2.2.2.1 Môi trường
Môi trường nuôi cấy, canh thang, nước pha loãng và môi trường sinh vật hoá học được điều chế theo công thức. Các môi trường được đóng sẵn vào bình cầu, bình nón, ống nghiệm và được hấp tiệt trùng 1210C/15 phút). Các dụng cụ như pipet, ống đong, đĩa peptri được sấy 1800C/30 phút.
2.2.2.2 Hóa chất
Nước Pepton 0,1 %.
Muối Nacl, Na2HPO4 và KH2PO4. Thạch Oxford Agar.
Môi trường tăng sinh BLEB. Thạch máu cừu.
Môi trường test đường gồm: Môi trường cơ bản, agar 1% và canh thang đường Rhamnose, Xylose, Mantose 0,5%.
Bộ thuốc nhuộm Gram. Hydrogen Peroxide 3%
Môi trường giữ chủng: Môi trường lỏng BLEB, 0,6% cao nấm men, 1,5% agar.
2.2.2.3 Máy và dụng cụ thí nghiệm
Ống đong (100ml, 250ml,500ml, 1000ml), bình tam giác, pipet, đĩa peptri, que cấy, đèn cồn, ống nghiệm các loại.
Nồi hấp thanh trùng trong phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học.
Tủ sấy cùng các dụng cụ khác trong phòng thí nghiệm Vi sinh thuộc trung tâm phòng thí nghiệm thực hành trường Đại Học Nha Trang.
2.2.3 Kiểm tra Listeria monocytogenes theo phương pháp MPN (Most Probable Number) Number)
Listeria monocytogenes tồn tại trong thực phẩm không nhiều nên để định lượng
chính xác Listeria monocytogenes trong thực phẩm cụ thể là trong nem chua thì
phương pháp MPN được áp dụng cho kết quả tối ưu nhất so với các phương pháp trên. Phương pháp MPN (phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ) là phương pháp dùng để ước lượng số lượng vi sinh vật hiện diện trong một đơn vị thể tích dựa vào bảng Mac Crandy. Phương pháp MPN dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố VSV trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu.
Mỗi độ pha loãng được nuôi cấy lặp lại 3 lần
Các độ pha loãng được chọn lựa sao cho trong các lần lặp lại có một số lần dương tính và có một số lần âm tính.
Số lần dương tính được ghi nhận và so sánh với bảng thống kê giá trị ước đoán số lượng VSV trong mẫu.
Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp MPN.
Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm tra trong ống nghiệm để xác định ống dương tính. Tra bảng Mac Crandy để có kết quả.
2.2.4 Bố trí thí nghiệm
2.2.4.1 Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes trên nguyên liệu chế biến nem chua
Hình 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm phát hiện và định lượng Listeria monocytogenes trên nguyên liệu
2.2.4.2 Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes trong sản phẩm nem chua a. Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes ở sản phẩm nem chua trong thời a. Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes ở sản phẩm nem chua trong thời gian lên men 3 ngày trong điều kiện thường
Hình 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm phát hiện và định lượng Listeria monocytogenes trong thời gian lên men
Nguyên liệu chế biến
Thịt heo xay Lá gói nem
Phát hiện và định lượng
Listeria monocytogenes
Hỗn hợp gói nem
Nem sống
Lên men (ngày)
1 2 3
Phát hiện và định lượng
b. Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes ở sản phẩm nem chua trong điều kiện bảo quản thường và bảo quản lạnh
Hình 2.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm phát hiện và định lượng Listeria monocytogenes trong quá trình bảo quản
2.2.5 Quy trình thực hiện
Mẫu sau khi đồng nhất được thực hiện như sau:
(1) 1/2 phần mẫu ban đầu đem đi kiểm tra Listeria monocytogenes được mô tả trong phần 2.2.5.1, 2.2.5.2, 2.2.5.3
(2) Phần mẫu còn lại giữ lại ủ ở 48h/300C và cấy trên môi trường OXA, kiểm tra đĩa dương tính với Esculin và sau đó được kiểm tra giống như phần 2.2.5.2 và 2.2.5.3 5 4 5 4 Phát hiện và định lượng Listeria monocytogenes
Sản phẩm nem chua lên men 3 ngày
Bảo quản trong điều kiện lạnh (ngày) Bảo quản trong điều
kiện thường (ngày)
2.2.5.1 Xử lý mẫu và tăng sinh
Hình 2.5: Sơ đồ xử lý mẫu và tăng sinh
Thuyết minh: Sau khi đã cân phân tích 25g/mẫu, thêm 225ml nước muối sinh
lý và đồng nhất mẫu trong bao vô trùng, tiến hành tăng sinh như sau: Chuẩn bị 9 ống (5ml/ống) canh thang chứa môi trường BLEB và 2 ống (9ml/ống) nước muối sinh lý đã được vô trùng (cho 1 mẫu).
