KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA MÀNG BC HẤP PHỤ DỊCH NISIN TRONG BẢO QUẢN LÒNG ĐỎ TRỨNG VỊT MUỐI

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA MÀNG BC HẤP PHỤ DỊCH NISIN TRONG BẢO QUẢN LÒNG ĐỎ TRỨNG VỊT MUỐI

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

-o0o -LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA MÀNG

BC HẤP PHỤ DỊCH NISIN TRONG BẢO QUẢN

LÒNG ĐỎ TRỨNG VỊT MUỐI

SVTH: Đỗ Hương Thảo MSSV: 60502634

CBHD: Ths Lâm Xuân Uyên

Ts Nguyễn Thúy Hưong

Bộ môn: Công Nghệ Sinh Học

TP Hồ Chí Minh, 02/2010

MỞ ĐẦU

Những năm gần đây trứng vịt muối là một trongnhững mặt hàng nông sản xuất khẩu có ưu thế cạnh tranh, đặc biệt lượng hàng xuất khẩu trứng vịt muối tăng lên vào các dịp trung thu hàng năm Do đó, việc rút ngắn thời gian sản xuất và kéo dài thời gian bảo quản trứng vịt muối được các nhà nghiên cứu trong nước quan tâm.

Hiện nay, nisin đã được sử dụng như một hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn(bacteriocin), có hoạt tính cao và an toàn khi dùng trong thực phẩm được Mỹ và hơn

50 quốc gia công nhận Tuy nhiên, dịch bacteriocin bao bọc bề mặt thực phẩm khônghiệu quả, thời gian lưu lại trên thực phẩm ngắn Ngoài ra, do bacteriocin có bản chấtlà protein nên dễ bị enzyme protease thủy phân Từ những đặc điểm trên cần phải cóhướng giải quyết mới để có thể cố định được dịch bacteriocin giúp thời gian lưu lại lâuhơn, tăng được thời gian bảo quản thực phẩm

Do đó, đề tài: “Bảo quản lòng đỏ trứng vịt muối bằng màng BC hấp phụ

nisin có nguồn gốc từ Lactococcus lactis” hướng đến những mục tiêu và nội dung sau:

1 Mục tiêu chính của đề tài:

- Khảo sát khả năng hấp phụ dịch bacteriocin vào màng mỏng BC

- Ứng dụng màng BC hấp phụ dịch bacteriocin để bảo quản lòng đỏtrứng vịt muối

2 Nội dung nghiên cứu

- Tạo màng BC

- Khảo sát khả năng hấp phụ dịch bacteriocin vào màng BC

- Ứng dụng màng BC hấp phụ dịch bacteriocin để bảo quản lòng đỏtrứng vịt muối

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Bacteriocin

1.2.1 Giới thiệu về bacteriocin

Bacteriocin là những hợp chất có bản chất protein do vi khuẩn sinh tổng hợp và cókhả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn khác có liên hệ gần với giống sản xuất.Bacteriocin được tổng hợp bởi vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương vớinhững đặc điểm:

- Bacteriocin do vi khuẩn Gram âm tổng hợp: gồm nhiều loại protein khác nhauvề kích thước, nguồn gốc vi sinh vật, kiểu tác động và cơ chế miễn dịch.Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm được nghiên cứu nhiều nhất là Colicin do vi

khuẩn Escherichia coli tổng hợp Khả năng ức chế của bacteriocin do vi khuẩn

Gram âm tổng hợp yếu hơn bacteriocin do vi khuẩn Gram dương

- Bacteriocin do vi khuẩn Gram dương tổng hợp: các bacteriocin này cũng nhiềunhư ở vi khuẩn Gram âm Chúng khác với bacteriocin của vi khuẩn Gram âm ởnhững điểm sau: việc tạo bacteriocin không cần thiết phải gây chết cho vi sinhvật chủ và sự sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn Gram dương cần nhiềugen hơn ở vi khuẩn Gram âm

Bacteriocin khác với kháng sinh ở những điểm sau:

- Được tổng hợp nhờ ribosome

- Tế bào chủ miễn dịch với chúng

- Phương thức hoạt động khác biệt với kháng sinh

- Phổ kháng khuẩn hẹp vì vậy thường chỉ có khả năng tiêu diệt những chủng vikhuẩn gần với giống sản xuất

Có rất nhiều giống vi khuẩn sinh tổng hợp bacteriocin, LAB được quan tâm nhiều

do bacteriocin của LAB có phổ kháng khuẩn rộng

1.1.2 Phân loại

Bacteriocin do LAB sản xuất được chia thành 4 lớp:

Lớp I: (Lantibiotic) những phân tử peptide nhỏ (<5kDa), chịu nhiệt, hoạt động

trên cấu trúc màng Lantibiotic chứa những acid amin hiếm (lanthionine, 3 –methyllanthionine) và một số acid amin khử nước

Lantibiotic có thể được chia thành hai phân lớp dựa vào những đặc điểm cấutrúc và chức năng:

- Lớp Ia: là những peptide tích điện dương, gồm từ 21-38 acid amin Nhữngpeptide này hoạt động chủ yếu do sự phá vỡ trạng thái nguyên vẹn của màngtế bào đích Có thể chia Lantibiotic thành hai phân nhóm dựa trên kích thước ,điện tích và trình tự leader peptide

- Lớp Ib: là những phân tử peptide hình cầu, có thể chứa đến 19 acid amin Hoạtđộng chủ yếu của chúng là phá vỡ chức năng của các enzyme như ức chế việcsinh tổng hợp vách tế bào của tế bào đích

Lantibiotic được tạo thành ở trạng thái bất hoạt với trình tự leader ở đầu

N, trình tự này sẽ bị cắt đi trong quá trình trưởng thành để phóng thích peptidehoạt hóa

Lớp II: là những phân tử bacteriocin nhỏ (<10kDa) gồm những phân tử peptide

hoạt động ở màng tế bào, không chứa lanthionine và bền nhiệt, gồm 30-60 acid amin.Bacteriocin lớp II có phổ kháng khuẩn hẹp Lớp II có thể chia thành 3 phân lớp:

- Lớp IIa: rất đa dạng, điểm đặc trưng là trình tự bảo tồn ở đầu N và hoạt tính

kháng Listeria.

