch trích lúa miến…

1.1.5.3 pH

pH tối ưu của phytase từ các nguồn khác nhau sẽ khac nhau pH tối ưu của phytase dao động trong một biên độ khá lớn, từ 2,2 đến 8,0 Hầu hết phytase của vi sinh vật, đặc biệt là ở các nấm, pH tối ưu trong khoảng 4,5 đến 5,6 Phytase của

A.fumigatus có phổ pH tối ưu khá rộng; ít nhất 80% hoạt độ cao nhất được xác định

ỏ trị số pH từ 4,0 đến 5,6 Hai phytase thực vật có tính kiềm (hạt đậu và phân hoa Lily) có pH tối ưu là 8,0 Phytase từ động vật đa số hoạt động ở pH kiềm, từ 7,4 đến 8,7 Để tạo phytase có pH phù hợp với hệ thống tiêu hóa của động vật, Tomschy và cộng sự đã tạo đột biến điểm định hướng bằng cách thay thế Gly-277 và tyr-282 của

phytase A.fumigatus bằng các gốc tương ứng Lys và His của phytase A.niger

1.1.5.4 Ảnh hưởng của các ion kim loại và một số chất hóa học lên hoạt độ phytase

Các ion kim loại được xem là các tác nhân ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt độ phytase Tuy nhiên, rất khó để xác định rõ ảnh hưởng của các kim loại khác nhau vì

sự liên kết trực tiếp với enzyme hoặc các ion kim loại ở dạng hợp chất hòa tan với acid phytic và do đó làm giảm mức độ hoạt động của cơ chất Phytase của

Enterobacter sp.4 bi ức chế bởi các ion Zn2+, Ba2+,Cu2+ và Al2+

Theo nghiên cứu của Wyss và các động sự (1999), ion Cu2+ được xác định

có khả năng làm giảm hoạt độ của enzyme phytase có nguồn gốc từ E.nidulans và

A.terrus Phytase của A.fumigatus bị ức chế bởi một số ion kim loại thông thường

Hoạt đô phytase của A.fumigatus bị giảm 50% dưới tác dụng của EDTA, ngược lại,

EDTA không phải là yếu tố chính tác động lên hoạt độ phytase có nguồn gốc từ

nấm như E.nidulans, A.niger, A.terrus Những chất hóa học khác có khả năng kìm

hãm hoạt độ phytase là flor, molypdat, vanadat …

Vai trò của ion kim loại đối với hoạt độ phytase phải được xem xét trên từng loại đối tượng cụ thể Đối với phytase này, ion kim loại có thể là tác nhân làm giảm hoạt độ nhưng đối với phytase khác, đó lại là yếu tố làm gia tăng hoạt độ của enzyme Ion Ca2+ đóng một vai trò quan trọng đối với hoạt độ của phytase Khi

thêm tác nhân Ca vào phytase của Bacillus, phytase có nguồn gốc phấn hoa Typha

latifolia và phytase của một số loại thực vật khác cũng có khả năng làm tăng hoạt

độ của enzyme, ví dụ như ion Zn2+, ở nồng độ 20-80µM, có thể làm tăng 40% hoạt

độ phytase ở chuột; ion Fe2+ cũng có tác dụng làm tăng hoạt độ phytase

1.1.6 Các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình sinh tổng hợp phytase ở vi sinh vật

Phytase là sản phẩm thứ cấp được vi sinh vật tổng hợp trong quá trình sinh

trưởng Ở một số vi sinh vật (nấm mốc, vi khuẩn Bacillus) phytase được tiết vào

môi trường nuôi cấy, ở nhiều vi sinh vật khác, phytase chỉ được tích trữ trong thực

tế bào chúng

Phytase thực chất là protein nên cơ chế tổng hợp của phytase tương tự như những protein khác Operon điều hòa phytase là operon cảm ứng Gen mã hóa cho

enzyme phytase gọi là gen appA Hoạt động của appA tùy thuộc vào nhân tố sigma

σs – mã hóa bởi gen rpoS Khi môi trường thiếu phospho và có nhiều phytat, rpoS

được kích thích hoạt động mạnh, theo sau đó là sự tổng hợp trong phase ổn định, sau giai đoạn tăng trưởng lũy thừa