• Pha loãng mẫu ở 3 nồng độ 10-1, 10-2, 10-3 bằng cách: cân 25g mẫu đồng
nhất trong 225ml nước muối sinh lý ta được nồng độ 10-1, pha loãng bậc 10 liên tiếp bằng cách hút 1ml từ bao chứa mẫu ban đầu cho vào ống nước muối sinh lý được 10-2 và từ ống 10-2 hút 1ml cho vào ống nước muối sinh lý được nồng độ 10-3.
• Tăng sinh: Mỗi mẫu chuẩn bị 9 ống chứa môi trường BLEB. Ở 3 nồng độ
pha loãng bậc 10 liên tiếp: 10-1, 10-2, 10-3 tiến hành tăng sinh bằng cách ở mỗi nồng độ hút lần lượt 1ml cho vào 3 ống nghiệm chứa canh thang BLEB.
Đem ống nghiệm ủ ở 300C/48h
Cấy một thể tích chính xác vào 9 ống ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp 10-1, 10-2, 10-3
Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa môi trường BLEB Pha loãng mẫu
Hình 2.6: Ống chứa môi trường BLEB dùng cho một mẫu thí nghiệm
• Đem đi ủ ở 340C/48h
2.2.5.2 Định danh Listeria monocytogenes từ các ống nghiệm cấy tăng sinh
Hình 2.7: Sơ đồ định danh Listeria monocytogenes
Thuyết minh: Phát hiện Listeria monocytogenes có trong các ống nghiệm thuộc dãy MPN. Quá trình định danh như sau:
Ủ 34°C/ 48 giờ
Khuẩn lạc có Esculin (+) Ống nghiệm thuộc dãy MPN
Đĩa thạch OXA
a. Esculin
Tại thời điểm 48h, cấy ria trên môi trường thạch phân lập OXA chứa esculin. Nuôi cấy trên các đĩa thạch OXA ở 30 ÷ 380C trong 48h. Theo dõi tại thời điểm 48h ngay sau khi phân lập, các khuẩn lạc Listeria có màu nâu đen với quầng đen trên
môi trường chứa esculin. Một số khuẩn lạc màu đen hơi nâu nhưng xuất hiện chậm hơn 2 ngày nhưng không được coi là Listeria.
Hình 2.8: Esculin dương tính (bên trái) - Esculin âm tính (bên phải) b. Khả năng lên men đường
Sử dụng que cấy kim lấy giống vi sinh vật từ các đĩa dương tính với Esculin, dùng que cấy đâm sâu vào khối thạch hình trụ. Ủ các ống canh trùng thử khả năng lên men đường Rhamnose, Mantol, Xylose 0,5% ở 300C 24 ÷ 48h. Kết quả dương tính (môi trường chuyển sang màu vàng đối với đường Rhamnose và chuyển sang màu xanh đối với đường Xylose) và theo dõi thường xuyên
Hình 2.9: Các ống nghiệm kiểm tra khả năng lên men đường Rhamnose và Xylose. Dương tính (màu vàng) âm tính (màu xanh)
c. Thử catalase
Mục đích: kiểm tra khả năng phân huỷ H2O2 của vi sinh vật nhờ sản sinh ra enzyme catalaza.
• Chuẩn bị dung dịch H2O2 nồng độ 3-10%, nhỏ trực tiếp dung dịch H2O2 lên khuẩn lạc trên đĩa thạch.
• Nếu thấy sủi bọt là dương tính, không sủi bọt là âm tính.
