khuẩn ở trên bã sắn
Thủy phân phytate trong bã sắn bằng enzyme thô thu được ở điều kiện thích hợp (nhiệt độ là 40oC và pH = 6). Cho enzyme thô thu được vào trong bã sắn có bổ sung thêm kháng sinh và natri benzoate để ức chế các vi sinh vật để tránh sai số do vi sinh vật tăng trong quá trình thủy phân phytate có trong bã sắn rồi đem đi ủ ở 24 giờ sau đó tiến hành đo lượng PO4 có trong mẫu để xác định lượng PO4 thu được (tham khảo ở phụ lục 5).
Kết quả đo được lượng PO4 có trong mẫu sau khi đo được là 0,62 mg% tương ứng với nồng độ phytate là 0,72mg%.
Nếu so với lượng phytate lúc ban đầu theo tài liệu là 0,989mg% [11] thì lượng % phytate thủy phân được là 72,8%.
Như vậy bước đầu thí nghiệm trên bã sắn, enzyme phytate thu được từ canh cấy chủng vi khuẩn Bacillus B7 thủy phân được một phần phytate trong bã sắn, góp phần trong việc sử dụng bã sắn làm thức ăn chăn nuôi.
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Kết luận:
Qua thời gian thực tập tốt nghiệp, đã cơ bản hoàn thành nội dung đề tài được giao. Kết quả cụ thể như sau:
Từ đậu nành lên men (Natto) đã chọn được chủng vi khuẩn Bacillus B7 sinh enzyme phytase.
Thời gian tối ưu nuôi cấy vi khuẩn B7 thu nhận enzyme phytase cao nhất trên môi trường lỏng là 24 giờ.
Nhiệt độ tối ưu của enzyme phytase thu được là 40 oC pH tối ưu của enzyme phytase thu nhận được là pH =6.
Lượng phytate trong bã sắn phân giải được sau 24 giờ là 7,2 mg%.
Đề nghị:
Phân lập thêm nhiều chủng vi khuẩn Bacillus khác nhau để có kết quả lựa chọn chủng vi khuẩn cho hoạt độ enzyme tốt nhất.
Khảo sát thêm các điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus.
Tiến hành khảo sát tiếp tục khả năng thủy phân enzyme trên bã sắn để có thể ứng dụng được trong chăn nuôi gia súc.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng việt
[1]. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyễn, Phạm Văn Ty (2000), “Vi sinh vật
học”, Nhà xuất bản giáo dục.
[2]. Nguyễn Lân Dũng (1983), “Thực hành vi sinh vật học”, Nhà xuất bản Đại học và trung học chuyên nghiệp, Hà Nội
[3]. Nguyễn Duy Khánh (2006), “Khảo sát điều kiện nuôi cấy và sinh bào tử vi
khuẩn Bacillus subtilis”, Luận văn kỹ sư, Trường đại học Nông lâm Thành phố Hồ
Chí Minh.
[4]. Nguyễn Thị Phương Như (2009), “Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi
khuẩn Bacillus có hoạt tính enzyme proteaza kiềm”, Đồ án tốt nghiệp, Trường đại
học Nha Trang.
[5]. Lương Đức Phẩm, “Công nghệ vi sinh vật”, Nhà xuất bản Nông nghiệp
[6]. Lê Quốc Phong (2007), “Nghiên cứu một số đặc tính và bước đầu thử nghiệm
ứng dụng enzyme phytase của Bacillus spp.”, Luận văn thạc sĩ, Trường đại học
Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
[7]. Bùi Thị Phi (2007), “Phân lập, khảo sát đặc điểm sinh học và tìm hiểu khả
năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis để sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học”, Khóa luận tốt nghiệp, Trường đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí
Minh.
[8]. Nguyễn Minh Trí, Nguyễn Thị Thanh Hải (2011), “Thực hành vi sinh vật thực
phẩm”, Khoa Công Nghệ thực phẩm, Trường Đại Học Nha Trang.
Tài liệu tiếng Anh
[9]. Afr. J. Biotechnol (2008), “Review Improvement in the nutritive quality of
cassava and its by-products through microbial fermentation”, Department of
Animal Production and Health, Federal University of Technology.
