Hình 2.7: Sơ đồ định danh Listeria monocytogenes
Thuyết minh: Phát hiện Listeria monocytogenes có trong các ống nghiệm thuộc dãy MPN. Quá trình định danh như sau:
Ủ 34°C/ 48 giờ
Khuẩn lạc có Esculin (+) Ống nghiệm thuộc dãy MPN
Đĩa thạch OXA
a. Esculin
Tại thời điểm 48h, cấy ria trên môi trường thạch phân lập OXA chứa esculin. Nuôi cấy trên các đĩa thạch OXA ở 30 ÷ 380C trong 48h. Theo dõi tại thời điểm 48h ngay sau khi phân lập, các khuẩn lạc Listeria có màu nâu đen với quầng đen trên
môi trường chứa esculin. Một số khuẩn lạc màu đen hơi nâu nhưng xuất hiện chậm hơn 2 ngày nhưng không được coi là Listeria.
Hình 2.8: Esculin dương tính (bên trái) - Esculin âm tính (bên phải) b. Khả năng lên men đường
Sử dụng que cấy kim lấy giống vi sinh vật từ các đĩa dương tính với Esculin, dùng que cấy đâm sâu vào khối thạch hình trụ. Ủ các ống canh trùng thử khả năng lên men đường Rhamnose, Mantol, Xylose 0,5% ở 300C 24 ÷ 48h. Kết quả dương tính (môi trường chuyển sang màu vàng đối với đường Rhamnose và chuyển sang màu xanh đối với đường Xylose) và theo dõi thường xuyên
Hình 2.9: Các ống nghiệm kiểm tra khả năng lên men đường Rhamnose và Xylose. Dương tính (màu vàng) âm tính (màu xanh)
c. Thử catalase
Mục đích: kiểm tra khả năng phân huỷ H2O2 của vi sinh vật nhờ sản sinh ra enzyme catalaza.
• Chuẩn bị dung dịch H2O2 nồng độ 3-10%, nhỏ trực tiếp dung dịch H2O2 lên khuẩn lạc trên đĩa thạch.
• Nếu thấy sủi bọt là dương tính, không sủi bọt là âm tính.
Listeria monocytogenes dương tính với catalaza.
d. Nhuộm gram
Listeria monocytogenes gram (+) bắt màu tím.
Hình 2.10: Vi khuẩn Listeria monocytogenes bắt màu tím khi nhuộm gram e. Thử khả năng di động theo phương pháp giọt treo
Kiểm tra bằng tiêu bản soi tươi, dùng nước muối sinh lý 0,85% tạo huyền dịch. Chon một khuẩn lạc đủ lớn để làm giọt treo tương đối cao, đánh cho tan đều. Nếu lấy quá ít vi khuẩn, một vài tế bào hiện diện sẽ dán dính trên phiến kính và cho thấy không di động.
Theo dõi trên kính hiển vi, Listeria monocytogenes có hình que ngắn, mảnh, di động quay tròn chậm hoặc theo kiểu nhào lộn do nó có tiêu mao. Đối với, các trực khuẩn lớn hoặc trực khuẩn di chuyển nhanh, kiểu bơi không phải là L. monocytogenes.