Tuyển chọn vi khuẩn bacillus sinh enzyme phytase

i LỜI CẢM ƠN Sau gần 3 tháng thực tập tại phòng vi sinh vật – Khoa Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Nha Trang, dưới sự hướng dẫn của TS.Nguyễn Minh Trí nên tôi đã hoàn thành tốt cuốn luận văn này. Qua đây tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Minh Trí người đã quan tâm và tận tình chỉ bảo cho tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp, cùng các cán bộ nghiên cứu phòng vi sinh vật, những người đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt nhiệm vụ của mình. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Nha Trang, cùng toàn thể các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ thực phẩm đã tận tình chỉ bảo và truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong những năm học vừa qua. Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn tới gia đình cùng toàn thể bạn bè thân thiết, những người đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Nha Trang,tháng 6-2012 Sinh viên Nguyễn Thị Thư Thảo ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Phytase 3 1.1.1. Định nghĩa 3 1.1.2. Phân loại 3 1.1.2.1. Dựa trên vị trí của nhóm phospho đầu tiên bị tác động 3 1.1.2.2. Dựa trên sự khác biệt về cấu trúc và đặc trưng thủy phân của phytase 4 1.1.3. Các nguồn thu nhận enzyme phytase 5 1.1.3.1. Nguồn vi sinh vật 5 1.1.3.2. Nguồn thực vật 6 1.1.3.3. Nguồn động vật 6 1.1.4. Cơ chất đặc hiệu của phyase 8 1.1.4.1. Acid phytic và phytat 8 1.1.4.2. Các cơ chất khác 9 1.1.5. Các đặc tính lý hóa của phytase 10 1.1.5.1. Cấu tạo và trọng lượng phân tử 10 1.1.5.2. Nhiệt độ 10 1.1.5.3. pH 11 1.1.5.4. Ảnh hưởng của các ion kim loại và một số chất hóa học lên hoạt độ phytase 11 1.1.6. Các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình sinh tổng hợp phytase ở vi sinh vật 12 1.1.7. Ứng dụng của enzyme phytase 13 iii 1.1.7.1. Ứng dụng phytase trong sản xuât thức ăn gia súc, gia cầm 13 1.1.7.2. Ứng dụng phytase trong sản xuất thực phẩm 14 1.1.7.3. Ứng dụng phytase trong sản xuât myo-inositol phosphat 14 1.1.7.4. Ứng dụng phytase trong sản xuất bột giấy và công nghiệp giấy 15 1.2. Đại cương về Bacillus sinh enzyme phytase 15 1.2.1. Vài nét về Bacillus 15 1.2.2. Phân loại phytase của Bacillus 16 1.2.3. Cơ chất đặc hiệu 17 1.3.Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất ở Việt Nam 17 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1. Đối tượng và vật liệu 18 2.1.1. Đối tượng 18 2.1.2. Vật liệu 18 2.1.2.1. Hóa chất 18 2.1.2.2. Thuốc nhuộm 18 2.1.2.3. Thiết bị 18 2.1.3. Môi trường nuôi cấy 19 2.1.3.1. Môi trường phân lập, giữ giống và nuôi cấy 19 2.1.3.2. Môi trường tăng sinh: môi trường BHB (g/l) 19 2.1.3.3. Môi trường nuôi cấy xác định khả năng sinh phytase 19 2.3.3.4. Môi trường để xác định các yếu tố ảnh hưởng (Nhiệt độ, pH, thời gian) 19 2.1.3.5. Cách chuẩn bị môi trường 20 2.2. Các phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1. Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus từ Natto 20 2.2.2. Phương pháp xác định khả năng sinh phytase 20 2.2.3. Phương pháp xác định hoạt độ phytase 21 2.2.3.1. Phương pháp định lượng phosphate (phương pháp Fiske và Subbarow) 21 iv 2.2.3.2. Cách tính hoạt độ enzyme phytase 24 2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến enzyme phytase sinh ra 24 2.2.5. Khảo sát các ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến khả năng thủy phân hytate của enzyme phytase 25 2.2.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ phytase 25 2.2.5.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt độ phytase 26 2.2.6. Sơ bộ đánh khả năng sinh enzyme phytase của vi khuẩn phân lập được trên bã sắn 27 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28 3.1. Phân lập chủng Bacillus 28 3.