- Lớp IIb: những bacteriocin lớp này cần có sự kết hợp của hai peptide tronghoạt động để có hoạt tính kháng khuẩn hoàn chỉnh Trong hầu hết các trường

hợp, các peptide rời cũng biểu hiện hoạt tính bacteriocin nhưng hoạt tính sẽcao hơn khi có sự diện của peptide thứ hai.

- Lớp IIc: bacteriocin phụ thuộc nhân tố sec- Phân tử bacteriocin lớp IIc được

đưa ra ngoài tế bào xuyên qua màng tế bào chất bằng con đường tiết phụ thuộc

nhân tố sec-.

Bacteriocin lớp IIa có tiềm năng ứng dụng trong quy mô công nghiệp nhờ khả

năng kháng Listeria mạnh, thậm chí chúng còn được quan tâm nhiều hơn các

bacteriocin lớp I (Nisin) do chúng có phổ kháng khuẩn không rộng, không tiêu diệt những chủng khởi động Pediocin PA-1 là một ví dụ điển hình và được nghiên cứu phổbiến nhất trong số các bacteriocin lớp IIa

Lớp III: là những phân tử protein lớn (>30kDa), bền nhiệt Lớp này gồm

những enzyme ngoại bào (hemolysin và muramidase) có hoạt tính sinh lý của

bacteriocin Bacteriocin thuộc lớp III được thu nhận từ một số giống Lactobacillus

Lớp IV: là những bacteriocin phức hợp, ngoài protein còn có thêm lipid và

cacbohydrate Hiện nay vẫn còn nhiều điều chưa biết về cấu trúc cũng như chức năngcủa bacteriocin thuộc lớp này vì chưa có phân tử nào được tinh sạch Bacteriocin lớp

IV là kết quả của sự tương tác đặc tính kỵ nước và tích điện dương của bacterocin vớicác phân tử khác trong dịch thô Lớp này bao gồm cả glycoprotein hoặc lipoprotein Ví

dụ như leuconocin S và lactocin 27

Trong 4 lớp trên thì bacteriocin của lớp I và lớp II rất phong phú và có tiềmnăng thương mại

Trong các chủng LAB thì Lactococcus lactis được quan tâm nghiên cứu rất nhiều, một số chủng Lc.lactis có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin Bacteriocin do Lc.lactis gồm hai loại: lantibiotic và các bacteriocin kích thước nhỏ, bền nhiệt không

phải lantibiotic

Lactococcus có khả năng sinh tổng hợp nisin – bacteriocin duy nhất được Tổ

chức nông lương thế giới (FAO) và Tổ chức y tế thế giới (WHO) chấp nhận cho phépsử dụng như một chất phụ gia thực phẩm Nisin sẽ phá vỡ chức năng vận chuyển củamàng tế bào và tế bào chất thoát ra ngoài, nó có khả năng chống cả vi khuẩn Gramâm lẫn vi khuẩn Gram dương, ức chế sự hình thành bào tử Nisin có phổ kháng khuẩn

rộng đối với hầu hết các chủng LAB, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, tế bào dinh dưỡng của Bacillus spp và Clostridium spp cũng như ức chế nảy chồi của bào tử các loài Bacillus và Clostridoum [23]

Ngoài lantibiotic, Lc lactis còn có khả năng sinh tổng hợp những phân tử

bacteriocin kích thước nhỏ và bền nhiệt, điển hình là lactococin A,B và M Lactococin

có phổ kháng khuẩn hẹp hơn nisin, chúng chỉ có thể ức chế những chủng Lactococcus

khác với chủng sản xuất

1.1.3 Nisin – Bacteriocin của vi khuẩn Lactococcus lactis

Định nghĩa

Nisin là bacteriocin có chứa lantibiotic do Lc lactis sản xuất và là bacteriocin

duy nhất được tổ chức nông lương thế giới (FAO) và tổ chức y tế thế giới (WHO) chấpnhận cho phép sử dụng như một chất phụ gia thực phẩm

Chủng sản xuất nisin đầu tiên được tìm thấy trong sữa bởi Roger (1928),Whitehead (1933), Meanwel (1943) và Hirish (1944) Từ đó người ta ước lượng được

khoảng 1/3 các chủng Lc lactis subsp lactis có khả năng sản xuất nisin.

Nisin có phổ kháng khuẩn rộng đối với hầu hết các chủng LAB, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, tế bào dinh dưỡng của Bacillus spp và Clostridium spp cũng như ức chế sự nảy chồi của bào tử các loài Bacillus và Clostridium.

