TRÊN TOÀN THẾ GIỚI VÀ TRONG NƯỚC
Để đáp ứng được nhu cầu của người tiêu dùng thì hàng loạt các sản phẩm đa dạng về kiểu dáng, màu sắc ra đời. Các sản phẩm không đạt chất lượng tràn lan trên thị trường dẫn đến nhiều vụ ngộ độc trong thời gian vừa qua. Theo Cục An toàn vệ
sinh thực phẩm thì trong thời gian qua trên địa bàn cả nước vẫn xảy ra một số vụ ngộ độc thực phẩm ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng. Theo số liệu thống kê chưa đầy đủ của Cục ATVSTP từ đầu tháng 4/2012 đến nay, cả nước đã xảy ra 10 vụ ngộ độc thực phẩm làm 972 người mắc, trong đó có 726 người phải nhập viện và đã có 04 trường hợp tử vong. Phần lớn các vụ ngộ độc xảy ra với quy mô nhiều người mắc, nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc là do thực phẩm nhiễm vi sinh vật. Điển hình như vụ ngộ độc tập thể xảy ra trong một đám cưới ngày 12/4/2012 tại bản Hùn, xã Chiềng Cọ, Thành phố Sơn La do thực phẩm nhiễm vi khuẩn Staphylococcus aureus làm hơn 300 người mắc và phải nhập viện cấp cứu. Một vụ ngộ độc tập thể
khác xảy ra ngày 16/4/2012 khiến hơn 200 công nhân của Công ty Dream MeKong thuộc xã An Cư, huyện Cái Bè, tỉnh Tiền Giang bị ngộ độc,…
Con người và động vật có thể nhiễm Listeria nhưng không có triệu chứng
bệnh. Ước tính có từ 5 ÷ 10% dân số thế giới trong hoàn cảnh này.
Con đường nhiễm Listeria phổ biến ở người là ăn phải các thức ăn bị nhiễm.
Listeria hiện diện ở thịt nấu không chín, bơ sữa, các loại rau xanh rửa không sạch
và hải sản. Ở Mỹ và các nước phát triển, nhiễm Listeria thường gặp khi ăn các loại thức ăn nhanh chế biến sẵn như bánh mì kẹp thịt, phô mai, bơ, thịt cá xông khói và các loại khác.
Các nước trên từng cảnh báo về loại vi khuẩn này, đồng thời cũng đề ra các biện pháp kiểm tra nghiêm ngặt nguồn nguyên liệu thực phẩm. Nguy cơ của lọai vi khuẩn này không chỉ gây ra ngộ độc thực phẩm mà quan trọng hơn là chúng gây ra các bệnh lý nguy hiểm như xảy thai, viêm não, nhiễm trùng huyết. Vào tháng 12 năm 1999, tại Pháp có vụ ngộ độc do ăn phải loại hamburger gây cho 27 nguời mắc, trong đó có 7 người chết. Theo thống kê của Mỹ, hàng năm số bệnh nhân bị nhiễm bệnh do Listeria khoảng 2.500 người, với gần 500 người chết. Thống kê tại Anh từ 2001 ÷ 2005 có 1.933 người mắc. Tháng 3 năm 2007, Cơ quan quản lý thực phẩm Anh quốc có lệnh thu hồi toàn bộ các loại bánh mì kẹp thịt (sandwish), do công ty thực phẩm Anchor cung cấp cho hệ thống bệnh viện và trường học tại Luân đôn, do sản phẩm này bị nhiễm vi khuẩn Listeria monocytogenes. Trong một đợt dịch gần
đây, các chuyên gia dịch tễ học Hoa Kỳ đã thống kê cho thấy tỉ lệ tử vong do nhiễm
Listeria monocytogenes 11% ở những người dưới 40 tuổi và 63% ở những người
trên 60 tuổi.
