Các khuẩn lạc được làm sạch thuần khiết bằng cách cấy phân lập và cấy lại nhiều lần. Sau ta tiến hành quan sát các khuẩn lạc mà ta đã phân lập được để lựa ra được vi khuẩn nào là vi khuẩn Bacillus.
Các chủng vi khuẩn mà ta phân lập được thì khuẩn lạc của nó có hình tròn đều, có màu trắng trong.
Hình 3.1: Phân lập khuẩn lạc chủng Bacillus
Sau khi đã phân lập được vi khuẩn Bacillus thì tiến hành cấy giữ giống trong các ống nghiệm các chủng mà đã phân lập được.
Tổng cộng có 7 giống vi khuẩn Bacillus đã tiến hành phân lập được trong
quá trình tiến hành phân lập chủng vi khuẩn.
Hình 3.2: Các chủng Bacillus phân lập được 3.3. Đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn
Các chủng được B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7 được làm tiêu bản và được quan sát trên kính hiển vi ta thấy là trực khuẩn Gram dương. Các chủng này có thể đứng riêng lẻ hoặc kết từng chuỗi dài ngắn khác nhau.
Khi nhuộm Gram quan sát dưới kính hiển vi có dầu soi kính với độ phóng đại 100 lần, ta nhận thấy cả 7 chủng này đều có hình que dài và đều bắt màu tím, khi ta để qua nhiều ngày và đem đi soi lại thì thấy được đây là vi khuẩn có sinh bào tử hình tròn phía bên ngoài của bào tử có hình tròn và bắt màu tím của violet còn phía bên trong không có bắt màu của thuốc nhuộm. Điều đó có thể xác định rằng chúng đều là vi khuẩn gram dương, sinh bào tử.
Qua nghiên cứu hình thái của tế bào khuẩn lạc và khả năng sinh bào tử của chúng, sơ bộ định danh được đây là chủng vi khuẩn Bacillus.
Hình 3.3: Hình thái tế bào của chủng Bacillus
3.4. Nghiên cứu khả năng sinh enzyme phytase của các chủng Bacillus
Ở nghiên cứu này tiến hành thí nghiệm trên môi trường đã được chuẩn bị sẵn. Để thử hoạt tính của enzyme nên đã tiến hành cấy chấm trên môi trường thạch. Trước khi cấy vào môi trường thì ta đổ CaCl2 đã được chuẩn bị sẵn vào môi trường nuôi cấy. Sau đó đổ môi trường ra đĩa rồi chờ cho thạch đông, chấm một vòng que cấy rồi chấm vào môi trường thạch, đem đi ủ ở 37oC trong vòng 24-48 giờ. Quan sát xem có xuất hiện vùng phân giải không.
Kết quả đo 7 chủng thì cho thấy rằng có 3 chủng không xuất hiện vòng phân giải và có 4 chủng có xuất hiện vòng phân giải điều đó chứng tỏ 4 chủng đều có khả năng sinh enzyme phytase. Trong đó, mỗi chủng đều có 1 đường kính phân giải khác nhau. Ở đây mới xác định được có 4 chủng có xuất hiện vòng phân giải đó là chủng B1, B2, B3 và B4. Vậy chủng B1, B2, B3, B7 đều có khả năng sinh enzyme phytase.
Hình 3.6: Hoạt tính phân giải enzyme phytase của 3 chủng Bacillus
Bảng 3.1: Đo đường kính của vòng phân giải của enzyme trong môi trường thạch.
Chủng vi khuẩn Đường kính đo được (mm) Đường kính vi khuẩn (mm) Đường kính của vòng phân giải (mm) B1 11,5 5 6,5 B2 9 4 5 B3 12 5 7 B4 13,5 6 7,5 Nhận xét:
Qua việc đo vòng phân giải thì vòng phân giải thì chủng B4 có vòng phân giải mạnh nhất là 7,5 mm chứng tỏ rằng khả năng phân giải của chủng B4 là cao nhất. Còn chủng B2 có vòng phân giải nhỏ nhất nên điều đó chứng rằng có khả năng phân giải là thấp nhất. Như vậy, khả năng phân giải của các chủng còn tùy thuộc do nhiều yếu tố tác động như mật độ của tế bào vi khuẩn nhiều hay ít, môi trường muôi cấy, thời gian nuôi cấy của vi khuẩn.
