[6][13]
Nguyên tắc:
Khi phosphate tác dụng với ammonium molybdat có màu vàng. Khi khử phosphamolybdat, màu vàng sẽ chuyển thành màu xanh molybdat. Độ đậm của màu sắc tỷ lệ với hàm lượng phosphor có trong mẫu.
Chủng vi khuẩn Bacillus
Môi trường nuôi cấy xác định khả năng sinh enzyme
Phản ứng:
2(MoO2.4MoO3)+H3PO4+4H2O (MoO2.4MoO3)2.H3PO4.4H2O
Hóa chất:
Dung dịch cơ chất: sodium phytat 0,2% (m/v) trong đệm sodium acetat acetat 0,1M pH = 5.
Cách pha sodium acetat 0,1M pH=5: [14]
Pha 10 ml acid acetic (CH3COOH) đậm đặc với 100 ml nước cất được acid acetic 0,1M.
Pha 4,51g CH3COONa trong 200 ml nước cất được 0,1M sodium acetate 0,1M. Pha 71,4 ml acid acetic 0,1M trong 128,6 ml sodium acetate 0,1M được dung dịch đệm sodium acetate 0,1M pH = 5.
Cân 0,4g sodium phytate pha trong 200 ml sodium acetate 0,1M pH=5 được dung dịch cơ chất. Sau đó bảo quản lạnh.
Dung dịch phospho mẫu 0,01M: cân 0,178g K2HPO4 .3H2Ohòa với nước cất thành 100 ml.
Dung dịch phospho 500 nmol/ml: hút 5ml dung dịch phospho 0,01M, pha thành 100 ml.
Dung dịch ammonium molydat 1,5%(w/v) trong H2SO4 5,5%( kí hiệu dung dịch a).
• Hút 28ml H2SO4đđ (98%) pha với nước cất thành 500 ml, được dung dịch H2SO45,5%.
• Cân 7,5g ammonium molydat [(NH4)6Mo7O24.4H2O] hòa tan vào 500 ml H2SO4 5,5% vừa pha.
Dung dịch FeSO4 5%: cân 5g FeSO4 hòa với nước cất lạnh thành 100 ml (kí hiệu dung dịch b). Pha trong điều kiện lạnh và dùng liền sau khi pha (dung dịch FeSO4 phải trong suốt, không màu hoặc có màu vàng rất nhạt, nếu có màu vàng đậm thì phải pha lại).
Dung dịch thuốc thử phosphat: hỗn hợp giữa dung dịch a và dung dịch b với tỷ lệ a:b = 4:1. Hỗn hợp phải không màu, nếu có xuất hiện màu xanh phải pha
lại. Dung dịch thuốc thử nếu sử dụng không hết, bảo quản lạnh, thời gian sử dụng tối đa 4 ngày.
Dung dịch TCA (acid trichloroacetic) 5%: cân 25g TCA hòa với nước cất thành 500 ml.
Cách thức tiến hành: Dựng đường chuẩn:
Lấy một loạt ống nghiệm sạch, tiến hành pha dung dịch phospho với nồng độ theo bảng sau:
Bảng 2.1: Bảng dung dịch đường chuẩn
Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5
Dung dịch phospho 500 nmol/ml 0 1 2 3 4 5
Nước cất (ml) 5 4 3 2 1 0
Nồng độ phospho (nmol/ml) 0 100 200 300 400 500
Thuốc thử phosphat (ml) 5 5 5 5 5 5
Lắc đều, để yên ở nhiệt độ phòng, đem đo mật độ quang ở bước sóng 700 nm. Dựng đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang (∆OD) theo nồng độ phospho (nmol/ml).
Phản ứng enzyme:
Thực hiện phản ứng enzyme và phản ứng màu như Bảng 2.2.
Bảng 2.2: Bảng xác định lượng phosphat trong dịch enzyme Ống nghiệm Thử thật Thử không
Dung dịch cơ chất phytat (ml) 2 2
Dung dịch TCA 5%(ml) 0 2,5
Dung dịch enzyme (ml) 0,5 0
Lắc đều để yên ở nhiệt độ phòng, trong 30 phút.
Dung dịch TCA 5%(ml) 2,5 0
Dung dịch enzyme (ml) 0 0,5
Thuốc thử phosphat (ml) 5 5
Lắc đều, để yên 5 phút. Sau đó đem đi pha loãng với nước cất với tỉ lệ 1:1 . Rồi đem đi đo mật độ quang ở bước sóng 700nm.