tình hình nhiễm listeria monocytogenes trên nem chua chế biến tại nha trang

i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp này: Trước hết em xin gửi tới Ban giám hiệu Trường Đại Học Nha Trang, Phòng Đào Tạo Đại Học và sau Đại Học, Khoa Công Nghệ Thực phẩm và quý thầy cô giáo trong khoa Công Nghệ Thực Phẩm sự kính trọng, niềm tự hào được học tập tại trường trong nhưng năm qua. Xin chân thành cảm ơn quý thầy cô giáo trong khoa Công Nghệ Thực Phẩm, quý thầy cô phòng thí nghiệm Hóa Sinh – Vi Sinh, phòng Công Nghệ Sinh Học, phòng thực hành khoa Nuôi Trồng Thủy Sản đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp. Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ths. Nguyễn Thị Thanh Hải đã tận tình giúp đỡ và trực tiếp hướng dẫn em hoàn thành đề tài. Xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã giúp đỡ tạo mọi điều kiện cho em hoàn thành đề tài này. Nha Trang, tháng 6 năm 2012 Sinh viên Nguyễn Thị Dung ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3 1.1 TỔNG QUAN VỀ SẢN PHẨM NEM CHUA 3 1.1.1 Nem chua 3 1.1.2 Nguyên liệu thịt heo 7 1.1.3 Da heo 9 1.2 CÁC BIẾN ĐỔI TRONG QUÁ TRÌNH CHẾ BIẾN NEM CHUA 9 1.2.1 Các biến đổi của thịt 9 1.2.1.1 Sự phân giải glycogen 9 1.2.1.2 Quá trình chín của thịt 10 1.2.2 Quá trình lên men lactic 10 1.2.2.1 Định nghĩa 10 1.2.2.2 Sự tạo thành acid lactic 11 1.2.3 Quá trình tạo hương và vị cho sản phẩm nem chua 12 1.3 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LISTERIA MONOCYTOGENES 13 1.3.1 Giới thiệu chung về giống vi khuẩn Listeria spp và loài Listeria monocytogenes 13 1.3.2 Hình thái và cấu tạo vi khuẩn Listeria monocytogenes 14 1.3.3 Khả năng chịu đựng 14 1.3.4 Phân bố và nguồn lây nhiễm 14 1.3.5. Đặc điểm gây bệnh. 15 1.3.5.1. Nguyên nhân gây bệnh 15 1.3.5.2 Cơ chế sinh bệnh 15 iii 1.3.5.3 Triệu chứng gây bệnh 16 1.3.5.4 Nguy cơ mắc bệnh 16 1.3.5.5 Biện pháp phòng tránh 17 1.3.6 Tần suất và tỷ lệ tử vong khi nhiễm Listeria monocytogenes 17 1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA LISTERIA MONOCYTOGENES 18 1.4.1 Phương pháp xác định Listeria monocytogenes 18 1.4.2 Các phương pháp định lượng Listeria monocytogenes 19 1.5 TÌNH HÌNH NHIỄM LISTERIA MONOCYTOGENES TRONG THỰC PHẨM TRÊN TOÀN THẾ GIỚI VÀ TRONG NƯỚC 20 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 23 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.2.1 Mẫu nghiên cứu 23 2.2.2 Môi trường, hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 24 2.2.2.1 Môi trường 24 2.2.2.2 Hóa chất 24 2.2.2.3 Máy và dụng cụ thí nghiệm 25 2.2.3 Kiểm tra Listeria monocytogenes theo phương pháp MPN (Most Probable Number) 25 2.2.4 Bố trí thí nghiệm 26 2.2.4.1 Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes trên nguyên liệu chế biến nem chua 26 2.2.4.2 Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes trong sản phẩm nem chua 26 2.2.5 Quy trình thực hiện 27 2.2.5.1 Xử lý mẫu và tăng sinh 28 2.2.5.2 Định danh Listeria monocytogenes từ các ống nghiệm cấy tăng sinh 29 2.2.6 Thử khả năng tan huyết 32 iv 2.