Đặc điểm

 Tính chất vật lý của nisin

Phân tử lượng của một phân tử nisin là 3,4 KDa Phân tử nisin có tính phân cực

với đầu N kỵ nước và đầu C ưa nước Tính tan của nisin phụ thuộc vào pH của môi

trường Khi pH của môi trường tăng tính tan của nisin giảm mạnh Ở điều kiện trungtính và kiềm, nisin hầu như không tan Độ bền của nisin có quan hệ chặt chẽ với tínhtan Độ bền của nisin không chỉ phụ thuộc vào pH mà bị ảnh hưởng bởi các yếu tốkhác: thành phần môi trường, nhiệt độ, … Nisin bị bất hoạt bởi  - chymotripsin,pancreatin và subtilopeptidase nhưng không bất hoạt bởi carboxypeptidase A, pepsinvà tripsin

 Tính chất hóa học của nisin

Khác với bacteriocin sản xuất từ LAB hay từ các loài vi khuẩn khác, nisin cóphổ kháng khuẩn tương đối rộng Nisin ức chế chủ yếu vi khuẩn Gram (+) Nisin ứcchế tế bào sinh dưỡng và cả bào tử vi khuẩn

Hoạt tính sinh học của nisin phụ thuộc vào pH của môi trường Hoạt tính sinhhọc của nisin giảm khi pH môi trường tăng

Đơn vị đo hoạt độ của nisin là IU (International unit), được định nghĩa là hoạttính có trong 1g Nisaplin – nisin thương mại 1g nisin tinh sạch chứa 40 x 106 IU, haynói cách khác, hoạt tính sinh học của 40 IU tương đương với 1g nisin tinh sạch

1.1.4 Một vài đặc điểm sinh lý, sinh hóa của bacteriocin do LAB sinh tổng hợp

Để thực hiện hoạt tính gây chết, các bacteriocin thuộc lớp I và II phải thỏamãn hai yêu cầu: tích điện dương và kỵ nước

Hầu hết các bacteriocin kích thước nhỏ hoạt động trong phạm vi pH rộng từ

3-9 Thậm chí acidocin B có thể hoạt động ở pH 11 Ở điểm đẳng điện cao cho phépchúng tương tác với bề mặt tích điện âm của tế bào vi khuẩn Đối với các bacteriocincó phổ kháng khuẩn rộng, các hợp chất cần thể nhận sẽ gắn phần kỵ nước vào màng

vi khuẩn Sự liên kết các phân tử bacteriocin với nhau sẽ tạo thành những lỗ xuyênmàng làm mất gradient và gây chết tế bào.

Tính chịu nhiệt cũng là những đặc điểm chính của bacteriocin trọng lượng thấp.Các liên kết monosulfit và disulfit trong phân tử càng nhiều thì phân tử peptide càngổn định Hầu hết dịch nổi tế bào của chủng sinh bacteriocin vẫn còn hoạt tính khi xửlý nhiệt hoặc hấp khử trùng bằng nồi hấp áp lực Tuy nhiên, một vài loại bacteriocin

tạo bởi một số chủng Lactobacillus như helveticin bị bất hoạt khi xử lý nhiệt 60-100oCtrong 10 - 15 phút

1.1.5 Quá trình sinh tổng hợp tạo bacteriocin

1.1.5.1 Cụm gen sinh tổng hợp bacteriocin

Sự sinh tổng hợp bacteriocin nhờ vào một cấu trúc gen bao gồm bốn gen khácnhau mã hóa chức năng cơ bản cho việc sản xuất chất kháng khuẩn ngoại bào Bốngen đó bao gồm:

(1) Gen cấu trúc mã hóa các prebacteriocin

(2) Gen miễn dịch luôn luôn nằm kế gen bacteriocin và trên cùng đơn vịtranscription

(3) Gen mã hóa ABC-transporter có chức năng vận chuyển bacteriocin ra ngoài.(4) Gen mã hóa một protein phụ cần thiết cho sự vận chuyển bacteriocin rangoài, có vai trò nhất định nhưng đến nay chưa được làm rõ

Bacteriocin được tổng hợp nhờ ribosome Các gen mã hóa cho việc sản xuất vàmiễn dịch bacteriocin thường sắp xếp thành những cụm gen operon Hệ thốnglactococcin A có hai operon được tìm thấy, trong khi đó đối với hệ thống pediocin PA-

1 điều khiển một operon bao gồm cả bốn gen tham gia đến việc sản xuất phân tửbacteriocin chủ động Đối với những bacteriocin mạch thẳng không trải qua quá trình

biến đổi (gồm plantaricin, carnobacteriocin và sakacin), chúng có những pepetide cảmứng kích thích tổng hợp bacteriocin Gen mã hóa các peptide này thường định vị trêncùng một cụm Các cụm gen bacteriocin có thể định vị trên nhiễm sắc thể (subtilin vàmersacidin), trên plasmid (divergicinA và sakicin A) hoặc các gen nhảy, transposon(nisin và lacticin 481).

Các operon sinh tổng hợp lantibiotic thường chứa các gen mã hóa cho:prepeptide (Lan A), các enzyme thực hiện các phản ứng biến đổi (Lan B,C/Lan M),các protease giúp loại bỏ các trình tự leader peptide (LanP), hệ thống ABC (ATP-binding cassette), protein vận chuyển peptide (Lan T), protein điều hòa (Lan R,K),protein liên quan đến các trình tự bảo vệ của tế bào chủ sản xuất bacteriocin (miễndịch) (Lan I, FEG)

Sự điều hòa sinh tổng hợp bacteriocin lớp II (lactococcin A, B, M pediocin PA-1và plantaricin A) cũng đã được nghiên cứu Các gen mã hóa cho việc sinh tổng hợpbacteriocin lớp II có nhiều điểm tương đồng về mặt cấu trúc di truyền, chúng gồm cácgen cấu trúc mã hóa cho các phân tử tiền peptide, gen miễn dịch, gen mã hóaproteinvận chuyển ABC và gen mã hóa cho protein phụ trợ Trong một số trường hợpcó thể có một số gen điều hòa Các protein phụ trợ cần thiết cho quá trình tiếtbacteriocin lớp II ra môi trường

1.1.5.2 Quá trình sinh tổng hợp bacteiocin

Hầu hết các bacteriocin được tổng hợp dưới dạng tiền peptide bất hoạt có mangmột trình tự leader peptide ở đầu bám và trình tự ở đầu C của propeptide

Trong trường hợp lantibiotic, các phân tử serine, threonine và cysteine trongphần propeptide trải qua những biến đổi sau dịch mã để hình thành Lan/MeLan

Con đường sinh tổng hợp lantibiotic gồm những bước sau:

- Bước 1: Sinh tổng hợp phân tử tiền bacteriocin.