[10]. Alex Oderkirk (1998), “Phytase enzyme for Layers Poultry Fact sheet”, Poultry Specialist, Nova Scotia Department of Agriculture and Marketing.
[11]. Janne Kerovo (2000), “A novel phytase from Bacillus, characterization and
production of the enzyme”, Finland, Helsinky.
[12]. Tye A.J, Siu F.K.Y, Leung T.Y.C and Lim B.L (2002), “Molecular cloning
and the biochemical characterization of two novel phytase from B.subtilis 168 and B. licheniformis”, Applied and Enviromental Microbiology.
[13]. Young-OK Kim, Huyng-Kwoun Kim, Kyung-Sook bae, Ju-Hyun Yu, and Tae-Kwang Oh( 1998), “Purificcation and properties of a thermostable phytase
from Bacillus sp.DS11”, Enzym and Microbial Technology.
Trang web điện tử
[14].http://www.cynosura.org/index.php?option=com_content&view=article&id=1 33%3Anatto&catid=10%3Akhoahoc-congnghe&Itemid=82 [15].http://delloyd.50megs.com/moreinfo/buffers2.html [16].http://www.sigmaaldrich.com/life-science/core-bioreagents/biological- buffers/learning-center.html [17].http://en.wikipedia.org/wiki/Phytase [18].http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_subtilis [19].http://en.wikipedia.org/wiki/Phytic_acid [20].http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/cgi- bin/enzymes/GetPage.pl?ec_number=3
PHỤ LỤC
1. Phương pháp
1.1. Phương pháp giữ giống cấy chuyển
Các chủng vi khuẩn đã được phân lập nhiều lần sẽ đươc cấy trên môi trường thạch nghiêng là môi trường giữ giống, ở trong ống nghiệm.
Cách tiến hành: đổ môi trường giữ giống vào ống nghiệm rồi làm nút bông và giấy bạc sau đó đem đi hấp thanh trùng ở 1 atm ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút. Sau đó để nghiêng ống nghiệm chờ cho thạch đông. Tiếp theo, dùng que cấy đã được vô trùng lấy vi khuẩn trên môi trường đã được phân lập được, và cấy zich zắc vi khuẩn trên bề mặt thạch nghiêng. Đậy nút ống nghiệm lại để ở tủ ấm 37oC, sau 24 giờ thấy ống nghiệm xuất hiện khuẩn lạc thì chuyển ống nghiệm vào tủ lạnh để giữ giống.
Giống vi khuẩn được cấy chuyển 2 tuần 1 lần để giữ giống.
1.2. Một số phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn [2][8] Các chủng vi khuẩn được quan sát trên môi trường NA bằng mắt thường, và bằng kính hiển vi quang học. Các đặc điểm nuôi cấy, hình thái được đánh giá dựa trên các chỉ số: khả năng phát triển, hình dáng, màu sắc, bề mặt khuẩn lac.
1.2.1. Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc
Quan sát một số chỉ tiêu của chủng trên môi trường NA: Khả năng phát triển của khuẩn lạc
Bề mặt của khuẩn lạc Màu sắc của khuẩn lạc
1.2.2. Phương pháp nhuộm Gram [8]
Nguyên tắc: Sự bắt màu thuốc nhuộm của tế bào vi sinh vật là một quá trình hấp phụ, khả năng bắt màu của tế bào vi sinh vật có liên quan đến muối magie của axit ribonucleic. Khi nhuộm phức tạp muối này có phản ứng với thuốc nhuộm loại Tryphenylmetan (Genlatin violet, Oryatan violet, Metyl violet ) chịu được dưới tác dụng của cồn, nghĩa là không bị mất màu dưới tác dụng của cồn. Những vi khuẩn
như vậy gọi là vi khuẩn Gram dương (G+), ngược lại những vi khuẩn không giữ được màu khi xử lý như vậy gọi là vi khuẩn Gram âm (G-).
Cách tiến hành: cho một giọt nước cất lên trên phiếm kính, dùng que cấy vô trùng lấy tế bào vi khuẩn hòa với giọt nước. Hơ phiến kính lên ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần, chú ý không để phiến kính nóng quá thì tế bào vi khuẩn sẽ bị biến dạng. Để giọt nước bay hơi dần như vậy vi khuẩn sẽ bị gắn chặt vào phiếm kính.