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 32 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 TÌNH HÌNH NHIỄM LISTERIA MONOCYTOGENES TRÊN NGUYÊN LIỆU LÀM NEM CHUA 33 3.2 TÌNH HÌNH NHIỄM LISTERIA MONOCYTOGENES TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN NEM CHUA TRONG ĐIỀU KIỆN THƯỜNG 34 3.3 TÌNH HÌNH NHIỄM LISTERIA MONOCYTOGENES TRONG QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN NEM CHUA Ở ĐIỀU KIỆN THƯỜNG 36 3.4 TÌNH HÌNH NHIỄM LISTERIA MONOCYTOGENES TRONG QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN NEM CHUA Ở ĐIỀU KIỆN LẠNH 37 3.5 KẾT LUẬN 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 40 1. Kết luận 40 2. Đề xuất ý kiến 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC BẢNG v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Giới hạn cho phép chỉ tiêu vi sinh vật đối với sản phẩm thịt lên men theo tiêu chuẩn Food Safety Standard of Australia & New Zealand 6 Bảng 1.2 Giới hạn cho phép chỉ tiêu vi sinh vật đối với sản phẩm ăn liền (Salami và xúc xích lên men) của Ireland 7 Bảng 1.3: Thành phần hóa học của thịt 8 Bảng 1.4: Sự khác nhau của loài Listeria 20 Bảng 3.1: Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes trong nguyên liệu 33 Bảng 3.2: Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes của nem trong quá trình lên men 34 Bảng 3.3: Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes của nem chua trong điều kiện bảo quản thường 36 Bảng 3.4: Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes của nem chua trong điều kiện bảo quản lạnh 37 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Nem chua 5 Hình 1.2: Vi khuẩn Listeria monocytogenes 14 Hình 1.3: Cận cảnh Listeria monocytogenes qua kính hiển vi điện tử. 14 Hình 2.1: Bản đồ khu vực lấy mẫu 23 Hình 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm phát hiện và định lượng Listeria monocytogenes trên nguyên liệu 26 Hình 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm phát hiện và định lượng Listeria monocytogenes trong thời gian lên men 26 Hình 2.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm phát hiện và định lượng Listeria monocytogenes trong quá trình bảo quản 27 Hình 2.5: Sơ đồ xử lý mẫu và tăng sinh 28 Hình 2.6: Ống chứa môi trường BLEB dùng cho một mẫu thí nghiệm 29 Hình 2.7: Sơ đồ định danh Listeria monocytogenes 29 Hình 2.8: Esculin dương tính (bên trái) - Esculin âm tính (bên phải) 30 Hình 2.9: Các ống nghiệm kiểm tra khả năng lên men đường Rhamnose và Xylose. Dương tính (màu vàng) âm tính (màu xanh) 30 Hình 2.10: Vi khuẩn Listeria monocytogenes bắt màu tím khi nhuộm gram 31 Hình 2.11: Hình ảnh Listeria monocytogenes trên thạch máu cừu 32 Hình 3.1: Đồ thị biểu hiện tỷ lệ mẫu nhiễm Listeria monocytogenes qua các ngày bảo quản 39 1 LỜI MỞ ĐẦU Việt Nam là một nước nông nghiệp thuộc về xứ nóng, vùng nhiệt đới gió mùa. Ngoài ra lãnh thổ Việt Nam được chia ra ba miền rõ rệt là Bắc, Trung, Nam. Chính các đặc điểm về địa lý, văn hóa, dân tộc, khí hậu đã quy định những đặc điểm riêng của ẩm thực từng vùng - miền. Mỗi miền có một nét, khẩu vị đặc trưng. Điều đó góp phần làm ẩm thực Việt Nam phong phú, đa dạng. Ẩm thực Việt Nam còn đặc trưng với sự trung dung trong cách pha trộn nguyên liệu không quá cay, quá ngọt hay quá béo. Các nguyên liệu phụ (gia vị) để chế biến món ăn Việt Nam rất phong phú, bao gồm nhiều loại rau thơm như húng thơm, tía tô, kinh giới, hành, thì là, mùi tàu v.v.; gia vị thực vật như ớt, hạt tiêu, sả, hẹ, tỏi, gừng, chanh quả hoặc lá non; các gia vị lên men như mẻ, mắm tôm, bỗng rượu, dấm thanh hoặc kẹo đắng, nước cốt dừa v.v. Gắn liền với những hương vị đặc trưng đó là những món ăn truyền thống in sâu trong lòng người Việt Nam ngày nay như: giò, chả, nem chua,… Cùng với sự phát triển của xã hội, chất lượng cuộc sống ngày một được nâng cao thì “ăn ngon, mặc đẹp” đang phù hợp đối với đại bộ phận con người ngày nay. Minh chứng cho điều này là thực phẩm đang tràn ngập trên các thị trường, đa dạng về