3.5. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp phytase của Bacillus trên môi trường lỏng
Chúng tôi tiến hành nuôi cấy các chủng Bacillus trên môi trường tăng sinh đã được chuẩn bị sẵn. Sau đó đem đi ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, rồi tiến hành
đi xác định hoạt độ enzyme phytase theo phương pháp xác định hoạt độ phytase (phương pháp Fiske và Subbarow).
3.5.1. Xây dựng đường chuẩn định lượng phospho
Đường chuẩn định lượng phospho thể hiện mối tương quan giữa
Bảng 3.2: Tương quan giữa giá trị ∆OD với hàm lượng phospho giá trị ∆OD700 với hàm lượng phospho
Ống số 1 2 3 4 5 6
Nồng độ phospho
(nmol/ml) 0 100 200 300 400 500
ODTB 0,01 0,14 0,26 0,37 0,48 0,57
∆OD 0 0,13 0,25 0,36 0,47 0,56
Hình 3.7: Đường biểu diễn sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ phospho và giá trị ∆OD700
Kết luận:
Như vậy việc sử dụng mối tương quan giữa giá trị ∆OD700 với hàm lượng phospho thu được công thức tính cho nồng độ phospho là x = (y-0,0135)/0,0011 với độ chính xác là R=0,9983. Vậy ta có thể sử dụng công thức trên để tiếp tục đi tính nồng độ phospho khác khi đi đo lượng phospho có trong mẫu.
3.5.2. Khảo sát hoạt độ phytase của chủng Bacillus trên môi trường lỏng
Tiến hành cấy tăng sinh trên môi trường BHB. Mỗi chủng được cấy trong một ống nghiệm chứa 10ml môi trường. Sau đó nuôi trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng.
Sau 24 giờ lấy ra và đem đi xác định hoạt độ enzyme (tham khảo ở phụ lục 1).
Hình 3.8: Hoạt độ chung của phytase của 3 chủng Bacillus nuôi cấy trong môi trường lỏng, cơ chất cảm ứng là sodium phytase.
Nhận xét:
Qua việc xác định hoạt độ phytase của Bacillus trên môi trường lỏng thì
trong số các chủng Bacillus mà ta khảo sát được thì các chủng Bacillus đều có khả năng sinh tổng hợp phytase. Hoạt độ của các chủng này có biên độ dao động khá rộng, trên 0 đến dưới 40 đvhđ/ml. Trong đó, chủng B7 có hoạt độ cao nhất 40,67 ± 0,53 đvhđ/ml, chủng B2 có hoạt độ thấp nhất 0,15 ± 0,004 đvhđ/ml, chủng B3 có hoạt độ khá cao 31,30 ± 2,37 đvhđ/ml, chủng B1 có hoạt độ là 18,03 ± 3,09 đvhđ/ml. Sự chênh lệch về hoạt độ của phytase ở từng chủng Bacillus có thể do
nhiều yếu tố tác động, trong đó có tác động của môi trường nuôi cấy, đặc tính sinh lý của từng chủng nuôi cấy.
Kết quả thí nghiệm trên, chúng tôi đã chọn chủng B7, chủng có hoạt độ phytase cao nhất để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.5.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến enzyme phytase sinh ra
B7 được nuôi cấy trên môi trường đã được chuẩn bị sẵn. Hoạt độ phytase đươc tiến hành khảo sát tại các thời điểm nuôi cấy: 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ và 72 giờ.
Sau đó đi tiến hành xác định hoạt độ phytase. Kết quả khảo sát hoạt độ phytase của B7 theo thời gian nuôi cấy được trình bày trong phụ lục 2.
Đường biểu diễn sự biến thiên hoạt độ phytase theo thời gian nuôi cấy được thể hiện ở Hình 3.9.