Listeria monocytogenes dương tính với catalaza.
d. Nhuộm gram
Listeria monocytogenes gram (+) bắt màu tím.
Hình 2.10: Vi khuẩn Listeria monocytogenes bắt màu tím khi nhuộm gram e. Thử khả năng di động theo phương pháp giọt treo
Kiểm tra bằng tiêu bản soi tươi, dùng nước muối sinh lý 0,85% tạo huyền dịch. Chon một khuẩn lạc đủ lớn để làm giọt treo tương đối cao, đánh cho tan đều. Nếu lấy quá ít vi khuẩn, một vài tế bào hiện diện sẽ dán dính trên phiến kính và cho thấy không di động.
Theo dõi trên kính hiển vi, Listeria monocytogenes có hình que ngắn, mảnh, di động quay tròn chậm hoặc theo kiểu nhào lộn do nó có tiêu mao. Đối với, các trực khuẩn lớn hoặc trực khuẩn di chuyển nhanh, kiểu bơi không phải là L. monocytogenes.
2.2.6 Thử khả năng tan huyết
Nếu các đặc tính hình thái, sinh lý học và phản ứng catalaza cho thấy có khả năng có Listeria ssp, thì cấy lên đĩa thạch máu để xác định phản ứng haemolytic. Vạch các ô hình lưới trên đáy đĩa Petri từ 20 đến 25 ô trên một đĩa. Chọn khuẩn lạc điển hình trên môi trường thạch OXA, dùng kim cấy chấm vào mỗi ô một khuẩn lạc. Ủ 370C trong 24 ÷ 28h.Trên môi trường thạch máu, khuẩn lạc Listeria monocytogenes được bao quanh bởi vòng sáng hẹp do hiện tượng dung huyết dạng .
Hình 2.11: Hình ảnh Listeria monocytogenes trên thạch máu cừu
Nhận xét: Vòng tan máu bê-ta quanh khuẩn lạc do tan tế bào máu, tạo vùng
trong suốt.
2.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Số liệu được xử lý nhờ phần mềm MS Excel. So sánh sự khác biệt dựa vào phân tích phương sai (ANOVA), sự khác biệt có ý nghĩa với p≤0,05. Số liệu trình bày trong các bảng số liệu là giá trị trung bình ± mức tin cậy 95%.
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 TÌNH HÌNH NHIỄM LISTERIA MONOCYTOGENES TRÊN NGUYÊN
LIỆU LÀM NEM CHUA
Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes trên các nguyên liệu chế biến nem và sự lây nhiễm trong quá trình chế biến vào hỗn hợp làm nem được trình bày trong Bảng 3.1 (phần kết quả và thảo luận) và bảng phụ lục 2 (phần phụ lục)
Bảng 3.1: Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes trong nguyên liệu
Nguyên liệu Số mẫu
kiểm tra Số mẫu nhiễm Tỷ lệ nhiễm (%) Trung bình (MPN/g)
Thịt nạc (heo) xay nhuyễn 3 3 100 6.93 ± 1.60
Lá gói nem 3 3 100 26.00 ± 10.83
Hỗn hợp làm nem 3 3 100 14.33 ± 1.43
Nhận xét:
Listeria hiện diện ở thịt nấu không chín, bơ sữa, các loại rau xanh rửa không
sạch và hải sản. Ở Mỹ và các nước phát triển, nhiễm Listeria thường gặp khi ăn các loại thức ăn nhanh chế biến sẵn như bánh mì kẹp thịt, phô mai, bơ, thịt cá xông khói và các loại khác. Không chỉ thế chúng có thể được tìm thấy trong nhiều môi trường, bao gồm đất, nước thải, nước, chất thải…Do đó vi khuẩn Listeria monocytogenes
có ở khắp mọi nơi và nguy cơ nhiễm vào thực phẩm là rất cao [5].
Đối với thịt heo xay làm nem, người thợ làm nem lấy thịt ngay khi vừa mới giết mổ nên mức độ nhiễm Listeria monocytogenes rất ít. Nhưng vi khuẩn Listeria monocytogenes vẫn có khả năng nhiễm vào thịt trong quá trình giết mổ hay trong quá
trình xay (giã) nếu không đảm bảo vệ sinh. Qua 3 lần lấy mẫu kiểm tra trung bình số lượng Listeria monocytogenes là 6.93 MPN/g trong mẫu thịt heo xay dùng để gói nem với tỷ lệ nhiễm là 100%.