- Bước 2: Phân tử tiền bacteriocin bị biến đổi bởi Lan B, Lan C sau đó được vậnchuyển qua màng bởi hệ thống vận chuyển ABC Lan T, đồng thời được biếnđổi bởi LanC để phóng thích phân tử bacteriocin trưởng thành Tuy nhiên quátrình cắt trình tự leader peptide có thể xảy ra trước, trong hoặc sau bước xuấtbào

- Bước 3: Histidine protein kinase (HPK) cảm ứng sự hiện diện của bacteriocinvà tự phosphoryl hóa

- Bước 4: Nhóm phosphoryl hóa (P) được chuyển qua nhân tố đáp ứng điều hòa(response regulator – RR)

- Bước 5: Nhân tố RR hoạt hóa sự phiên mã của các gen được điều hòa

- Bước 6: Sự hiện diện của bacteriocin cảm ứng hoạt động tự miễn của tế bàosản xuất Sự tự miễn được điều khiển bởi các protein miễn dịch, Lan I, proteinvận chuyển ABC và Lan FEG

Hình 1.1 Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp lantibiotic [20].

Bacteriocin lớp II được tổng hợp ở dạng phân tử tiền peptide chứa một trình tựleader bảo tồn ở đầu N và một vị trí glycerin kép phục vụ cho việc phân giải protein(ngoại trừ bacteriocin lớp IIc, được tổng hợp với một trình tự tín hiệu ở đầu N, đượcbiến đổi và tiết ra khỏi tế bào) Khác với lantibiotic, bacteriocin lớp IIa không trải quaquá trình biến đổi sau dịch mã Sau khi hình thành, phân tử tiền peptide sẽ được biếnđổi để loại bỏ leader peptide cùng lúc với việc xuất khỏi tế bào qua hệ thống vậnchuyển ABC và các protein phụ trợ của nó.

Trình tự leader peptide có thể thực hiện một số chức năng chuyên biệt:

- Là vị trí nhận biết cho các protein biến đổi và vận chuyển tiền peptide

- Bảo vệ tế bào sản xuất tránh khỏi tác động của bacteriocin khi còn ở bên trongtế bào bằng cách giữ chúng ở trạng thái bất hoạt

- Tương tác với vùng propeptide để đảm bảo cấu trạng thích hợp cần thiết chosự tương tác giữa enzyme và cơ chất

Con đường sinh tổng hợp bacteriocin lớp II:

- Bước 1: Sinh tổng hợp phân tử tiền bacteriocin và các tiền peptide của cácnhân tố cảm ứng (IF)

- Bước 2: Phân tử tiền bacteriocin và các tiền nhân tố IF được biến đổi và vậnchuyển nhờ hệ thống vận chuyển ABC, phóng thích bacteriocin trưởng thànhvà nhân tố IF

- Bước 3: Histidine protein kinase (HPK) cảm ứng sự hiện diện của IF và tựphosphoryl hóa

- Bước 4: Nhóm phosphoryl hóa (P) được chuyển qua nhân tố đáp ứng điều hòa(response regulator – RR)

- Bước 5: Nhân tố RR hoạt hóa sự phiên mã của các gen được điều hòa

- Bước 6: Sự hiện diện của bacteriocin cảm ứng hoạt động của các protein cóchức năng tự miễn của tế bào sản xuất [23].

1.1.5.3 Điều hòa sinh tổng hợp bacteriocin

Quá trình sinh tổng hợp bacteriocin được điều hòa nhờ hệ thống điều hòa haithành phần Hệ thống điều hòa này chứa hai protein phát tín hiệu: histidine proteinkinase (HPK) liên kết màng và nhân tố điều hòa đáp ứng trong tế bào chất (reponseregulator – RR) Trong quá trình truyền tải tín hiệu, HPK tự phosphoryl phân tửhistidine khi nó cảm ứng được sự hiện diện của bacteriocin ở nồng độ tới hạn trongmôi trường Sau đó nhóm phosphoryl được huyển đến phân tử aspartic acid ở vùng RRtạo ra sự thay đổi nội phân tử, tác động đến nhân tố điều hòa đáp ứng làm hoạt hóaquá trình phiên mã của các gen được điều hòa Các gen điều hòa gồm: gen cấu trúc,gen xuất bào, gen miễn dịch

Trong trường hợp nisin và subtilin, phân tử bactreiocin đóng vai trò như một tínhiệu ngoại bào để tự điều hòa quá trình sinh tổng hợp của chúng theo con đườngtruyền tải tín hiệu Ngược lại hầu hết bacteriocin lớp II sản xuất một peptide giốngbacteriocin nhưng không có hoạt tính kháng khuẩn và sử dụng nó như một nhân tốcảm ứng (IF) để hoạt hóa quá trình phiên mã của các gen được điều hòa IF là mộtpeptide nhỏ, bền nhiệt, tích điện dương và kị nước, được tổng hợp dưới dạng một tiềnpeptide với một trình tự leader glycine kép Hệ thống vận chuyển sẽ cắt bỏ peptideleader của IF cùng lúc với quá trình xuất bào của peptide trưởng thành IF được tiết rađóng vai trò như một tín hiệu ngoại bào và tác động đến quá trình phiên mã của cácgen liên quan đến việc sản xuất bacteriocin [23]