Ở Việt Nam năm 2006, theo tổng kết của Phòng Kiểm Nghiệm Hóa Lý- Vi Sinh thực phẩm viện Pasteur TP. HCM, các mẫu hải sản đông lạnh có tỷ lệ nhiễm L.
monocytogenes là 23/138 mẫu, chiếm 23,9%. Những năm tiếp theo tỷ lệ xuất hiện
của chủng vi khuẩn này cũng có khuynh hướng gia tăng và thường được tìm thấy trong các mẫu thực phẩm đông lạnh.
2008, Cục Quản lý Chất lượng Nông Lâm sản và Thủy sản (NAFIQAD) thực hiện đề tài khoa học cấp cơ sở "Xác định nguyên nhân lây nhiễm và đề xuất giải pháp kiểm soát mối nguy Listeria monocytogenes trong sản xuất sản phẩm cá tra
đông lạnh". Theo số liệu các kết quả phân tích được nghiệm thu tháng 11/2009 của đề tài: 162/485 mẫu bị phát hiện nhiễm Listeria monocytogenes, (bao gồm 29/120
mẫu nguyên liệu được lấy tại cửa nhà máy chế biến, 79/186 mẫu vệ sinh công nghiệp trong quá trình sản xuất và 22/95 mẫu vệ sinh công nghiệp sau khi vệ sinh, 8/28 mẫu tay công nhân, 24/36 mẫu bán thành phẩm).
Đề tài cho biết nguyên nhân lây nhiễm Listeria monocytogenes trong sản
phẩm cá tra chủ yếu là do nguyên liệu trong quá trình nuôi, vận chuyển về nhà máy, nhiễm chéo tại các khâu chế biến hoặc do quá trình làm vệ sinh khử trùng tại nhà máy chưa hiệu quả (vệ sinh tay công nhân trước khi vào nhà máy, vệ sinh máy móc, thiết bị, các bề mặt tiếp xúc… chưa đạt yêu cầu).
Với điều kiện phát triển nhanh các loại thức ăn công nghiệp cũng như việc kinh doanh tràn lan của nhiều loại thực phẩm không rõ nguồn gốc tại Việt Nam như hiện nay, thì thực phẩm bị nhiễm vi khuẩn này không phải là ngoại lệ. Mặt khác, công tác điều tra dịch tễ và sàng lọc tác nhân gây bệnh chưa được đúng mức, chưa có những giám sát chặt chẽ hơn đối với loại vi khuẩn nguy hiểm này. Vệ sinh đúng cách là một trong những biện pháp phòng chống các bệnh lây nhiễm qua thực phẩm một cách hữu hiệu.
CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Khu vực lấy mẫu tại thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa
Hình 2.1: Bản đồ khu vực lấy mẫu
Nguyên liệu chế biến nem chua + Thịt heo xay
+ Nguyên liệu phụ và lá gói nem + Hỗn hợp nem trước khi gói
Nem chua trong quá trình lên men
Nem chua trong quá trình bảo quản
+ Nem chua sau khi lên men bảo quản ở điều kiện thường + Nem chua sau khi lên men bảo quản ở điều kiện lạnh
Mẫu được thu nhận tại cơ sở chế biến sau đó vận chuyển về phòng thí nghiệm trong điều kiện bảo quản mẫu ở nhiệt độ nhỏ hơn 4oC, tránh lây nhiễm vi sinh vật trong vòng 1 giờ. Mẫu được phát hiện và định lượng Listeria monocytogenes ngay sau khi lấy mẫu.