Ngoài phytat là cơ chất cảm ứng cho sinh tổng hợp phytase, các yếu tố dinh dưỡng khác như nguồn carbon, nitơ, khoáng cũng ảnh hưởng đến mức độ sinh tổng

hợp phytase Vi khuẩn Raoultella terrigena tổng hợp nhiều phytase khi môi trường

thiếu nguồn carbon Trong khi đó nồng độ giới hạn của carbon, nitơ không ảnh

hưởng đến sự tổng hợp phytase của E.coli Sự tổng hợp phytase vô cơ ảnh hưởng đến sự tổng hợp phytase của đa số nấm mốc, nấm men, vi khuẩn trừ Raoultella

terrigena và các vi khuẩn trong dạ dày cỏ của động vật nhai lại

1.1.7 Ứng dụng của enzyme phytase [6][20]

1.1.7.1 Ứng dụng phytase trong sản xuât thức ăn gia súc, gia cầm

Động vật nhai lại tiêu hóa phytat thông qua hoạt động của các phytase được tạo thành bởi các vi sinh vật trong dạ cỏ Vi khuẩn và nấm sinh trưởng kị khí trong ruột tham gia vào quá trình phân giải cơ bản thực vật trong dạ cỏ Các ion phospho được thủy giải từ phytat bởi phytase được sử dụng bởi cả hệ vi khuẩn trong dạ dày

và cơ thể chủ là động vật nhai lại Tình trạng này khác hẳn so với các động vật khác như heo, gia cầm và cá đều không có khả năng hấp thụ acid phytic, bởi chúng không có enzyme phytase trong dạ dày và ruột Vì thế, ion phospho được thêm vào thức ăn của chúng để bổ sung nhu cầu phosphat Theo nghiên cứu của S.E.Scheldeler, khi bổ sung vào khẩu phần ăn của gà Broiler mái sẽ nâng cao tăng trọng trong khoảng 7 tuần tuổi, cải thiện năng suất xương chân, không gây thiệt hại năng suất thịt; đối với gà trống giúp tăng trọng nhanh, nâng cao khả năng chuyển hóa thức ăn và sức sống

Việc bổ sung vào thức ăn của động vật một hàm lượng phytase thích hợp sẽ tạo khả năng đồng hóa phosphat trong quá trình tiêu hóa thức ăn và làm giảm bớt hàm lượng phospho trong phân và điều đó có lợi cho môi trường Tác động của thức ăn có phytase đối với động vật trong vấn đề ô nhiễm môi trường đã được xác định Nếu sử dụng phytase trong thức ăn gia súc cho tất cả các động vật ở USD, tương ứng với 8,23 x 104 tấn phosphat thải ra môi trường mỗi năm Việc sử dụng phytase như là một chất bổ sung vào thức ăn gia súc đã được áp dụng ở 22 nước Tổ chức FDA (The Food and Drug Administration) đã chấp thuận phytase đạt tiêu chuẩn là chất không gây độc hại

Bã sắn là phụ phẩm của quá trình tinh chế tinh bột sắn từ củ sắn tươi Bã sắn

có độ ẩm trên 80% nên khi phơi dễ bị nhiễm khuẩn, sinh mùi khó chịu và ảnh hưởng đến môi trường xung quang đặc biệt là nơi có dân cư sinh sống Vậy nên vấn

đề ô nhiễm tại các nhà máy tinh bột sắn hiện nay là một trong những vấn đề cần được giải quyết Trong chăn nuôi thì bã sắn có chứa rất nhiều phytate chưa được

thủy phân nên việc bổ sung thêm phytase vào sẽ làm cho phytate trong bã sắn được phân giải nhiều hơn