1.1.6 Cơ chế hoạt động của bacteriocin

Do có sự khác nhau về cấu trúc hóa học mà bacteriocin sẽ có cách thức tácđộng khác nhau với các tế bào sống Các bacteriocin có thể tác động lên sự sao chép,phiên mã, dịch mã, tổng hợp thành tế bào Tuy nhiên, hầu hết các bacteriocin hoạtđộng bằng cách tạo kênh hay lỗ trên màng làm phá hủy năng lượng hữu ích của tế bàosống

Cơ chế tác động của nisin được nghiên cứu kỹ nhất Nisin thuộc nhóm Ia, tíchđiện dương, tích điện tĩnh điện với màng phospholipid tích điện âm Kết quả tạo phầntương tác kị nước giữa bacteriocin với màng tế bào chất của tế bào đích Lysine làamino acid tích điện âm có liên quan tới sự tương tác tĩnh điện này Sự tương tác giữaphần kị nước của nisin và màng tế bào đích tạo những kênh ion không đặc hiệu Việctạo các lỗ làm giảm sự hiện diện của các ion dương hóa trị II như Mg2+, Ca2+ Bởi vìchúng trung hòa điện tích âm của phospholipid, làm giảm sự linh động của màng Cáclỗ trên màng tạo bởi nisin làm cho các ion K+, Mg2+, acid amin, acid glutamic và lysinevà ATP thoát ra ngoài nhưng các protein lớn trong tế bào chất không qua được, vì vậytạo thế màng, làm mất động lực proton nên sẽ gây chết tế bào

Lipid II cũng tham gia trong việc tạo thành các lỗ, lipid II đóng vai trò nhưnhững phân tử cắt cụt cho các liên kết đặc hiệu với màng tế bào vi khuẩn

Ở bacteriocin như mersacidin và actagardin thì cơ chế hoạt động của chúng làtác động lên sự tổng hợp của thành tế bào, các bacteriocin này ngăn cản việc gắn cácphân tử glucose và D-alanine và thành tế bào, sự tổng hợp DNA, RNA và protein xảy

ra một cách tự do Cả hai bacteriocin này đều ức chế sự sinh tổng hợp petidoglycanbằng cách tạo phức hợp với tiền chất lipid II của peptidoglycan gắn trên màng

Nhìn chung, cơ chế hoạt động của bacteriocin lớp IIa cũng giống như nisin Đặc

tính bacteriocin nhóm này là kháng Listeria do sự hiện diện của trình tự YGNGV ở

vùng đầu N Giả thiết hiện nay để lý giải cơ chế hoạt động của nhóm này là liên kếttĩnh điện của bacteriocin với màng tế bào đích qua trung gian phân tử receptor liên kết

trên màng Giả thiết về receptor đáp ứng cho sự nhận diện kiểu kháng Listeria

YGNGV ở những peptide này Người ta cho rằng bacteriocin nhóm IIa có thể tự tạo lỗxuyên qua màng tế bào vì chúng là những bacteriocin cực nhỏ và lưỡng cực Cácbacteriocin lớp phụ IIc theo khóa phân loại Klaenhammer được chia thành hai nhómkhác nhau dựa vào việc có hay không có sự hiện diện liên kết disulfit bên trong phântử Do đó, hoạt động của hai nhóm này hoàn toàn khác nhau

Các nghiên cứu trên màng được tiến hành với lactococcin – bacteriocin thiếuphần L-cysteine và thấy rằng đây là protein hoạt động trên màng Cơ chế hoạt độngchính là sự tạo thành các lỗ trên màng tế bào Phổ kháng khuẩn rộng của những hợpchất này chứng tỏ có sự hiện diện của receptor bacteriocin liên kết đặc hiệu trênmàng Các acid amin tích điện âm và tryptophan trong vùng ưa nước có thể thuận lợicho các tương tác không đặc hiệu với lớp phospholipid tích điện âm của màng tế bàođích làm cho các lỗ xuyên màng ổn định hơn [12], [22]

1.1.7 Khả năng tự miễn bacteiocin của tế bào chủ

Hiện nay, có hai hệ thống tự miễn lantibiotic của tế bào sản xuất đã được nhậnđịnh Sự bảo vệ này được kiểm soát bởi các protein miễn dịch Lan I, protein vậnchuyển ABC và Lan FEG Hai hệ thống này hoạt động hỗ trợ lẫn nhau bảo vệ tế bàosản xuất khỏi tác động của bacteriocin do chính chúng sinh ra

Lan I bám trên mặt ngoài của màng tế bào chất và bảo vệ tế bào bằng cáchngăn chặn sự tạo lỗ của bacteriocin Lan FEG hoạt động bằng việc vận chuyển cácphân tử bacteriocin đã chèn vào màng để đem chúng trở về môi trường ngoại bào, nhờ

vậy Lan FEG giúp đỡ nồng độ bacteriocin bên trong tế bào luôn ở mức thấp hơn mứctới hạn.