Nem chua Ninh Hòa sử dụng lá chùm ruột để gói nem nhằm làm tăng mùi vị cho sản phẩm đồng thời lợi dụng hệ vi sinh vật lên men trên lá để làm tăng quá trình lên men.
Trong quá trình này, người làm nem dùng khăn ướt lau lá sau đó để khô mà không rửa qua nước do đó qua 3 lần lấy mẫu kiểm tra đều phát hiện thấy trung bình số lượng
Listeria monocytogenes trong lá là 26 MPN/g với tỷ lệ nhiễm 100%.
Da heo được chuẩn bị kỹ lưỡng (da heo được gia nhiệt luộc chín) nhưng trong quá trình cạo lông và cắt sợi đã làm gia tăng mật độ vi khuẩn Listeria monocytogens
Hỗn hợp làm nem bao gồm: thịt heo xay nhuyễn, bì heo và nguyên liệu phụ như mắm, muối, tiêu, bột ngọt,… Trong quá trình kết hợp các thành phần cũng làm tăng khả năng lây nhiễm vì vậy làm cho hỗn hợp làm nem có lượng Listeria monocytogenes cao hơn đặc biệt đối với cơ sở thủ công làm bằng tay. Sau 3 mẫu kiểm tra, tỷ lệ nhiễm 100% với mật độ trung bình là 14.33 MPN/g
Đặc biệt hỗn hợp làm nem trong quá trình chờ gói được bảo quản ở nhiêt độ lạnh < 5oC. Ở nhiệt độ lạnh này tuy khống chế được các vi khuẩn thông thường nhưng vi khuẩn
Listeria monocytogenes vẫn có khả năng phát triển chậm làm gia tăng số lượng
Như vậy, trên nguyên liệu làm nem tỷ lệ nhiễm Listeria monocytogenes 100% (9/9 mẫu nhiễm).
3.2 TÌNH HÌNH NHIỄM LISTERIA MONOCYTOGENES TRONG QUÁ
TRÌNH LÊN MEN NEM CHUA TRONG ĐIỀU KIỆN THƯỜNG
Trong quá trình lên men, số lượng vi khuẩn Listeria monocytogenes trong
sản phẩm nem chua đã giảm qua từng ngày lên men được thể hiện qua Bảng 3.2 (phần kết quả và thảo luận) và phụ lục 3 (phần phụ lục)
Bảng 3.2: Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes của nem trong quá trình lên men Lên men (ngày) Số mẫu kiểm tra Số mẫu nhiễm Tỷ lệ nhiễm (%) Trung bình (MPN/g) 0 3 3 100 15.67 ± 1.43 1 3 3 100 15.00 ± 2.48 2 3 3 100 12.33 ± 5.74 3 3 3 100 6.93 ± 1.6
Nhận xét:
Sau khi gói lá, nem được gói thủ công làm tăng khả năng lây nhiễm và Listeria
monocytogenes từ lá lây nhiễm vào hỗn hợp nem gói làm tăng số lượng vi khuẩn. Qua 3
mẫu kiểm tra nhận thấy trung bình số lượng vi khuẩn Listeria monocytogenes trong hỗn hợp nem gói 14.33 MPN/g đã tăng lên thành 15.67 MPN/g trong 0 ngày lên men (nghĩa là sau khi gói lá số lượng Listeria monocytogenes lây nhiễm tăng)
Giai đoạn đầu của quá trình lên men lactic diễn ra trong thời gian nem chua lên men 0 ngày đến khi nem chua lên men 1 ngày. Ở giai đoạn này, quá trình lên men lactic diễn ra chậm, lượng acid lactic và một số thành phần có khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh thực phẩm được tạo thành rất ít. Do đó trong giai đoạn đầu của quá trình lên men lactic, số lượng vi khuẩn Listeria monocytogenes không có sự thay đổi rõ rệt. Qua 3 mẫu kiểm tra nhận thấy số lượng trung bình Listeria monocytogenes từ 15.67 MPN/g trong nem chua 0 ngày lên men chỉ giảm xuống còn 15 MPN/g trong nem chua ở ngày lên men đầu tiên.