1.1.7.2 Ứng dụng phytase trong sản xuất thực phẩm

Một chế độ ăn giàu ngũ cốc, đậu, đậu nành sẽ làm tăng lượng phytate vào cơ thể Người ăn kiêng và người lớn tuổi sẽ mất cân bằng trong tiêu hóa thức ăn nếu tiêu thụ một lượng lớn ngũ cốc Phytase không được tiêu hóa sẽ ảnh hưởng xấu đến việc hấp thụ Zn2+, Ca2+, Mg2+, Fe2+, làm giảm khả năng chuyển hóa protein

Simell và cộng sự (1989) đã ghi lại rằng nguồn dự trữ phytat tách từ protein đậu nành tăng khả năng hòa tan tại pH thấp (pH = 3) Anno và cộng sự (1985) đã tiến hành loại bỏ phytat từ sữa đậu nành bằng cách sử dụng phytase lúa mì Tuy nhiên, cần tiến hành nhiều nghiên cứu vè vấn đề này trước khi chấp nhận phytase như là một chất phụ gia thực phẩm

1.1.7.3 Ứng dụng phytase trong sản xuât myo-inositol phosphat

Myo-inositol phosphat và phospholipid đóng vai trò nòng cốt trong tín hiệu

vận chuyển qua màng và tăng sự tập trung ion Ca2+ nội bào (Billington, 1993) Đồng thời Ins(1,4,5)P3 hoạt hóa các enzyme phụ thuộc ion Ca2+ trong đó protein kinase C, là yếu tố kích thích quá trình vận chuyển nhóm phosphat từ ATP đến nhiều loại protein trong tế bào chất và làm thay đổi hoạt độ của chúng

Bình thường inositol vận chuyển vào máu người một lượng là 30 µmol, tuy hiện diện với một lượng nhỏ nhưng quan trọng do inositol có liên quan tới sự tuần hoàn máu và có vai trò quan trọng trong sự sinh tinh trùng ở chuột

Đặc biệt các inositol triphosphat đã chứng tỏ có khả năng ngăn chặn hoặc giảm bớt bệnh trầm cảm hoặc làm giảm bớt các trường hợp liên quan đến sự khác thường của neuopeptid Y (NPY) Trong số đó, bao gồm các bệnh như viêm khớp và các bệnh về đường hô hấp như bệnh hen suyễn Việc sử dụng inositol triphosphat như thuốc giảm đau đã được nghiên cứu và đề nghị cho sử dụng Đáng chú ý, ester của inositol triphosphat được xem là tín hiệu biểu hiện sự ức chế ngược trở lại các virus gây nhiễm trùng bao gồm cả HIV

Các ứng dụng trong y học kể trên của myo-inositol phosphat đã góp phần

làm gia tăng sức hấp dẫn trong quá trình nghiên cứu, sản xuất hợp chất này Cơ chế

tổng hợp hóa học của myo-inositol phosphat khá phức tạp, đòi hỏi nhiệt độ và áp suất cao Việc sản xuất myo-inositol phosphat bằng cách sử dụng phytase là một

phương pháp được lựa chọn thay cho việc tổng hợp hóa học Việc cố định các

phytase được sử dụng để sản xuất các loại inositol phosphat Ngoài ra,

myo-inositol phosphat còn có thể được sử dụng cho việc nghiên cứu các đặc tính sinh hóa và quá trình trao đổi chất

1.1.7.4 Ứng dụng phytase trong sản xuất bột giấy và công nghiệp giấy

Acid phytic là thành phần quan trọng ở thực vật Phytase chịu nhiệt được xem là một tác nhân sinh học làm giảm hàm lượng acid phytic trong quá trình chế biến giấy và bột giấy Quá trình sử dụng enzyme làm giảm acid phytic sẽ không sản sinh chất gây ung thư và các sản phẩm độc hại Vì thế, việc khai thác phytase trong quá trình chế biến giấy và bột giấy sẽ mang lại nhiều lợi ích cho môi trường và hỗ trợ sự phát triển của các công nghệ sản xuất sạch trong tương lai