Gen tự miễn của bacteriocin lớp II thường mã hóa cho một loại protein liên kếtvới màng tế bào chất Quadri và cs (1995) đã xác định đa phần protein miễn dịchCbiB2 của carnobacteriocin B2 được tìm thấy bên trong tế bào chất và một lượng íthơn kết hợp với màng Tương tự theo Abdel-Dayem và cs (1996) phần lớn proteinmiễn dịch MesI của mesentericin Y105 tồn tại trong tế bào chất và chỉ một lượng nhỏđược phát hiện trên màng tế bào

Protein miễn dịch là những phân tử tích điện dương, có khoảng 51-254 acidamin, cung cấp khả năng miễn dịch đối với bacteriocin Sự tương tác của protein miễndịch với màng tế bào giúp bảo vệ tế bào sản xuất tránh khỏi tác động của bacteriocin

do chúng sản sinh ra [23]

1.1.8 Ứng dụng bacteriocin

Ngành công nghiệp thực phẩm có thể ứng dụng khả năng bảo quản sản phẩmcủa bacteriocin bằng việc sử dụng các giống vi sinh vật sản sinh bacteriocin trong quátrình sản xuất hoặc bổ sung các chế phẩm có chứa bacteriocin trực tiếp vào sản phẩm

Nisin là một loại bacteriocin được ứng dụng phổ biến nhất và là lantibiotic duynhất đang được thương mại hóa Nisin trên thị trường hiện nay có một loại dạng bột làNisaplin và một loại có thành phần là 2,5% nisin kết hợp với 77,5% NaCl và bột sữakhông béo (12% protein và 6% carbonhydrate) được gọi là Novasin Ngoài ra, còn cómột loại bacteriocin được thương mại hóa nữa là ALTA 2431 (sản phẩm từ pediocin

PA – 1)

Ứng dụng của bacteriocin trong các sản phẩm làm từ sữa

Một ứng dụng chính của nisin là sản xuất phomai Việc sử dụng nisin lấy từ

Lactoccoci là sự lựa chọn tuyệt vời cho việc ứng dụng nisin như một thành phần phụ

gia trong sản xuất phomai

Davies và cs (1997) đã thử nghiệm sử dụng nisin để kiềm hãm sự sinh trưởng

của vi khuẩn L monocytogenes gây bệnh trong phomai Kết quả cho thấy, với mẫu sử dụng nisin với nồng độ 2,5 mg/l sẽ kìm hãm sự phát triển của L monocytogenes đến 8

tuần so với mẫu đối chứng chỉ với 2 tuần đã không còn an toàn Khi đo hàm lượngnisin ban đầu và còn lại trong sản phẩm cho thấy nisin chỉ mất đi 10 – 32% sau 10tuần bảo quản ở 6 – 80C [20]

Ứng dụng của bacteriocin trong các sản phẩm thịt

Pawar và cs (2000) đã thử nghiệm trên thịt trâu cắt nhỏ để kiểm tra hoạt độngcủa nisin đơn lẻ (ở hoạt độ 400 và 800 IU/g) và kết hợp nisin với 2% sodium chloride

để chống lại sự phát triển của L monocytogenes Mẫu thịt đối chứng được tiêm vào 103

CFU/g L monocytogenes và được bảo quản ở 40C Số lượng tế bào L monocytogenes

trong mẫu đối chứng tăng từ 3 log10 đến 6,4 log CFU/g sau 16 ngày bảo quản Tuy

nhiên, nisin lại tác động một cách rất hiệu quả đến sự phát triển của L monocytogenes Người ta thêm vào nisin có hoạt tính 400 IU/g để làm tăng pha lag của

L monocytogenes, và nisin ở hoạt tính 800IU/g đã cho thấy kết quả số lượng tế bào L monocytogenes giảm xuống chỉ còn 2,4-log CFU/g, thấp hơn mẫu đối chứng sau 16

ngày bảo quản Sự kết hợp của nisin với 2% sodium chloride cũng làm tăng hiệu quảbảo quản [31]

Lauková và cs (1999) đã kiểm nghiệm sự hiệu quả của enterocin CCM 4231

trong việc kiểm soát L monocytogenes nhiễm vào quá trình sản xuất xúc xích lên men Việc thêm vào enterocin làm giảm một cách nhanh chóng số lượng tế bào L monocytogenes từ 108 CFU/ml xuống còn 1.7-log10 Sau một tuần của quá trình lên

men, lượng L monocytogenes trong mẫu đối chứng (không bổ sung enterocin) tăng lên

107CFU/g, trong khi mẫu thí nghiệm (có bổ sung enterocin) chỉ còn 104CFU/g, sự khácbiệt này vẫn được suy trì sau 2-3 tuần [26]

Ứng dụng bacteriocin trong các sản phẩm thủy sản

Để kéo dài thời gian bảo quản tôm biển, người ta thường sử dụng sorbic và acidbenzoic Tuy nhiên, điều này lại đặt ra nhiều mối lo lắng cho người tiêu dùng vì sựlạm dụng các chất này Do đó, Einarsson và Lauzon (1995) đã nghiên cứu ứng dụngbacteriocin vào bảo quản tôm biển để giải quyết vấn đề này Họ đã đánh giá tính hiệuquả của việc sử dụng nisin Z, carnocin UI49, và bavaricin A thô vào việc kéo dài thờigian bảo quản của tôm biển Kết quả là Carnocin UI49 không có khả năng kéo dàithời gian so với mẫu đối chứng sua 10 ngày bảo quản Trong khi đó bavaricin A lại cókhả năng tăng thời gian bảo quản lên 16 ngày và nisin Z tăng thời gian bảo quản lênđến 31 ngày Tuy nhiên đây cũng chỉ là những nghiên cứu bước đầu vì thời gian bảoquản tôm biển bằng muối benzoate và sorbate là 59 ngày Do đó, cần phải có nhữngnghiên cứu sâu hơn để tìm ra biện pháp hiệu quả hơn [21]

Nykanen và cs (2000) đã thử nghiệm nisin và sodium lactate và kết hợp cả haitrên thịt cá hồi xông khói Những mẫu cá hồi được bảo quản ở 80C trong 17 ngày và