chủng loại, mẫu mã, hình thức. Cùng với sự phát triển đó thì những năm gần đây, công tác bảo đảm chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm (ATVSTP) phòng chống ngộ độc thực phẩm và các bệnh truyền qua thực phẩm ngày càng được mọi tầng lớp trong xã hội quan tâm nhưng chúng ta chỉ lưu ý đến một số loại vi khuẩn chủ yếu như E.coli, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringgens mà chưa lưu ý đến một số loại khác như Listeria monocytogene. Nguyên nhân không phải là vì chúng ta không biết về những nguy hiểm do Listeria monocytogenes gây ra mà vì với các phương pháp xét nghiệm lâu nay chúng ta áp dụng như soi trên kính, nhuộm v.v chỉ thấy được các nhóm vi khuẩn chung, còn việc tìm cụ thể một vi khuẩn như Listeria monocytogenes thì phải cần nhiều đến kỹ thuật chuyên môn vi sinh. 2 Từ thực tế trên cùng với sự định hướng và giúp đỡ nhiệt tình của quý thầy cô, sau gần 3 tháng nghiên cứu đến nay em đã cơ bản hoàn thành đề tài: “Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes trên nem chua chế biến tại Nha Trang” Mục đích của đề tài: Xác định mức độ nhiễm vi khuẩn Listeria monocytogene trong sản phẩm nem chua và mức độ ảnh hưởng của quá trình lên men lactic đến số lượng vi sinh vật. Nội dung nghiên cứu của đề tài: Tìm hiểu về Listeria monocytogenes trên thực phẩm chế biến sẵn. Xác định số lượng Listeria monocytogenes trên nguyên liệu chế biến nem. Xác định số lượng Listeria monocytogenes trên nem chua trong quá trình lên men. Đánh giá mức độ nhiễm Listeria monocytogenes trên sản phẩm nem chua. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tế: Đề tài nghiên cứu mức độ nhiễm Listeria monocytogenes trong các sản phẩm lên men lactic. Nghiên cứu sự ảnh hưởng của acid lactic đến số lượng vi khuẩn Listeria monocytogenes trong các sản phẩm lên men lactic Do thời gian cũng như khả năng nghiên cứu có hạn nên báo cáo đồ án tốt nghiệp của em không tránh khỏi những hạn chế, em rất mong nhận được các ý kiến đóng góp của quý thầy cô để bài báo cáo được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, tháng 6 năm 2012 Sinh viên Nguyễn Thị Dung 3 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ SẢN PHẨM NEM CHUA 1.1.1 Nem chua [12] Nem chua là một món ăn sử dụng thịt lợn, lợi dụng hệ vi sinh vật lên men trên lá (lá ổi, lá sung v.v.) và thính gạo để ủ chín, có vị chua ngậy. Nem chua Việt Nem tuy không rõ được người dân vùng nào làm ra đầu tiên nhưng với hương vị riêng của từng vùng miền mà mỗi địa phương đều có đặc sản nem chua nổi tiếng. Nem chua miền bắc: Nem chua Vĩnh Yên (Vĩnh Phúc), nem làng Vẽ (Hà Nội), nem chua Yên Mạc (Ninh Bình), nem chua Ước Lễ (Hà Nội). Có lẽ chẳng ai ở Hà Nội lại xa lạ với thương hiệu nem chua làng Ước Lễ đã quá nổi tiếng từ 20 năm qua. Giò chả Ước Lễ ngon nổi tiếng bởi việc chọn lựa, pha thịt và kỹ thuật chế biến thành phẩm rất đỗi công phu. Không rõ nghề giò chả ở Ước Lễ có từ bao giờ, chỉ thấy thần tích ngọc có ghi: Lễ hội hàng năm vào mồng 10 tháng giêng, theo phong tục cổ truyền “cỗ ngọc” vừa dâng cúng thành hoàng vừa tiến vua, sau đó làng thụ lộc. Mỗi khi làng có tuyển “cỗ ngọc” thì mỗi giáp có bổn phận tạo tác một loại đặc sản và món giò chả được tập trung nhiều hơn cả. Nem chua miền trung: nem chua Đông Ba (Huế), nem chua Ninh Hòa (Khánh Hòa), … Đối với người dân miền trung, nem chua Thanh Hóa. có vị lạ rất khác với nem chua ở những nơi khác. Nó vừa chua, vừa cay lại có cả vị mặn mà của gia vị, có vị ngọt của thịt làm ta không thể không ăn tiếp vài cái