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Mẫu nghiên cứu 2.2.1 Mẫu nghiên cứu
Mẫu 1: Thịt nạc heo xay nhuyễn Mẫu 2: Lá gói nem
Mẫu 3: Hỗn hợp nem trước khi gói
Mẫu 4: Nem chua lên men trong điều kiện thường được 1 ngày Mẫu 5: Nem chua lên men trong điều kiện thường được 2 ngày Mẫu 6: Nem chua lên men trong điều kiện thường được 3 ngày
Mẫu 7: Nem chua đã lên men bảo quản trong điều kiện thường 0 ngày Mẫu 8: Nem chua đã lên men bảo quản trong điều kiện thường 1 ngày Mẫu 9: Nem chua đã lên men bảo quản trong điều kiện thường 2 ngày Mẫu 10: Nem chua đã lên men bảo quản trong điều kiện thường 3 ngày Mẫu 11: Nem chua đã lên men bảo quản trong điều kiện thường 4 ngày Mẫu 12: Nem chua đã lên men bảo quản trong điều kiện thường 5 ngày Mẫu 13: Nem chua đã lên men bảo quản trong điều kiện lạnh 0 ngày Mẫu 14: Nem chua đã lên men bảo quản trong điều kiện lạnh 1 ngày Mẫu 15: Nem chua đã lên men bảo quản trong điều kiện lạnh 2 ngày Mẫu 16: Nem chua đã lên men bảo quản trong điều kiện lạnh 3 ngày Mẫu 17: Nem chua đã lên men bảo quản trong điều kiện lạnh 4 ngày Mẫu 18: Nem chua đã lên men bảo quản trong điều kiện lạnh 5 ngày Mỗi mẫu được kiểm tra lặp lại 3 lần lấy giá trị trung bình.
2.2.2 Môi trường, hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 2.2.2.1 Môi trường 2.2.2.1 Môi trường
Môi trường nuôi cấy, canh thang, nước pha loãng và môi trường sinh vật hoá học được điều chế theo công thức. Các môi trường được đóng sẵn vào bình cầu, bình nón, ống nghiệm và được hấp tiệt trùng 1210C/15 phút). Các dụng cụ như pipet, ống đong, đĩa peptri được sấy 1800C/30 phút.
2.2.2.2 Hóa chất
Nước Pepton 0,1 %.
Muối Nacl, Na2HPO4 và KH2PO4. Thạch Oxford Agar.
Môi trường tăng sinh BLEB. Thạch máu cừu.
Môi trường test đường gồm: Môi trường cơ bản, agar 1% và canh thang đường Rhamnose, Xylose, Mantose 0,5%.
Bộ thuốc nhuộm Gram. Hydrogen Peroxide 3%
Môi trường giữ chủng: Môi trường lỏng BLEB, 0,6% cao nấm men, 1,5% agar.
2.2.2.3 Máy và dụng cụ thí nghiệm
Ống đong (100ml, 250ml,500ml, 1000ml), bình tam giác, pipet, đĩa peptri, que cấy, đèn cồn, ống nghiệm các loại.
Nồi hấp thanh trùng trong phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học.
Tủ sấy cùng các dụng cụ khác trong phòng thí nghiệm Vi sinh thuộc trung tâm phòng thí nghiệm thực hành trường Đại Học Nha Trang.
2.2.3 Kiểm tra Listeria monocytogenes theo phương pháp MPN (Most Probable Number) Number)
Listeria monocytogenes tồn tại trong thực phẩm không nhiều nên để định lượng
chính xác Listeria monocytogenes trong thực phẩm cụ thể là trong nem chua thì
phương pháp MPN được áp dụng cho kết quả tối ưu nhất so với các phương pháp trên. Phương pháp MPN (phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ) là phương pháp dùng để ước lượng số lượng vi sinh vật hiện diện trong một đơn vị thể tích dựa vào bảng Mac Crandy. Phương pháp MPN dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố VSV trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu.
Mỗi độ pha loãng được nuôi cấy lặp lại 3 lần
Các độ pha loãng được chọn lựa sao cho trong các lần lặp lại có một số lần dương tính và có một số lần âm tính.
Số lần dương tính được ghi nhận và so sánh với bảng thống kê giá trị ước đoán số lượng VSV trong mẫu.
Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp MPN.
Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm tra trong ống nghiệm để xác định ống dương tính. Tra bảng Mac Crandy để có kết quả.