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 28 3.3. Đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn 29 3.4. Nghiên cứu khả năng sinh enzyme phytase của các chủng Bacillus 31 3.5. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp phytase của Bacillus trên môi trường lỏng 32 3.5.1. Xây dựng đường chuẩn định lượng phospho 33 3.5.2. Khảo sát hoạt độ phytase của chủng Bacillus trên môi trường lỏng 34 3.5.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến enzyme phytase sinh ra 35 3.6. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến khả năng thủy phân phytate của enzyme phytase 36 3.6.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ phytase 36 3.6.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt độ phytase 37 3.7. Kết quả đánh giá sơ bộ khả năng thủy phân của enzyme phytase của vi khuẩn ở trên bã sắn 38 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Phân loại một số phytase 5 Bảng 1.2: Các nguồn cung cấp phytase 7 Bảng 1.3: Hàm lượng phytat và phospho trong các sản phẩm cây trồng 9 Bảng 2.1: Bảng dung dịch đường chuẩn 23 Bảng 2.2: Bảng xác định lượng phosphat trong dịch enzyme 23 Bảng 3.1: Đo đường kính của vòng phân giải của enzyme trong môi trường thạch 32 Bảng 3.2: Tương quan giữa giá trị ∆OD với hàm lượng phospho giá trị ∆OD 700 với hàm lượng phospho 33 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Phản ứng thủy giải phytase bởi enzyme phytase 3 Hình 1.2: Phản ứng thủy giải 3-phytase 4 Hình 1.3: Phản ứng thủy giải 6-phytase 4 Hình 1.4: Cấu trúc acid phytic 8 Hình 2.1: Sơ đồ của quá trình phân lập vi khuẩn Bacillus từ Natto 20 Hình 2.2: Sơ đồ xác định khả năng sinh enzyme phytase 21 Hình 2.3: Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến enzyme phytase 24 Hình 2.4: Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ phytase 25 Hình 2.5: Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt độ phytase 26 Hình 3.1: Phân lập khuẩn lạc chủng Bacillus 28 Hình 3.2: Các chủng Bacillus phân lập được 29 Hình 3.3: Hình thái tế bào của chủng Bacillus 30 Hình 3.4: Hình thái tế bào của chủng Bacillus (có sinh bào tử) 30 Hình 3.5: 3 chủng vi khuẩn không xuất hiện vòng phân giải 31 Hình 3.6: Hoạt tính phân giải enzyme phytase của 3 chủng Bacillus 32 Hình 3.7: Đường biểu diễn sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ phospho và giá trị ∆OD 700 33 Hình 3.8: Hoạt độ chung của phytase của 3 chủng Bacillus nuôi cấy trong môi trường lỏng, cơ chất cảm ứng là sodium phytase 34 Hình 3.9: Đường biến thiên hoạt độ phytase của B7 theo thời gian nuôi cấy 35 Hình 3.10: Đường biến thiên hoạt độ phytase của B7 theo nhiệt độ nuôi cấy 36 Hình 3.11: Đường biến thiên hoạt độ phytase của B7 theo pH nuôi cấy 37 vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT HAPs : Histidin acid phosphat BPP : β-propeller phytase PAP : acid phosphatase Ins : Inositol OD : Độ hấp thụ của dung dịch (giá trị mật độ quang) OD o : Giá trị mật độ quang của ống thử không OD t : Giá trị mật độ quanh của ống thử thật ∆OD : Hiệu số mật độ quang (∆OD = OD t – OD o ) đvhđ : Đơn vị hoạt độ TB : Trung bình 1 MỞ ĐẦU Vi sinh vật trong tự nhiên rất là phong phú và đa dạng. Chúng ở khắp mọi nơi xung quanh ta như: trong đất, trong nước, trong không khí thậm chí có cả trong cơ thể của con người. Chúng có thể gây ra cho ta những bất lợi như bệnh lao, bệnh dịch hạch, bệnh tả, đại dịch cúm ở con người và cả gia cầm, … Nhưng vi khuẩn cũng đem lại cho chúng ta nguồn lợi vô cùng to lớn nếu ta biết, hiểu chúng và biết cách sử dụng chúng vào mục đích có lợi sẽ giúp cho cuộc sống con người tốt đẹp hơn. Từ xưa, con người đã biết ứng dụng những hoạt tính có lợi của vi sinh vật phục vụ cho đời sống của mình như là tạo ra các loại rượu