30C trong 29 ngày Cả nisin và sodium lactate đều có ảnh hưởng đến sự phát triển của

L monocytogenes trong cá xông khói, nhưng khi kết hợp cả hai thì mang lại hiệu quả tốt hơn Sự kết hợp của nisin và sodium lactate làm giảm số lượng vi khuẩn L monocytogenes từ 3.3 xuống 1.8 log10 CFU/g trong vòng 16 ngày bảo quản ở 80C Hàm

lượng L monocytogenes duy trì ở mức không đổi (4.7 đến 4.9 log10 CFU/g) trong vòng

29 ngày khi bảo quản ở 30C [30]

1.2 Cellulose vi khuẩn

1.2.1 Vi sinh vật sản sinh BC

1.2.1.1 Các vi khuẩn tạo màng BC

BC được tổng hợp bởi một số loài vi khuẩn khác nhau Con đường sinh tổng hợpvà cơ chế điều hòa tổng hợp BC ở các loài tương đối giống nhau, nhưng cấu trúc BC ởmỗi loài thì khác nhau Có các điểm khác biệt đáng kể về thuộc tính vật lý của cácsản phẩm cellulose chủ yếu là chiều dài của chuỗi glucan (được đặc trưng bởi mức độpolymer hóa), tính kết tinh và trạng thái kết tinh của nó Tùy thuộc vào mỗi loài màtrạng thái kết tinh của cellulose khác nhau, từ đó xác định các tính chất vật lý của sảnphẩm như độ bền, độ hòa tan trong các dung môi, tính chịu ảnh hưởng của các tácnhân biến tính [15,16]

Bảng 1.1 Cấu trúc màng BC của một số vi khuẩn.

Acetobacter Achromobacter Aerobacter Agrobacterium Alcaligenes Pseudomonas Rhizobium Sarcina Zoogloea

Lớp màng ngoại bào tạo thành các dải

SợiSợiSợi ngắnSợiKhông có cấu trúc sợi rõ ràng

Sợi ngắnCellulose vô định hìnhChưa xác định

[13]

Acetobacter xylinum (A aceti ssp xylinum, A xylinus), là vi sinh vật tạo cellulose hữu hiệu nhất Gần đây, nó được xếp vào giống mới Gluconacetobacter bao gồm các loài là G xylinum, G europaeus, G oboediens và G intermedius.

1.2.1.2 Vi khuẩn Acetobacter xylinum

Chủng Acetobacter xylinum thuộc nhóm vi khuẩn acetic Theo khóa phân loại Bergey thì Acetobacter xylinum thuộc lớp Schizomycetes, bộ Pseudomonadales, họ Pseudomonadaceae.

a Đặc điểm hình thái

A xylinum là vi khuẩn hình que dài khoảng 2m, đứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi, không di động Là vi khuẩn Gram âm, vỏ nhầy được cấu tạo bởi cellulose A xylinum thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, nên chúng tăng trưởng trên bề mặt

tiếp xúc giữa môi trường lỏng và môi trường không khí

b Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Điều kiện tối ưu để A xylinum sinh trưởng ở pH = 4-4,5, nhiệt độ từ 25-320C

Acid acetic là sản phẩm sinh ra trong quá trình hoạt động của A xylinum Nhưng khi

lượng acid tích lũy quá cao thì sẽ ức chế chúng

A xylinum hấp thụ đường glucose rất tốt từ môi trường nuôi cấy Trong tế bào

vi khuẩn, glucose sẽ kết hợp với acid béo tạo thành tiền chất nằm trên màng tế bào.Sau đó nó được thoát ra ngoài tế bào cùng với một loại enzyme Enzyme này có thể

polymer hóa thành cellulose A xylinum có thể sử dụng nhiều nguồn đường khác nhau

và tùy thuộc vào nguồn đường nào được sử dụng tốt nhất [16]

Bảng 1.2 Đặc điểm sinh hóa của A xylinum

ST

T

Đặc điểm sinh hóa của

1 Oxy hóa ethanol thành acid

acetic

Acid acetic tạo ra kết hợp vớiCaCO3 làm vòng sáng rộng hơnvà tạo lớp cặn, đục rõ

+

4 Chuyển hóa glucose thành acid Vòng sáng sung quanh khuẩn

5 Chuyển hóa glycerol thành

dihydroxyaceton

Vòng CuO xuất hiện xungquanh khuẩn lạc +

6 Kiểm tra sinh sắc tố nâu Không thấy sắc tố nâu

-7 Kiểm tra tổng hợp cellulose Váng vi khuẩn xuất hiện màu

1.2.2.2 Cấu trúc màng BC:

Cellulose là một polymer không phân nhánh của các liên kết -1,4glucopyranose Các nghiên cứu cho thấy BC có cấu trúc hóa học giống với cấu trúccủa cellulose thực vật Tuy nhiên, cấu trúc đa phân tử và thuộc tính của cellulose vikhuẩn khác với cellulose thực vật Các chuỗi mới sinh của BC tập hợp lại hình thànhnên các siêu sợi có độ rộng khoảng 1.5nm Các siêu sợi này lại hình thành nên các visợi (Jonas and Farab, 1998), sau đó chúng được bó lại và hình thành nên các ribbon(Yamanaka và cộng sự, 2000) Kích thước của các ribbon là 3-4 x 70-80 nm Các BCkhác nhau thường có độ polymer hóa khác nhau thường nằm trong khoảng 2000 đến

6000, trong một số trường hợp lên đến 16000 – 20000 Trong khi đó mức polymer hóatrung bình của thực vật thường nằm trong khoảng 13000 – 14000 [15, 16]