2.2.4 Bố trí thí nghiệm
2.2.4.1 Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes trên nguyên liệu chế biến nem chua
Hình 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm phát hiện và định lượng Listeria monocytogenes trên nguyên liệu
2.2.4.2 Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes trong sản phẩm nem chua a. Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes ở sản phẩm nem chua trong thời a. Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes ở sản phẩm nem chua trong thời gian lên men 3 ngày trong điều kiện thường
Hình 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm phát hiện và định lượng Listeria monocytogenes trong thời gian lên men
Nguyên liệu chế biến
Thịt heo xay Lá gói nem
Phát hiện và định lượng
Listeria monocytogenes
Hỗn hợp gói nem
Nem sống
Lên men (ngày)
1 2 3
Phát hiện và định lượng
b. Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes ở sản phẩm nem chua trong điều kiện bảo quản thường và bảo quản lạnh
Hình 2.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm phát hiện và định lượng Listeria monocytogenes trong quá trình bảo quản
2.2.5 Quy trình thực hiện
Mẫu sau khi đồng nhất được thực hiện như sau:
(1) 1/2 phần mẫu ban đầu đem đi kiểm tra Listeria monocytogenes được mô tả trong phần 2.2.5.1, 2.2.5.2, 2.2.5.3
(2) Phần mẫu còn lại giữ lại ủ ở 48h/300C và cấy trên môi trường OXA, kiểm tra đĩa dương tính với Esculin và sau đó được kiểm tra giống như phần 2.2.5.2 và 2.2.5.3 5 4 5 4 Phát hiện và định lượng Listeria monocytogenes
Sản phẩm nem chua lên men 3 ngày
Bảo quản trong điều kiện lạnh (ngày) Bảo quản trong điều
kiện thường (ngày)
2.2.5.1 Xử lý mẫu và tăng sinh
Hình 2.5: Sơ đồ xử lý mẫu và tăng sinh
Thuyết minh: Sau khi đã cân phân tích 25g/mẫu, thêm 225ml nước muối sinh
lý và đồng nhất mẫu trong bao vô trùng, tiến hành tăng sinh như sau: Chuẩn bị 9 ống (5ml/ống) canh thang chứa môi trường BLEB và 2 ống (9ml/ống) nước muối sinh lý đã được vô trùng (cho 1 mẫu).
• Pha loãng mẫu ở 3 nồng độ 10-1, 10-2, 10-3 bằng cách: cân 25g mẫu đồng
nhất trong 225ml nước muối sinh lý ta được nồng độ 10-1, pha loãng bậc 10 liên tiếp bằng cách hút 1ml từ bao chứa mẫu ban đầu cho vào ống nước muối sinh lý được 10-2 và từ ống 10-2 hút 1ml cho vào ống nước muối sinh lý được nồng độ 10-3.
• Tăng sinh: Mỗi mẫu chuẩn bị 9 ống chứa môi trường BLEB. Ở 3 nồng độ
pha loãng bậc 10 liên tiếp: 10-1, 10-2, 10-3 tiến hành tăng sinh bằng cách ở mỗi nồng độ hút lần lượt 1ml cho vào 3 ống nghiệm chứa canh thang BLEB.
Đem ống nghiệm ủ ở 300C/48h
Cấy một thể tích chính xác vào 9 ống ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp 10-1, 10-2, 10-3
Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa môi trường BLEB Pha loãng mẫu
Hình 2.6: Ống chứa môi trường BLEB dùng cho một mẫu thí nghiệm
• Đem đi ủ ở 340C/48h
2.2.5.2 Định danh Listeria monocytogenes từ các ống nghiệm cấy tăng sinh
Hình 2.7: Sơ đồ định danh Listeria monocytogenes
Thuyết minh: Phát hiện Listeria monocytogenes có trong các ống nghiệm thuộc dãy MPN. Quá trình định danh như sau:
Ủ 34°C/ 48 giờ
Khuẩn lạc có Esculin (+) Ống nghiệm thuộc dãy MPN
Đĩa thạch OXA
a. Esculin
Tại thời điểm 48h, cấy ria trên môi trường thạch phân lập OXA chứa esculin. Nuôi cấy trên các đĩa thạch OXA ở 30 ÷ 380C trong 48h. Theo dõi tại thời điểm 48h ngay sau khi phân lập, các khuẩn lạc Listeria có màu nâu đen với quầng đen trên
môi trường chứa esculin. Một số khuẩn lạc màu đen hơi nâu nhưng xuất hiện chậm hơn 2 ngày nhưng không được coi là Listeria.