Trong quá trình lên men xảy ra đồng thời hai quá trình: Quá trình thủy phân protein: tạo các polypeptid, peptid và các acid amin làm tăng chất lượng cảm quan của sản phẩm. Quá trình lên men lactic chuyển hóa lượng đường có trong nguyên liệu làm nem thành acid lactic và các sản phẩm phụ tạo sản phẩm nem chua có mùi vị đặc trưng [10]. Quá trình lên men làm pH của môi trường giảm, đồng thời sinh ra một số thành phần như: H2O2, bacteriocin,… có khả năng ức chế hoạt động và tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh thực phẩm như Listeria monocytogenes và vi khuẩn gây hư hỏng khác. Số lượng vi sinh vật giảm dần theo thời gian lên men phù hợp với các dẫn liệu trong tài liệu tham khảo [14]
Qua thời gian lên men 3 ngày, kiểm tra mẫu nem chua nhận thấy số lượng vi khuẩn Listeria monocytogenes đã giảm nhiều, từ ngày lên men đầu tiên có số lượng
Listeria monocytogenes trung bình là 20.7 MPN/g đến ngày lên men thứ 3 thì số
lượng giảm xuống còn 6.9 MPN/g. Chứng tỏ quá trình lên men lactic không chỉ ức chế sự phát triển của vi sinh vật mà còn làm giảm số lượng của chúng theo thời gian lên men. Tuy nhiên tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Listeria monocytogenes vẫn là 100% trên các mẫu kiểm tra.
Theo “Giới hạn cho phép chỉ tiêu vi sinh vật đối với sản phẩm ăn liền (Salami và xúc xích lên men) của Ireland” [14] thì số lượng vi khuẩn Listeria monocytogenes < 20 MPN/g là đạt tiêu chuẩn. Vì vậy, sau 3 ngày lên men nem chua
số lượng vi khuẩn Listeria monocytogenes chỉ còn 6.9 MPN/g là đạt tiêu chuẩn,
người tiêu dùng có thể sử dụng.
Tuy nhiên đối với những người mang thai, người già, trẻ em và những người có sức đề kháng yếu thì không nên sử dụng nem chua vừa lên men được 3 ngày vì vẫn còn sự tồn tại Listeria monocytogenes trong sản phẩm.
3.3 TÌNH HÌNH NHIỄM LISTERIA MONOCYTOGENES TRONG QUÁ
TRÌNH BẢO QUẢN NEM CHUA Ở ĐIỀU KIỆN THƯỜNG
Trong quá trình bảo quản nem chua ở điều kiện thường, quá trình lên men tiếp tục diễn ra làm cho số lượng vi khuẩn Listeria monocytogenes giảm dần. Mức độ nhiễm Listeria monocytogenes được thể hiện trong Bảng 3.3 (phần kết quả và
thảo luận) và phụ lục 4 (phần phụ lục)
Bảng 3.3: Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes của nem chua trong điều kiện bảo quản thường
Bảo quản ở điều kiện thường (ngày) Số mẫu kiểm tra Số mẫu nhiễm Tỷ lệ nhiễm (%) Trung bình (MPN/g) 0 3 3 100 6.93 ± 1.60 1 3 3 100 3.40 ± 0.86 2 3 2 66.7 < 3 3 3 0 0 - 4 3 0 0 - 5 3 0 0 -
Ghi chú: (-): không phát hiện trong 25 g mẫu; <3: phát hiện có trong 1 g mẫu nhưng số lượng thấp không xác định được
Nhận xét:
Nem chua bảo quản trong điều kiện thường ở nhiệt độ môi trường 30±20C là điều kiện thuận lợi để nem chua tiếp tục quá trình lên men.
Bảo quản nem chua trong điều kiện thường ở 0 ngày bảo quản có số lượng vi khuẩn Listeria monocytogenes trung bình là 6.93 MPN/g nhưng đến ngày bảo quản thứ