1.2 Đại cương về Bacillus sinh enzyme phytase [1] [4] [6]

1.2.1 Vài nét về Bacillus

Vi khuẩn Bacillus là một nhóm vi khuẩn thuộc bộ eubacteriales của họ

bacillaceae

Vi khuẩn Bacillus là trực khuẩn Gram dương (G+) Bacillus được phân biệt

với các loài vi khuẩn sinh bào tử khác bằng hình dạng tế tào hình que, sinh trưởng ở

trong điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc Tế bào Bacillus có thể đơn

bào hoặc chuỗi và chuyển động bằng tiêm mao Nhờ khả năng sinh bào tử nên vi

khuẩn bacillus có thể tồn tại trong thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau và

rất phổ biến trong tự nhiên khác nhau như đất, nước, thức ăn, sữa, … nhưng chủ yếu là đất

Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại sinh nhờ

sử dụng các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acid hữu cơ,…Một vài loài có thể lên men carbohydrate tạo thành glycerol và butanediol Hầu hết đều là

loài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30-45oC, nhưng cũng có nhiều loài ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 65oC

Vi khuẩn có ở mọi nơi trong tự nhiên và khi điều kiện sống gay go, chúng có khả năng tạo ra bào tử gần như hình cầu, để tồn tại trong trạng thái "ngủ đông" trong thời gian dài Loại sinh vật này có cực kỳ nhiều loài khác nhau, trong đó đa số

là vô hại

Đa số Bacillus sinh trưởng ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 – 10 như

Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = 2 – 6 như Bacillus acidocaldrius

Vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease,

phytase …), do có chúng được ứng dụng nhiều trong công nghiệp, chăn nuôi, trong bảo vệ môi trường…

Các chủng Bacillus được nghiên cứu khá nhiều, đặc biệt là trong việc sử

dụng để tổng hợp nhiều loại enzyme khác nhau: amylase, protease, phytase,… Một

vài nghiên cứu gần đây cho thấy một số chủng Bacillus như Bacillus subtilis,

Bacillus amyloliquefaciens đóng vai trò tích cực trong quá trình phát triển của thực

vật trong điều kiện môi trường đất có nhiều phytase Sự hiện diện của các vi khuẩn này trên bề mặt rễ của thực vật đã giúp ích cho sự phát triển của thực vật thông qua việc tạo nên các điều kiện thuận lợi cho quá trình dinh dưỡng của thực vật Một số thực vật có khả năng tạo phytase tuy nhiên với một lượng rất ít, không đủ để phân

giải phytat trong đất, do đó sự xuất hiện của các chủng Bacillus có khả năng sinh

tổng hợp phytase có ý nghĩa quan trọng

Vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease,

phytase …), do có chúng được ứng dụng nhiều trong công nghiệp, chăn nuôi, trong bảo vệ môi trường…

1.2.2 Phân loại phytase của Bacillus

Phytase sinh tổng hợp từ Bacillus có hai loại là phyC (Kerovuo, 1998) và

TS-phy (Kim, 1998) Cả hai loại này đều thuộc nhóm β-propeller phytase (BPP) Sự

phụ thuộc vào liên kết với ion Ca2+ cho tính ổn định nhiệt và hoạt độ xúc tác của enzyme để phân biệt phyC với các nhóm phụ khác của phytase

BPP có hai vị trí gắn với phosphat, vị trí “bẻ gãy” và vị trí “ái lực” Sự thủy giải cơ chất xảy ra tại vị trí “bẻ gãy”, còn vị trí “ái lực” thì có thể làm tăng ái lực liên kết với cơ chất Ion Ca2+ tạo liên kết dễ dàng với cơ chất bởi tạo ra một môi trường tĩnh điện thích hợp