nhờ quá trình lên men của vi sinh vật, tạo ra các loại thức ăn từ quá trình lên men như đậu tương lên men (natto) của Nhật, tạo ra loại nước giải khát lên men, các chế phẩm enzyme lấy từ vi sinh vật phục vụ cho trồng trọt, chăn nuôi. Ngày nay khi chúng ta đang sống ở thế kỷ XXI, thế kỷ của khoa học và kỹ thuật ngày càng phát triển thì công nghệ vi sinh càng ngày càng chứng tỏ được ưu thế của mình Hiện nay đã có rất nhiều chất có hoạt tính sinh học khác nhau đã được tổng hợp từ vi sinh vật đã được đưa vào sản xuất ở mức độ công nghiệp để phục vụ cho nghiên cứu, công – nông nghiệp, y học và cả đời sống của con người. Các chủng vi khuẩn như: Bacillus, Lactobacillus … đã và đang được sử dụng trong chế phẩm sinh học để phục vụ cho các ngành sản xuất như: bia, rượu, y học, công nghiệp dệt, bổ sung vào thức ăn gia súc, thức ăn trong nuôi trồng thủy sản, phân hủy thức ăn của vật nuôi Xuất phát từ thực tiễn đó tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sinh enzyme phytase” với các nội dung sau: 1. Tuyển lựa vi khuẩn Bacillus mẫu thực phẩm lên men (Natto) để chọn các chủng Bacillus ở các mẫu khác nhau 2. Nghiên cứu các đặc điểm về hình thái tế bào khuẩn lạc, nghiên cứu một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng đã được tuyển chon. 2 3. Xác định một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng thủy phân của enzyme thu được. 4. Sơ bộ đánh giá khả năng thủy phân của enzyme thu nhận được trên bã sắn. Để tài này được thực hiện tại phòng Vi sinh vật của Khoa công nghệ thực phẩm thuộc trường Đại học Nha Trang. 3 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Phytase 1.1.1. Định nghĩa [6][17] Phytase (myo-inositol hexakisphosphat phosphohydrolase) là enzyme xúc tác cho phản ứng thủy giải liên kết monophosphoester của acid phytic hoặc muối phytat, giải phóng orthophosphat và các dẫn xuất myo-inositol chứa ít nhóm phosphat hơn hay các myo-inositol tự do. Phản ứng có thể khái quát như sau: myo-inositol hexakisphosphat +H2O  D-myo-inositol 1,2,4,5,6- pentakisphosphat + phosphat Hình 1.1: Phản ứng thủy giải phytase bởi enzyme phytase 1.1.2. Phân loại [6][17] 1.1.2.1. Dựa trên vị trí của nhóm phospho đầu tiên bị tác động Các tổ chức nghiên cứu về sinh hóa như IUBMB (International Union of Biochemistry and Molecular Biology), IUPAC-IUB, JCBN (Joint Commission on Biochemical Nomenclature) đã chia phytase thành 2 loại: EC 3.1.3.8: tên thông thường là 3-phytase, tên hệ thống là myo- inositolhexakisphosphat-3-phosphohydrolase. Enzyme loại này thủy giải liên kết ester tại vị trí thứ 3 của myo-inositolhexakisphosphat, cho sản phẩm là D-myo-Ins- 1,2,4,5,6-pentakisphosphat và orthophosphat. Đây là dạng thường gặp đối với các phytase có nguồn gốc vi sinh vật. [...]... tăng ho t 1.1.6 Các y u t phytase nh hư ng lên quá trình sinh t ng h p phytase vi sinh v t Phytase là s n ph m th c p ư c vi sinh v t t ng h p trong quá trình sinh trư ng m t s vi sinh v t (n m m c, vi khu n Bacillus) phytase ư c ti t vào môi trư ng nuôi c y, nhi u vi sinh v t khác, phytase ch ư c tích tr trong th c t bào chúng Phytase th c ch t là protein nên cơ ch t ng h p c a phytase tương t như nh... phát tri n, Bacillus sinh t ng h p phytase, phytase s th y gi i acid phytic, phá v liên k t v i canxi, làm m t màu c, hình thành vòng phân gi i Ch ng vi khu n Bacillus Môi trư ng nuôi c y xác nh kh năng sinh enzyme Ch n ch ng vi khu n sinh enzyme phytase Hình 2.2: Sơ xác nh kh năng sinh enzyme phytase Thuy t minh quy trình: • Ti n hành chu n b môi trư ng nuôi c y xác inh kh năng sinh enzyn phytase, chú... 9 phyC Bacillus subtilis VTTE-68013 Beta-propeller phytase 10 TS-phy Bacillus amyloliquefaciens Beta-propeller phytase 11 phy-L Bacillus licheniformis Beta-propeller phytase 12 