Hình 2.8: Esculin dương tính (bên trái) - Esculin âm tính (bên phải) b. Khả năng lên men đường
Sử dụng que cấy kim lấy giống vi sinh vật từ các đĩa dương tính với Esculin, dùng que cấy đâm sâu vào khối thạch hình trụ. Ủ các ống canh trùng thử khả năng lên men đường Rhamnose, Mantol, Xylose 0,5% ở 300C 24 ÷ 48h. Kết quả dương tính (môi trường chuyển sang màu vàng đối với đường Rhamnose và chuyển sang màu xanh đối với đường Xylose) và theo dõi thường xuyên
Hình 2.9: Các ống nghiệm kiểm tra khả năng lên men đường Rhamnose và Xylose. Dương tính (màu vàng) âm tính (màu xanh)
c. Thử catalase
Mục đích: kiểm tra khả năng phân huỷ H2O2 của vi sinh vật nhờ sản sinh ra enzyme catalaza.
• Chuẩn bị dung dịch H2O2 nồng độ 3-10%, nhỏ trực tiếp dung dịch H2O2 lên khuẩn lạc trên đĩa thạch.
• Nếu thấy sủi bọt là dương tính, không sủi bọt là âm tính.
Listeria monocytogenes dương tính với catalaza.
d. Nhuộm gram
Listeria monocytogenes gram (+) bắt màu tím.
Hình 2.10: Vi khuẩn Listeria monocytogenes bắt màu tím khi nhuộm gram e. Thử khả năng di động theo phương pháp giọt treo
Kiểm tra bằng tiêu bản soi tươi, dùng nước muối sinh lý 0,85% tạo huyền dịch. Chon một khuẩn lạc đủ lớn để làm giọt treo tương đối cao, đánh cho tan đều. Nếu lấy quá ít vi khuẩn, một vài tế bào hiện diện sẽ dán dính trên phiến kính và cho thấy không di động.
Theo dõi trên kính hiển vi, Listeria monocytogenes có hình que ngắn, mảnh, di động quay tròn chậm hoặc theo kiểu nhào lộn do nó có tiêu mao. Đối với, các trực khuẩn lớn hoặc trực khuẩn di chuyển nhanh, kiểu bơi không phải là L. monocytogenes.
2.2.6 Thử khả năng tan huyết
Nếu các đặc tính hình thái, sinh lý học và phản ứng catalaza cho thấy có khả năng có Listeria ssp, thì cấy lên đĩa thạch máu để xác định phản ứng haemolytic. Vạch các ô hình lưới trên đáy đĩa Petri từ 20 đến 25 ô trên một đĩa. Chọn khuẩn lạc điển hình trên môi trường thạch OXA, dùng kim cấy chấm vào mỗi ô một khuẩn lạc. Ủ 370C trong 24 ÷ 28h.Trên môi trường thạch máu, khuẩn lạc Listeria monocytogenes được bao quanh bởi vòng sáng hẹp do hiện tượng dung huyết dạng .
Hình 2.11: Hình ảnh Listeria monocytogenes trên thạch máu cừu
Nhận xét: Vòng tan máu bê-ta quanh khuẩn lạc do tan tế bào máu, tạo vùng
trong suốt.
2.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Số liệu được xử lý nhờ phần mềm MS Excel. So sánh sự khác biệt dựa vào phân tích phương sai (ANOVA), sự khác biệt có ý nghĩa với p≤0,05. Số liệu trình bày trong các bảng số liệu là giá trị trung bình ± mức tin cậy 95%.
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 TÌNH HÌNH NHIỄM LISTERIA MONOCYTOGENES TRÊN NGUYÊN
LIỆU LÀM NEM CHUA
Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes trên các nguyên liệu chế biến nem và sự lây nhiễm trong quá trình chế biến vào hỗn hợp làm nem được trình bày trong