nữa. Những quả nem chỉ to bằng cái chén uống trà của những khách đối ẩm họa thơ thời xưa, quấn quanh mình màu áo xanh của lá chuối, thắt những chiếc nơ lạt giang trắng xinh xắn hình chữ thập. Thời gian ủ Nem Thanh Hóa cũng tuỳ theo thời tiết, mùa hè thì độ 5 tiếng đã có nem ăn, mùa đông thì 1 đến 2 ngày. Người dân xứ Thanh vào Nam ra Bắc, dù bận trăm công nghìn việc, dù mang vác nặng nề cũng cố đem vài chục chiếc để cho người nhà hoặc biếu người thân. Ngày lễ Tết hoặc cưới xin, nem chua trở thành món ngon không thể thiếu. Kèm với những cặp bánh chưng xanh, những 4 chiếc giò ngày Tết là những xâu nem chua làm từ chất liệu quê hương mời khách đến chơi nhà. Nem chua miền nam: nem Thủ Đức (thành phố Hồ Chí Minh), nem chua Lai Vung (Đồng Tháp). Nhắc đến huyện Lai Vung (tỉnh Đồng Tháp), người ta thường nhắc đến món đặc sản đi kèm với tên gọi của địa phương nổi tiếng rất lâu đời đó là nem Lai Vung. Nghề làm nem nơi đâu cũng có và cũng với công thức ấy, từng ấy nguyên liệu nhưng cách làm nem chua của người dân nơi đây lại tạo ra hương vị đặc trưng, không nơi nào có được Cầm trên tay chiếc nem Lai Vung có màu đỏ hồng đậm đà với vị chua, ngọt, cay,… và được gói cẩn thận trong lá chuối xanh. Nem Lai Vung có thể dùng ăn với cơm, bún, ăn tráng miệng nhưng ngon nhất là ăn với bánh mì. Chỉ có ăn với bánh mì mới bộc lộ được hết mùi vị ngon của nem. Nem chua Ninh Hòa Nem gói lá chùm ruột là đặc sản và niềm tự hào của người dân tỉnh Khánh Hòa. Người Khánh Hòa có câu: “đến Khánh Hòa mà chưa ăn Nem gói lá chùm ruột thì coi như chưa đến đây”. Nguyên liệu: Bì và thịt heo (thịt lấy phần nạc đùi hoặc trên lưng) Quy trình chế biến: Thịt heo lạng sạch mỡ và gân, thái ngang và giã nhuyễn. Một điều đặc biệt khi làm nem Ninh Hòa là không dùng máy móc, phải giã liên tục, không được ngừng tay, vừa giã vừa nêm gia vị: muối, đường, tiêu để nem có độ dai, không quá ngọt cũng không quá mặn. Bì heo luộc chín tới, để ráo nước, lọc sạch mỡ, cắt thành những lớp mỏng, cuộn lại, cắt sợi nhỏ như miến. Trộn đều thịt đã giã nhuyễn và da heo đã cắt nhỏ, dùng lá chùm ruột để gói lại (lá chùm ruột không được rửa, phải dùng khăn khô lau sạch). Sau đó, lót lá chuối bên ngoài rồi gói chặt tay, không để bị hở. Ba ngày sau, nem đủ độ chua thì có thể ăn được. [...]... 2.2.4.1 Tình hình nhi m Listeria monocytogenes trên nguyên li u ch bi n nem chua Nguyên li u ch bi n Th t heo xay Lá gói nem Phát hi n và H n h p gói nem nh lư ng Listeria monocytogenes Hình 2.2: Sơ b trí thí nghi m phát hi n và nh lư ng Listeria monocytogenes trên nguyên li u 2.2.4.2 Tình hình nhi m Listeria monocytogenes trong s n ph m nem chua a Tình hình nhi m Listeria monocytogenes s n ph m nem chua. .. Lá gói nem nh lư ng Listeria monocytogenes ngay 24 M u 3: H n h p nem trư c khi gói M u 4: Nem chua lên men trong i u ki n thư ng ư c 1 ngày M u 5: Nem chua lên men trong i u ki n thư ng ư c 2 ngày M u 6: Nem chua lên men trong i u ki n thư ng ư c 3 ngày M u 7: Nem chua ã lên men b o qu n trong i u ki n thư ng 0 ngày M u 8: Nem chua ã lên men b o qu n trong i u ki n thư ng 1 ngày M u 9: Nem chua ã... NGHIÊN C U I TƯ NG NGHIÊN C U Khu v c l y m u t i thành ph Nha Trang, t nh Khánh Hòa Hình 2.1: B n khu v c l y m u Nguyên li u ch bi n nem chua + Th t heo xay + Nguyên li u ph và lá gói nem + H n h p nem trư c khi gói Nem chua trong quá trình lên men Nem chua trong quá trình b o qu n + Nem chua sau khi lên men b o qu n i u ki n thư ng + Nem chua sau khi lên men b o qu n i u ki n l nh M u ư c thu nh... u 