Hình 3.9: Đường biến thiên hoạt độ phytase của B7 theo thời gian nuôi cấy
Nhận xét:
Qua việc khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên hoạt độ phytase của vi khuẩn B7 ở môi trường lỏng thì hoạt độ cao nhất tại thời điểm 24 giờ sau khi cấy. Tại thời điểm này thì hoạt độ chung của phytase là 46,21 ± 4,22 đvhđ/ml. Khoảng thời gian nuôi cấy từ 12 đến 36 giờ , B7 sinh tổng hợp phytase với hoạt độ cao nhất. Sau 48
giờ nuôi cấy, thì hoạt độ của phytase sẽ giảm đáng kể. Khi nuôi cấy đến 72 giờ thì hoạt độ đạt thấp nhất là 5,79 ± 0,65 đvhđ/ml.
Vì vậy, qua kết quả nghiên cứu, chúng tôi xác định thời gian nuôi cấy B7 trên môi trường lỏng là 24 giờ, thời gian này được sử dụng để tiếp tục ở thí nghiệm tiếp theo.
3.6. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến khả năng thủy phân phytate của enzyme phytase enzyme phytase
3.6.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ phytase
B7 được nuôi cấy trên môi trường đã được chuẩn bị sẵn. Nuôi cấy ở 24 giờ ở nhiệt độ phòng sau đó đem đi ly tâm
Sau đó đem đi hút vào các ống nghiệm, mỗi ống nghiệm 10ml. Rồi đem đi ủ ở các bể ủ nhiệt ở nhiệt độ: 30oC, 40oC, 50oC, 60oC trong vòng 30 phút. Sau đó đi tiến hành xác định hoạt độ phytase. Kết quả khảo sát hoạt độ phytase của B7 theo pH nuôi cấy được trình bày trong phụ lục 3.
Đường biểu diễn sự biến thiên hoạt độ phytase theo nhiệt độ nuôi cấy trong cùng một môi trường được thể hiện ở Hình 3.10.
Nhận xét:
Nhiệt độ tối ưu cho hoạt độ phytase cao là 40oC (42,67 ± 4,51 đvhđ/ml). Trong khoảng 30oC đến 50oC, hoạt độ phytase khá cao. Điều này chứng tỏ là enzyme phytase của B7 có khả năng chịu nhiệt. Ở nhiệt độ trên 50oC, hoạt đô phytase giảm dần.
Dựa trên kết quả khảo sát trên, chúng tôi xác định nhiệt độ 40oC là tối ưu cho hoạt động của enzyme phytase, nhiệt độ này được lựa chọn để thực hiện các thí nghiệm tiếp.
3.6.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt độ phytase
B7 được nuôi cấy trên môi trường đã chuẩn bị sẵn rồi đem đi ủ thời gian là 24 giờ ở nhiệt độ phòng.
Sau đó lấy ra pha với dung dịch đệm, để yên trong vòng 30 phút. Sau đó tiến hành xác định hoạt độ phytase. Kết quả khảo sát hoạt độ phytase của B7 theo pH nuôi cấy được trình bày trong phụ lục 4.
Đường biểu diễn sự biến thiên hoạt độ phytase theo pH enzyme hoạt động trong cùng một môi trường được thể hiện ở Hình 3.11.
Nhận xét:
Hoạt độ chung của phytase tăng mạnh từ 5 đến 6; bắt đầu giảm từ 6 đến 8. pH = 8 có hoạt độ enzyme phytase thấp nhất là 12,21 ± 2,5 đvhđ/ml. pH có hoạt tính cao nhất là pH = 6 là 49,03 ± 1,33 đvhđ/ml.
Vì vậy, qua kết quả khảo sát, thì chúng tôi xác đinh pH = 6 là pH tối ưu cho hoạt động của enzyme phytase, pH này được sử dụng để đi làm các thí nghiệm tiếp theo.