1.2.3 Cơ chất đặc hiệu

PhyC đặc hiệu cao với cơ chất là acid phytic, hoạt độ đạt 100%, ngoài ra nó còn đặc hiệu với ATP (hoạt độ đạt 50%) và ADP (hoạt độ đạt 75%) Tính đặc hiệu

của phytase ở Bacillus rất cao, tuy nhiên hiệu quả đặc hiệu thấp, so với phytase sinh

tổng hợp từ các nguồn khác Hoạt độ đặc hiệu thấp làm cản trở việc sử dụng

phytase của Bacillus trong sản xuất công nghiêp

1.3.Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất ở Việt Nam

Ở Việt Nam enzyme phytase được nghiên cứu ở nhiều trường đại học như trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Đại học Thái Nguyên, trường Cao đẳng Kinh tế - Kỹ thuật Hà Nội…Viện Chăn nuôi Quốc gia, Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh, Viện Công nghệ sinh học Hà Nội và một

số trường đại học, viện nghiên cứu khác

Có rất nhiều ứng dụng của phytase được ứng dụng trong các lĩnh vực, các ngành nghề sản xuất khác nhau ở Việt Nam như: trong công nghiệp thực phẩm, trong chăn nuôi, trong công nghiệp sản xuất bột giấy…

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và vật liệu:

+ Tủ cấy vô trùng + Máy đo OD

Dụng cụ khác: Đĩa petri, lame, pipet, đèn cồn, đũa thủy tinh, bóp cao su, …

2.1.3 Môi trường nuôi cấy

2.1.3.1 Môi trường phân lập, giữ giống và nuôi cấy

Môi trường NA (môi trường thạch dinh dưỡng) (g/l)

di-sodium hydrogen phosphate 2,5

2.1.3.3 Môi trường nuôi cấy xác định khả năng sinh phytase

2.1.3.5 Cách chuẩn bị môi trường

Các thành phần môi trường được hòa tan vào nước cất Đối với môi trường

có agar cần được đun sôi quấy đều sau đó đem thanh trùng Môi trường được thanh trùng trong điều kiện ở 121oC trong 15 phút

2.2 Các phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus từ Natto

Hình 2.1: Sơ đồ của quá trình phân lập vi khuẩn Bacillus từ Natto

 Thuyết minh quy trình:

Đậu nành được ngâm 1 ngày sau đó được luộc chín trong nồi áp suất trong vòng 30 phút Còn rơm đươc chần sơ qua nước sôi để tiêu diệt một số vi sinh vật gây hại, sau khi chần sơ lấy ra để ráo nước Đem đậu nành đã được nấu chín ủ trong rơm trong vòng 24 giờ ở 37oC Sau 24 giờ lấy đậu ra thì đậu đã lên men (natto)

Đậu nành đã ủ ta quan sát được đậu có độ nhớt cao, có mùi nồng Đậu có độ nhớt càng cao thì chất lượng của đậu tương lên men (natto) sẽ càng tốt [14]

Sau khi đậu đã lên men ta tiến hành cấy ra đĩa petri trên bề mặt môi trường phân lập vi khuẩn theo phương pháp cấy ria trên môi trường Sau chọn các khuẩn

lạc riêng biệt đặc trưng của loại vi khuẩn Bacillus (Trực khuẩn gram dương, sinh

bào tử)

2.2.2 Phương pháp xác định khả năng sinh phytase [6]

Nguyên tắc: Dựa trên khả năng thủy giải acid phytic một cách đặc hiệu của phytase Trên môi trường thạch đĩa, acid phytic và ion canxi kết hợp tạo thành kết

Natto (Đậu nành lên men)

Cấy ria trên môi trường NA

Nhuộm Gram

Giữ chủng vi khuẩn