168phyA Bacillus subtilis 168 Beta-propeller phytase 1.1.3 Các ngu n thu nh n enzyme phytase [6][20] 1.1.3.1 Ngu n vi sinh v t Năm 1968, Shieh và Ware ã ti n hành phân l p t t hơn 2.000 ch ng vi sinh v t có kh năng t o phytase. .. t o phytase tuy nhiên v i m t lư ng r t ít, không gi i phytat trong phân t, do ó s xu t hi n c a các ch ng Bacillus có kh năng sinh t ng h p phytase có ý nghĩa quan tr ng Vi khu n Bacillus có kh năng sinh enzyme ngo i bào (amylase, protease, phytase …), do có chúng ư c ng d ng nhi u trong công nghi p, chăn nuôi, trong b o v môi trư ng… 1.2.2 Phân lo i phytase c a Bacillus Phytase sinh t ng h p t Bacillus. .. trình s d ng enzyme làm gi m acid phytic s không s n sinh ch t gây ung thư và các s n ph m c h i Vì th , vi c khai thác phytase trong quá trình ch bi n gi y và b t gi y s mang l i nhi u l i ích cho môi trư ng và h tr s phát tri n c a các công ngh s n xu t s ch trong tương lai 1.2 i cương v Bacillus sinh enzyme phytase [1] [4] [6] 1.2.1 Vài nét v Bacillus Vi khu n Bacillus là m t nhóm vi khu n thu c... nm c sinh t ng h p phytase Vi khu n Raoultella terrigena t ng h p nhi u phytase khi môi trư ng thi u ngu n carbon Trong khi ó n ng hư ng gi i h n c a carbon, nitơ không nh n s t ng h p phytase c a E.coli S t ng h p phytase vô cơ nh hư ng n s t ng h p phytase c a a s n m m c, n m men, vi khu n tr Raoultella terrigena và các vi khu n trong d dày c c a ng v t nhai l i 13 1.1.7 ng d ng c a enzyme phytase. .. và ADP (ho t c a phytase Bacillus r t cao, tuy nhiên hi u qu t ng h p t các ngu n khác Ho t t 100%, ngoài ra nó t 75%) Tính c hi u c hi u th p, so v i phytase sinh c hi u th p làm c n tr vi c s d ng phytase c a Bacillus trong s n xu t công nghiêp 1.3.Tình hình nghiên c u và ng d ng trong s n xu t Vi t Nam enzyme phytase ư c nghiên c u trư ng Cao i h c Nông Lâm Thành ph H Chí Minh, Vi t Nam nhi u trư... i sinh v t này có c c kỳ nhi u loài khác nhau, trong ó a s là vô h i a s Bacillus sinh trư ng pH = 7, m t s phù h p v i pH = 9 – 10 như Bacillus alcalophillus, hay có lo i phù h p v i pH = 2 – 6 như Bacillus acidocaldrius Vi khu n Bacillus có kh năng sinh enzyme ngo i bào (amylase, protease, phytase …), do có chúng ư c ng d ng nhi u trong công nghi p, chăn nuôi, trong b o v môi trư ng… Các ch ng Bacillus. .. 2.2.6 Sơ b nh phytase i v i pH T ó nuôi c y vi khu n Bacillus ánh kh năng sinh enzyme phytase c a vi khu n phân l p ư c trên bã s n [6] M c ích: Xác nh kh năng th y phân phytate c a enzyme phytase có trong ch ng mà ta phân l p ư c trên t ng th i gian khác nhau Cách ti n hành: Cân 50 g bã s n sau ó cho 20ml dung dich cơ ch t enzyme B sung thêm 0,2 g natri benzoate và 1ml dung d ch kháng sinh tri n, tr... vi khu n thu c b eubacteriales c a h bacillaceae Vi khu n Bacillus là tr c khu n Gram dương (G+) Bacillus ư c phân bi t v i các loài vi khu n sinh bào t khác b ng hình d ng t tào hình que, sinh trư ng trong i u ki n hi u khí ho c k khí không b t bu c T bào Bacillus có th bào ho c chu i và chuy n ơn ng b ng tiêm mao Nh kh năng sinh bào t nên vi khu n bacillus có th t n t i trong th i gian r t dài dư . nghiên cứu đề tài: Tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sinh enzyme phytase với các nội dung sau: 1. Tuyển lựa vi khuẩn Bacillus mẫu thực phẩm lên men (Natto) để chọn các chủng Bacillus ở các mẫu. quá trình sinh tổng hợp phytase ở vi sinh vật Phytase là sản phẩm thứ cấp được vi sinh vật tổng hợp trong quá trình sinh trưởng. Ở một số vi sinh vật (nấm mốc, vi khuẩn Bacillus) phytase được. Bacillus 28 3.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 28 3.3. Đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn 29 3.4. Nghiên cứu khả năng sinh enzyme phytase của các chủng Bacillus 31 3.5. Khảo sát khả năng sinh