PHÂN lập, TUYỂN CHỌN và sử DỤNG VI KHUẨN LACTIC SINH BACTERIOCIN TRONG bảo QUẢN cá GIÒ tươi NGUYÊN LIỆU

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG LƯU THỊ THÚY PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ SỬ DỤNG VI KHUẨN LACTIC SINH BACTERIOCIN TRONG BẢO QUẢN CÁ GIÒ TƯƠI NGUYÊN LIỆU LUẬN VĂN THẠC SĨ Nha Trang - 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG LƯU THỊ THÚY PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ SỬ DỤNG VI KHUẨN LACTIC SINH BACTERIOCIN TRONG BẢO QUẢN CÁ GIÒ TƯƠI NGUYÊN LIỆU Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch Mã số: 60 54 10 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. NGUYỄN VĂN DUY TS. VŨ NGỌC BỘI Nha Trang - 2012 - i - LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Tác giả luận văn - ii - LỜI CẢM ƠN Trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS.Nguyễn Văn Duy – Phó Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường – Trường Đại học Nha Trang và TS. Vũ Ngọc Bội – Trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nha Trang đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình làm đề tài, hai thầy đã cung cấp và truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu giúp tôi hoàn thành luận văn này. Cảm ơn sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo phòng thí nghiệm Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường – Trường Đại học Nha Trang, gia đình và bạn bè luôn luôn chia sẽ cùng tôi trong quá trình nghiên cứu. - iii - MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH viii LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 4 1.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic 4 1.1.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic 4 1.1.2 Phân loại 5 1.1.3 Nhu cầu dinh dưỡng và các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic 7 1.1.4 Ứng dụng 8 1.2 Bacteriocin 11 1.2.1 Phân loại bacteriocin 12 1.2.2 Một số tính chất của bacteriocin 14 1.3 Cá Giò 16 1.4 Biến đổi chất lượng nguyên liệu thủy sản sau khi chết 18 1.4.1 Hệ vi sinh vật trong cá tươi 18 1.4.2 Biến đổi chất lượng của nguyên liệu thủy sản sau khi chết 19 1.5 Các phương pháp bảo quản cá 24 1.6 Tình hình nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin trong bảo quản thực phẩm 28 1.6.1 Trên thế giới 28 1.6.2 Trong nước 29 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 Đối tượng nghiên cứu 31 2.1.1 Nước dưa 31 2.1.2 Chủng vi khuẩn chỉ thị 31 - iv - 2.1.3 Cá giò 32 2.1.4 Thiết bị chuyên dụng 32 2.1.5 Hóa chất, môi trường 33 2.2 Phương pháp nghiên cứu 33 2.2.1 Phân lập vi khuẩn lactic 33 2.2.2 Xác định đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn lactic 33 2.2.3 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin 34 2.2.4 Xác định cơ chế kháng khuẩn của chủng phân lập 34 2.2.5 Xác định mức độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic 35 2.2.6 Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp của vi khuẩn lactic 35 2.2.7 Xác định phổ ức chế của vi khuẩn lactic sinh bacteriocin 36 2.2.8 Xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic trên cá Giò nguyên liệu 36 2.2.9 Xác định tổng vi khuẩn hiếu khí 37 2.2.10 Thí nghiệm kiểm tra khả năng kháng Salmonella, Vibrio của vi khuẩn lactic trong quá trình bảo quản 37 2.2.11 Thí nghiệm bảo quản cá Giò bằng vi khuẩn lactic 37 2.2.12 Đánh giá chất lượng của cá 38 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Phân lập vi khuẩn lactic từ nước dưa muối lên men truyền thống 40 3.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin 41 3.3 Phổ ức chế của 5 chủng vi khuẩn lactic đã tuyển chọn 43 3.4 Xử lý dịch chiết tế bào với enzym proteinase K và α-Chymotrypsin 49 3.5 Cơ chế kháng khuẩn của dịch bacteriocin thô của chủng vi khuẩn lactic T13 50 3.6 Đặc điểm sinh trưởng và sinh bacteriocin của chủng T13 trên môi trường MRS 51 3.7 Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp 53 3.7.1 Ảnh hưởng cuả nguồn cacbon đến sinh trưởng phát triển của vi khuẩn lactic T13 53 3.7.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ lên sinh trưởng của vi khuẩn lactic T13 54 3.7.3 Ảnh hưởng của pH đối với sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic T13 55 3.7.