3.7. Kết quả đánh giá sơ bộ khả năng thủy phân của enzyme phytase của vi khuẩn ở trên bã sắn khuẩn ở trên bã sắn
Thủy phân phytate trong bã sắn bằng enzyme thô thu được ở điều kiện thích hợp (nhiệt độ là 40oC và pH = 6). Cho enzyme thô thu được vào trong bã sắn có bổ sung thêm kháng sinh và natri benzoate để ức chế các vi sinh vật để tránh sai số do vi sinh vật tăng trong quá trình thủy phân phytate có trong bã sắn rồi đem đi ủ ở 24 giờ sau đó tiến hành đo lượng PO4 có trong mẫu để xác định lượng PO4 thu được (tham khảo ở phụ lục 5).
Kết quả đo được lượng PO4 có trong mẫu sau khi đo được là 0,62 mg% tương ứng với nồng độ phytate là 0,72mg%.
Nếu so với lượng phytate lúc ban đầu theo tài liệu là 0,989mg% [11] thì lượng % phytate thủy phân được là 72,8%.
Như vậy bước đầu thí nghiệm trên bã sắn, enzyme phytate thu được từ canh cấy chủng vi khuẩn Bacillus B7 thủy phân được một phần phytate trong bã sắn, góp phần trong việc sử dụng bã sắn làm thức ăn chăn nuôi.
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Kết luận:
Qua thời gian thực tập tốt nghiệp, đã cơ bản hoàn thành nội dung đề tài được giao. Kết quả cụ thể như sau:
Từ đậu nành lên men (Natto) đã chọn được chủng vi khuẩn Bacillus B7 sinh enzyme phytase.
Thời gian tối ưu nuôi cấy vi khuẩn B7 thu nhận enzyme phytase cao nhất trên môi trường lỏng là 24 giờ.
Nhiệt độ tối ưu của enzyme phytase thu được là 40 oC pH tối ưu của enzyme phytase thu nhận được là pH =6.
Lượng phytate trong bã sắn phân giải được sau 24 giờ là 7,2 mg%.
Đề nghị:
Phân lập thêm nhiều chủng vi khuẩn Bacillus khác nhau để có kết quả lựa chọn chủng vi khuẩn cho hoạt độ enzyme tốt nhất.
Khảo sát thêm các điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus.
Tiến hành khảo sát tiếp tục khả năng thủy phân enzyme trên bã sắn để có thể ứng dụng được trong chăn nuôi gia súc.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng việt
[1]. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyễn, Phạm Văn Ty (2000), “Vi sinh vật
học”, Nhà xuất bản giáo dục.
[2]. Nguyễn Lân Dũng (1983), “Thực hành vi sinh vật học”, Nhà xuất bản Đại học và trung học chuyên nghiệp, Hà Nội
[3]. Nguyễn Duy Khánh (2006), “Khảo sát điều kiện nuôi cấy và sinh bào tử vi
khuẩn Bacillus subtilis”, Luận văn kỹ sư, Trường đại học Nông lâm Thành phố Hồ
Chí Minh.
[4]. Nguyễn Thị Phương Như (2009), “Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi
khuẩn Bacillus có hoạt tính enzyme proteaza kiềm”, Đồ án tốt nghiệp, Trường đại
học Nha Trang.
[5]. Lương Đức Phẩm, “Công nghệ vi sinh vật”, Nhà xuất bản Nông nghiệp
[6]. Lê Quốc Phong (2007), “Nghiên cứu một số đặc tính và bước đầu thử nghiệm
ứng dụng enzyme phytase của Bacillus spp.”, Luận văn thạc sĩ, Trường đại học
Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
[7]. Bùi Thị Phi (2007), “Phân lập, khảo sát đặc điểm sinh học và tìm hiểu khả
năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis để sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học”, Khóa luận tốt nghiệp, Trường đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí
Minh.
[8]. Nguyễn Minh Trí, Nguyễn Thị Thanh Hải (2011), “Thực hành vi sinh vật thực
phẩm”, Khoa Công Nghệ thực phẩm, Trường Đại Học Nha Trang.
Tài liệu tiếng Anh
[9]. Afr. J. Biotechnol (2008), “Review Improvement in the nutritive quality of
cassava and its by-products through microbial fermentation”, Department of
Animal Production and Health, Federal University of Technology.