10: Nem chua ã lên men b o qu n trong i u ki n thư ng 3 ngày M u 11: Nem chua ã lên men b o qu n trong i u ki n thư ng 4 ngày M u 12: Nem chua ã lên men b o qu n trong i u ki n thư ng 5 ngày M u 13: Nem chua ã lên men b o qu n trong i u ki n l nh 0 ngày M u 14: Nem chua ã lên men b o qu n trong i u ki n l nh 1 ngày M u 15: Nem chua ã lên men b o qu n trong i u ki n l nh 2 ngày M u 16: Nem chua ã... trong th i gian lên men 3 ngày trong i u ki n thư ng Nem s ng Lên men (ngày) 1 2 Phát hi n và 3 nh lư ng Listeria monocytogenes Hình 2.3: Sơ b trí thí nghi m phát hi n và nh lư ng Listeria monocytogenes trong th i gian lên men 27 b Tình hình nhi m Listeria monocytogenes s n ph m nem chua trong i u ki n b o qu n thư ng và b o qu n l nh S n ph m nem chua lên men 3 ngày B o qu n trong i u ki n thư ng (ngày)... c trưng cho nem chua lên men 1.3 T NG QUAN V VI KHU N LISTERIA MONOCYTOGENES 1.3.1 Gi i thi u chung v gi ng vi khu n Listeria spp và loài Listeria monocytogenes [5], [9] Listeria spp là gi ng vi khu n gram dương, k khí tùy ý, có hình g y ng n, m nh, không hình thành bào t Chúng g m 6 loài L monocytogenes, L innocua, L seeligeri, L welshimeri, L ivanovii và L Grayi Tuy nhiên, trong loàiL .monocytogenes. .. hi u thai b t n thương, nhau thai b nhi m Listeria monocytogenes [13] 14 1.3.2 Hình thái và c u t o vi khu n Listeria monocytogenes [5] Listeria monocytogenes là m t lo i tr c khu n gram dương, ng n, nh , không sinh bào t , nh có tiên mao m c tròn quanh tr c thân thành t ng tr t c c nên chúng có ki u chuy n ng xoay c trưng trong tiêu b n gi t ép Hình 1.2: Vi khu n Listeria monocytogenes (Ngu n: http://www.embraceaustralia.com/wp-content/uploads/2009/08 /listeria) ... tâm phòng thí nghi m th c hành trư ng i H c Nha Trang 2.2.3 Ki m tra Listeria monocytogenes theo phương pháp MPN (Most Probable Number) Listeria monocytogenes t n t i trong th c ph m không nhi u nên nh lư ng chính xác Listeria monocytogenes trong th c ph m c th là trong nem chua thì phương pháp MPN ư c áp d ng cho k t qu t i ưu nh t so v i các phương pháp trên Phương pháp MPN (phương pháp pha loãng...5 Hình 1.1: Nem chua Nem chua c a nư c ngoài M t s nư c ông Nam Á cũng có món tương t nem chua Vi t Nam (khá gi ng v màu s c và mùi v ) Lào g i món ó là Som mou Thái Lan g i món ó là Nham Ngư i Thái hay dùng Nham làm món salad cay ho c làm nham nư ng M t s ch tiêu v vi sinh v t ph m ăn ngay) i v i s n ph m th t lên men (nhóm... M TRA LISTERIA MONOCYTOGENES 1.4.1 Phương pháp xác nh Listeria monocytogenes Phương pháp chu n dùng phát hi n và phân l p Listeria monocytogenes như sau L y m u th các lô th c ph m nghi ng b nhi m Nói chung, có th h n h p các ph n m u theo hư ng d n phòng thí nghi m c a FDA Làm giàu trư c i v i Listeria monocytogenes các ph n m u phân tích (25 g) b ng cách nuôi c y trong canh thang tăng sinh Listeria . 3.1 TÌNH HÌNH NHIỄM LISTERIA MONOCYTOGENES TRÊN NGUYÊN LIỆU LÀM NEM CHUA 33 3.2 TÌNH HÌNH NHIỄM LISTERIA MONOCYTOGENES TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN NEM CHUA TRONG ĐIỀU KIỆN THƯỜNG 34 3.3 TÌNH HÌNH. hiểu về Listeria monocytogenes trên thực phẩm chế biến sẵn. Xác định số lượng Listeria monocytogenes trên nguyên liệu chế biến nem. Xác định số lượng Listeria monocytogenes trên nem chua trong. lên men 34 Bảng 3.3: Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes của nem chua trong điều kiện bảo quản thường 36 Bảng 3.4: Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes của nem chua trong điều kiện bảo