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng của vi khuẩn lactic T13 56 3.8 Khả năng sinh trưởng và sinh bacteriocin của chủng vi khuẩn lactic T13 trên da cá giò 57 - v - 3.8.1 Tổng số vi khuẩn lactic trên da cá giò nguyên liệu tươi 57 3.8.2 Sự phát triển của tổng vi khuẩn hiếu khí trên da cá sau khi được nhúng vào dịch vi khuẩn lactic T13 58 3.9 Thử nghiệm sử dụng vi khuẩn lactic T13 trong bảo quản cá giò tươi nguyên liệu 59 3.9.1 Kết quả đánh giá cảm quan 59 3.9.2 Kết quả đánh giá chỉ tiêu hóa học 61 3.9.3 Kết quả kiểm tra vi sinh vật 62 3.10 Qui trình bảo quản cá giò nguyên liệu tươi bằng vi khuẩn lactic T13 67 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69 KẾT LUẬN 69 KIẾN NGHỊ 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 1 PHỤ LỤC 2 PHỤ LỤC 3 PHỤ LỤC 4 - vi - BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Stt Ký hiệu Nghĩa 1 CFU Colony forming unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc) 2 LAB Lactic acid bacteria (Vi khuẩn lactic) 3 MRS de Man, Rogosa and Shatpe (Môi trường nuôi cấy Lactobacillus) 4 PCA Plate Count Agar (Môi trường nuôi cấy vi khuẩn tổng số) 5 OD Optical Density (Mật độ quang) 6 TSA Trypton soy agar (Môi trường rắn nuôi cấy vi khuẩn tổng số) 7 TSB Trypton soy broth (Môi trường lỏng nuôi cấy vi khuẩn tổng số) - vii - DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Bảng phân loại bacteriocin 14 Bảng 1.2 Tính chất hóa lý của một số bacteriocin của vi khuẩn Gram dương 15 Bảng 2.1 Bảng chỉ tiêu cảm quan của cá giò 39 Bảng 3.1 Bảng khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch ngoại bào từ vi khuẩn lactic 41 Bảng 3.2 Đường kính vòng kháng khuẩn của 5 chủng lactic T4, T13, T12, T8, O16 với các chủng chỉ thị 45 - viii - DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh tế bào của một số chủng vi khuẩn lactic 8 Hình 1.2 Cấu trúc một số bacteriocin 13 Hình 1.3 Cơ chế hoạt động của các loại bacteriocin của vi khuẩn lactic 14 Hình 1.4 Ảnh cá giò 18 Hình 2.1 Ảnh nước dưa chua 31 Hình 2.2 Ảnh Cá giò nguyên liệu tươi 32 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định phổ ức chế của vi khuẩn lactic đối với một số vi khuẩn gây bệnh 36 Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian bảo quản cá giò 38 Hình 3.1 Khuẩn lạc của vi khuẩn lactic T13 trên môi trường thạch MRS 40 Hình 3.2 Tế bào của chủng vi khuẩn lactic T13 sau khi nhuộm Gram được quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại X-100 40 Hình 3.3 Các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nước dưa thể hiện tính kháng với chủng chỉ thị Salmonella Sal 1 trên môi trường XL 42 Hình 3.4 Hình ảnh vòng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic với chủng chỉ thị Vibrio C1 (A) và Bacillus B1.1 (B) 42 Hình 3.5 (A) Vòng kháng khuẩn của 5 chủng vi khuẩn lactic với chủng Salmonella Sal1 và Bacillus (B1.1, B2.3) 46 Hình 3.5 (B) Vòng kháng khuẩn của 5 chủng vi khuẩn lactic với chủng E. Coli (H10b, L2.1, TN3, TN4.1, TN4.2, TN5.2 ) 47 Hình 3.5 (C) Vòng kháng khuẩn của 5 chủng vi khuẩn lactic với chủng chỉ thị E. coli GA, Vibrio (C1, V3.3, CR6, CR7), S. aureus 48 Hình 3.6 Hình ảnh vòng kháng khuẩn của dịch bacteriocin từ chủng T13 khi xử lý với proteinase K (A) và với α-chymotrypsin (B) 49 Hình 3.7 Ảnh hưởng của dịch bacteriocin thô của vi khuẩn lactic T13 lên sự sinh trưởng của Bacillus B1.1 50 Hình 3.8 Mối quan hệ giữa sự sinh trưởng tính theo mật độ quang và khả năng sinh bacteriocin tính theo đường kính vòng kháng khuẩn của chủng vi khuẩn lactic T13 nuôi trên môi trường MRS, ở pH 6,8 và nhiệt độ 37 O C 52 [...]