[10]. Alex Oderkirk (1998), “Phytase enzyme for Layers Poultry Fact sheet”, Poultry Specialist, Nova Scotia Department of Agriculture and Marketing.
[11]. Janne Kerovo (2000), “A novel phytase from Bacillus, characterization and
production of the enzyme”, Finland, Helsinky.
[12]. Tye A.J, Siu F.K.Y, Leung T.Y.C and Lim B.L (2002), “Molecular cloning
and the biochemical characterization of two novel phytase from B.subtilis 168 and B. licheniformis”, Applied and Enviromental Microbiology.
[13]. Young-OK Kim, Huyng-Kwoun Kim, Kyung-Sook bae, Ju-Hyun Yu, and Tae-Kwang Oh( 1998), “Purificcation and properties of a thermostable phytase
from Bacillus sp.DS11”, Enzym and Microbial Technology.
Trang web điện tử
[14].http://www.cynosura.org/index.php?option=com_content&view=article&id=1 33%3Anatto&catid=10%3Akhoahoc-congnghe&Itemid=82 [15].http://delloyd.50megs.com/moreinfo/buffers2.html [16].http://www.sigmaaldrich.com/life-science/core-bioreagents/biological- buffers/learning-center.html [17].http://en.wikipedia.org/wiki/Phytase [18].http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_subtilis [19].http://en.wikipedia.org/wiki/Phytic_acid [20].http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/cgi- bin/enzymes/GetPage.pl?ec_number=3
PHỤ LỤC
1. Phương pháp
1.1. Phương pháp giữ giống cấy chuyển
Các chủng vi khuẩn đã được phân lập nhiều lần sẽ đươc cấy trên môi trường thạch nghiêng là môi trường giữ giống, ở trong ống nghiệm.
Cách tiến hành: đổ môi trường giữ giống vào ống nghiệm rồi làm nút bông và giấy bạc sau đó đem đi hấp thanh trùng ở 1 atm ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút. Sau đó để nghiêng ống nghiệm chờ cho thạch đông. Tiếp theo, dùng que cấy đã được vô trùng lấy vi khuẩn trên môi trường đã được phân lập được, và cấy zich zắc vi khuẩn trên bề mặt thạch nghiêng. Đậy nút ống nghiệm lại để ở tủ ấm 37oC, sau 24 giờ thấy ống nghiệm xuất hiện khuẩn lạc thì chuyển ống nghiệm vào tủ lạnh để giữ giống.
Giống vi khuẩn được cấy chuyển 2 tuần 1 lần để giữ giống.
1.2. Một số phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn [2][8] Các chủng vi khuẩn được quan sát trên môi trường NA bằng mắt thường, và bằng kính hiển vi quang học. Các đặc điểm nuôi cấy, hình thái được đánh giá dựa trên các chỉ số: khả năng phát triển, hình dáng, màu sắc, bề mặt khuẩn lac.
1.2.1. Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc
Quan sát một số chỉ tiêu của chủng trên môi trường NA: Khả năng phát triển của khuẩn lạc
Bề mặt của khuẩn lạc Màu sắc của khuẩn lạc
1.2.2. Phương pháp nhuộm Gram [8]
Nguyên tắc: Sự bắt màu thuốc nhuộm của tế bào vi sinh vật là một quá trình hấp phụ, khả năng bắt màu của tế bào vi sinh vật có liên quan đến muối magie của axit ribonucleic. Khi nhuộm phức tạp muối này có phản ứng với thuốc nhuộm loại Tryphenylmetan (Genlatin violet, Oryatan violet, Metyl violet ) chịu được dưới tác dụng của cồn, nghĩa là không bị mất màu dưới tác dụng của cồn. Những vi khuẩn
như vậy gọi là vi khuẩn Gram dương (G+), ngược lại những vi khuẩn không giữ được màu khi xử lý như vậy gọi là vi khuẩn Gram âm (G-).
Cách tiến hành: cho một giọt nước cất lên trên phiếm kính, dùng que cấy vô trùng lấy tế bào vi khuẩn hòa với giọt nước. Hơ phiến kính lên ngọn lửa đèn cồn 2 –