Nhuộm violet lên vết bôi và giữ trong 20 giây sau đó rửa sạch bằng nước cất trong thời gian ngắn, làm ráo nước thừa.
Tiếp theo nhỏ dung dịch lugol lên tiêu bản để trong 1 phút.
Đổ hết dung dịch lugol đi và giội tràn qua cồn và tráng lại bằng nước cất rồi để khô vết bôi.
Nhuộm bổ sung bằng Fucshin trong 1 – 2 phút. Rồi rửa lại bằng nước cất và để khô.
Sau đó đem tiêu bản quan sát dưới kính hiển vi quang học có nhỏ dầu soi kính với độ phóng đại 100 lần.
Nếu vi khuẩn nhuộm màu tím thì đó là vi khuẩn Gram dương. Nếu vi khuẩn nhuộm màu hồng thì đó là vi khuẩn Gram âm.
1.3. Phương pháp xác định sự hình thành bào tử [6]
Sau khi phân lập được vi khuẩn thì tiến hành cấy ria trên môi trường thạch đĩa, sau đó đem đi ủ ở tủ ấm 37oC trong 2 – 3 ngày.
Sau vài ngày lấy ra tiến hành nhuộm gram rồi đem đi soi kính hiển vi quang học 100 lần. Nếu xuất hiện bào thì có hình tròn bên ngoài vòng có bắt màu tím còn bên trong không bắt màu tím.
2. Phụ lục bảng:
Phụ lục 1: Hoạt độ chung của phytase của 4 chủng khảo sát
Chủng ODoTB ODtTB ∆ODTB Hàm lượng phospho (nmol/ml) Hoạt độ phytase (đvhđ/ml) B1 0,59 0,67 0,07 54,09 18,03±3,05 B2 0,56 0,58 0,01 0,45 0,15±0,04 B3 0,51 0,64 0,13 105,90 31,30±2,37 B7 0,62 0,82 0,20 173 40,67±0,53
Phụ lục 2: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt độ phytase trong canh cấy
Thời gian (giờ) ODoTB ODtTB ∆ODTB Hàm lượng phospho (nmol/ml) Hoạt độ phytase (đvhđ/ml) 12 0,49 0,54 0,05 29,64 9,88±0,96 24 0,49 0,65 0,17 138,64 46,21±4,22 36 0,52 0,62 0,10 77,55 25,85±1,50 48 0,48 0,52 0,04 24,09 8,03±0,89 60 0,49 0,53 0,04 22,82 7,61±0,78 72 0,44 0,48 0,03 17,36 5,79±0,65
Phụ lục 3: Ảnh hưởng của nhiêt độ lên hoạt độ phytase
Nhiệt độ (oC) ODoTB ODtTB ∆ODTB Hàm lượng phospho (nmol/ml) Hoạt độ phytase (đvhđ/ml) 30 0,37 0,40 0,03 15 5±1,64 40 0,35 0,48 0,12 98 42,67±4,51 50 0,41 0,47 0,06 43,09 14,36±3,77 60 0,47 0,49 0,02 9,36 3,12±2,04
Phụ lục 4: Ảnh hưởng của pH lên hoạt độ phytase pH ODoTB ODtTB ∆ODTB Hàm lượng phospho (nmol/ml) Hoạt độ phytase (đvhđ/ml) 5 0,57 0,64 0,07 51,45 17,15±2,52 6 0,42 0,59 0,18 147,09 49,03±1,33 7 0,74 0,84 0,11 85,55 28,52±6,58 8 0,55 0,60 0,05 36,64 12,21±2,5
Phụ lục 5: Khảo sát thủy phân của enzyme phyate của vi khuẩn trên môi trường bã sắn
Thời
gian (giờ) ODoTB ODtTB ∆ODTB
Hàm lượng phospho (nmol/ml) Hàm lượng PO4 có trong bã sắn (mg%) Hàm lượng phytate thủy phân (mg%) 24 0,4566 0,494 0,0374 21,72727 0,62 0,72 3. Phụ lục hình:
Hình 2: Chủng Bacillus B7 phân lập được
Hình 4: Hoạt tính phân giải sinh enzyme phytase của Bacillus