... ng vi sinh v t có trong cá ph thu c vào ngu n g c cá s ng (ngu n nư c ô nhi m nhi u hay ít) Nhìn chung, h vi sinh v t trong cá r t a d ng và phong phú, g m lo i vi sinh v t trong nư c, trong t bùn và th c ăn Thư ng cá trên cơ th có nhi u vi khu n Gram dương, cá vùng ôn y các vùng nhi t i thì i thì vi khu n Gram âm chi m ưu th Ngoài vi khu n trong cá còn có c n m m c Các lo i vi khu n thư ng g p cá. .. tính này các loài là khác nhau, thư ng tr c khu n là cao nh t - Vi khu n lactic có kh năng sinh ra ch t kháng sinh c ch các vi khu n gây b nh 1.1.2 Phân lo i D a vào kh năng lên men lactic t các nguyên li u ch a ư ng, ngư i ta có th chia thành hai nhóm vi khu n lactic: vi khu n lactic d hình và vi khu n lactic ng hình - Vi khu n lactic d hình Khi ti n hành lên men các dung d ch ư ng, các vi khu n lactic. .. tươi v i m c tiêu tuy n ch n các ch ng vi khu n lactic có kháng sinh bacteriocin và th nghi m s d ng các vi khu n lactic này b o qu n sinh h c cá giò tươi nguyên li u Ý nghĩa khoa h c Nghiên c u ã phân l p và tuy n ch n ư c b sưu t p các ch ng vi khu n lactic sinh bacteriocin t nư c dưa chua Nghiên c u cơ ch kháng khu n và ph vi khu n lactic c ch c a i v i m t s vi khu n gây b nh Bên c nh ó, chúng tôi... fluorescens Trong mang còn t n t i nhi u vi sinh v t c a nư c và t bùn Trong ru t cá có nhi u vi sinh v t c a nư c, t bùn và c a th c ăn ưa vào, có nhi u vi khu n k khí sinh bào t Trong ru t cá thư ng th y Clostridium sporogenes, Cl putrificus aerobacter và nhóm E coli S lư ng vi sinh v t trong ru t cá kho ng 103 n 108 t bào trên 1 cm2 Theo Shewan (1962) thì s lư ng vi sinh v t trên da và n i t ng cá s ng... u b o qu n nguyên li u cá giò làm h n ch hư h ng có ý nghĩa kinh t l n - 18 - Hình 1.4 nh cá giò [34] 1.4 Bi n i ch t lư ng nguyên li u th y s n sau khi ch t 1.4.1 H vi sinh v t trong cá tươi Vi sinh v t t n t i trong cá có hai ngu n g c [7]: b lây nhi m khi còn s ng (nư c là môi trư ng nhi u vi sinh v t Vi sinh v t lây nhi m vào cá qua v t xây xát, vào tu n hoàn và h hô h p và ăn th c ăn) M t khác... sinh trư ng c a vi khu n lactic trên da cá giò nguyên li u ánh giá kh năng s d ng vi khu n lactic trong b o qu n nguyên li u cá giò tươi -4- CHƯƠNG 1 T NG QUAN 1.1 Gi i thi u vi khu n lactic Vi khu n lactic thu c nhóm vi khu n Gram dương, không sinh bào t , có kh năng lên men ư ng thành acid lactic Nhóm vi khu n lactic ư c x p chung vào h Lactobacteriacae Nhóm vi khu n này có r t nhi u hình d ng khác... n và con ngư i tr c ti p s n xu t) Cá khi còn s ng ngoài da có m t l p nh t là môi trư ng sinh s ng t t cho vi sinh v t, s lư ng vi sinh v t trên da cá t 102 n 105 t bào trên 1cm2 da cá ây t n t i các lo i tr c khu n sinh và không sinh bào t như Pseudomonas fluorescens, Proteus vulgaris, Micrococus reseus, E coli và m t s n m men s ng trong nư c Trong cá có r t nhi u vi sinh v t, ây a s là nhóm vi sinh. .. Salmonella trên cá giò sau khi gây nhi m Hình 3.19 th so sánh m t ngày th 5 63 t bào c a vi khu n Salmonella trên m u cá giò b o qu n v i vi khu n lactic và m u i ch ng 63 Hình 3.20 T ng s vi khu n Vibrio trên cá giò sau khi gây nhi m Hình 3.21 th so sánh m t qu n v i vi khu n lactic và m u ngày th 5 64 t bào c a vi khu n Vibrio trên m u cá giò b o i ch ng 64 Hình 3.22T ng vi khu n hi... reuterin và reutericyclin c bi t, vi khu n lactic có th s n sinh ra các phân t bacteriocin và nh ng phân t tương t bacteriocin ch ng l i ho t ng c a các vi khu n g n gũi M t vài ch ng vi khu n lactic còn có th t ng h p nh ng peptide kháng khu n khác Nh ng ch t kháng sinh có b n ch t protein này ang ư c ng d ng nâng cao ch t lư ng b o qu n và an toàn v sinh th c ph m [12,17] 1.1.1 c i m chung c a vi khu n lactic. .. b o qu n sinh h c giá thành r góp ph n làm gi m chi phí s n xu t cho các doanh nghi p ch bi n th y s n và M c ích c a m b o tính an toàn cho ngư i tiêu dùng tài Phân l p và tuy n ch n nh ng ch ng vi khu n lactic sinh bacteriocin t nư c dưa mu i nh m th nghi m ng d ng vào b o qu n cá giò tươi nguyên li u N i dung nghiên c u c a tài 1 Phân l p và tuy n ch n m t s ch ng vi khu n lactic sinh bacteriocin . khuẩn lactic sinh bacteriocin trong bảo quản cá giò nguyên liệu tươi với mục tiêu tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có kháng sinh bacteriocin và thử nghiệm sử dụng các vi khuẩn lactic. GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG LƯU THỊ THÚY PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ SỬ DỤNG VI KHUẨN LACTIC SINH BACTERIOCIN TRONG BẢO QUẢN CÁ GIÒ TƯƠI NGUYÊN LIỆU . GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG LƯU THỊ THÚY PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ SỬ DỤNG VI KHUẨN LACTIC SINH BACTERIOCIN TRONG BẢO QUẢN CÁ GIÒ TƯƠI NGUYÊN LIỆU