Cấu trúc của BC phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy Ở điều kiện nuôicấy tĩnh, vi khuẩn tổng hợp những miếng cellulose trên bề mặt nuôi cấy tĩnh, tại ranhgiới giữa bề mặt dịch lỏng và không khí giàu oxy Các miếng BC này được gọi là BCtrên môi trường tĩnh (S-BC) Các siêu sợi cellulose liên tục được tạo ra từ những lỗđược xếp dọc trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết lại thành các vi sợi, và bị đẩyxuống sâu hơn trong môi trường dinh dưỡng Các dải cellulose từ môi trường tĩnh tạonên các mặt phẳng song song, sợi S-BC kéo dài và chồng trên các sợi khác theo chiều

đan chéo nhau không có tổ chức, có vai trò chống đỡ cho quần thể tế bào Acetobacter xylinum Các sợi BC kế nhau được tạo ra từ môi trường tĩnh nối với nhau và bẻ nhánh

ít hơn các sợi BC được tạo ra từ môi trường lắc (A-BC) [16]

Hình 1.2 Màng BC hình thành trong môi trường nuôi cấy tĩnh [14].

Hình 1.3 Các viên BC hình thành trong môi trường khuấy [14].

Hai dạng kết tinh phổ biến của cellulose trong tự nhiên là I và II, được phânbiệt bởi các kỹ thuật phân tích bằng tia X, quang phổ và tia hồng ngoại Cellulose Iđược chuyển thành cellulose II, nhưng cellulose II thì không thể chuyển thànhcellulose I

Cellulose I được tổng hợp bởi đa số thực vật A xylinum ở trong môi trường tĩnh.

Các chuỗi  - 1,4 – glucan ở cellulose I được sắp xếp song song với nhau theo mộttrục Trong khi đó, các chuỗi  - 1,4 – glucan ở cellulose II thì xếp một cách ngẫunhiên, hầu như không song song và nối với nhau bởi một số lượng lớn cầu nốihydrogen, làm cho cellulose II có độ bền về nhiệt Rất ít tế bào Eukaryota tổng hợp

cellulose II A xylinum tổng hợp được cả hai loại cellulose I và II.

Trong phân tử cellulose I có sự xuất hiện của I và I, do được cấu tạo bởiglucose dạng  hay dạng  Dạng  bền về nhiệt động hơn Gluose dạng  hayglucose dạng  là hai dạng đồng phân không gian của nhau Hai dạng đồng phân nàychỉ khác nhau ở sự định hướng của nhóm hydroxyl Gai dạng này có ở các cellulose cónguồn gốc từ tảo, vi khuẩn, thực vật BC có dạng I nhiều hơn cellulose thực vật S-BCcó nhiều dạng I hơn A-BC Sự khác nhau về tỉ lệ I giữa hai loại S-BC và A-BC làm

phóng đại các chỉ số kết tinh, chỉ số I tỉ lệ thuận với kích cỡ kết tinh A-BC có chỉ sốkết tinh thấp hơn và kích cỡ kết tinh nhỏ hơn S-BC.

1.2.2.3 Tính chất hóa lý của màng S-BC:

Màng S-BC có thể tạo hình dạng phù hợp với thiết bị phản ứng sinh học Hìnhdạng, kích thước của sản phẩm BC rất đa dạng và có thể chủ động tạo ra kích thướcmong muốn S-BC có tính chất cơ lý bền và ổn định Độ chịu lực của BC khá dai, gầnbằng với độ chịu lực của nhôm Tính chất cơ lý bền và ổn định giúp BC có thể chịuđược sự tác động của môi trường như khuấy trộn hoặc các áp lực BC không tan trongmôi trường phản ứng Giá thể BC có độ trương nở tốt Độ trương nở giúp cho sựkhuếch tán của cơ chất, sản phẩm Môi trường trong và ngoài chất mang không có sựkhác biệt BC đã qua xử lý không gây tác động đến chất được hấp phụ Sau giai đoạnxử lý, BC chỉ là giá thể trơ về mặt hóa học, có độ trương nở tốt Màng BC có thể tái sửdụng nhiều lần trong ứng dụng làm chất mang, an toàn cho môi trường sống [15]

1.2.2.4 Chức năng sinh lý của cellulose đối với Acetobacter xylinum

Trong tự nhiên, phần lớn vi khuẩn tổng hợp polysaccharide ngoại bào đượcdùng như màng bao vòng quanh tế bào, màng BC là một ví dụ.Những tế bào vi khuẩnsinh tổng hợp cellulose được bẫy bên trong mạng lưới polymer Mạng lưới này là vậtchống đõ cho quần thể vi sinh vật luôn ở bề mặt tiếp giáp giữa môi trường lỏng vàkhông khí Hệ thống lưới polymer làm cho các tế bào có thể bám chặt trên bề mặt môitrường và làm tế bào thu nhận chất dinh dưỡng một cách dễ dàng hơn so với khi tế bào

ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới cellulose Nhờ vào tính dẻo và tính thấmnước của các lớp cellulose mà tế bào vi khuẩn kháng lại những thay đổi bất lợi trongmôi trường sống như giảm lượng nước, thay đổi pH, xuất hiện các chất độc và các vi

sinh vật gây bệnh Các vi khuẩn A.xyllinum có thể tăng trưởng và phát triển bên trong

lớp vỏ bao Ngoài ra, người ta còn nhận ra rằng cellulose bảo vệ tế bào vi khuẩn dưới

tác động của tia UV, khoảng 23% các tế bào vi khuẩn sinh acid acetic được bao bọcbởi màng BC có khả năng sống sót sau 1 giờ chiếu xạ tia UV Việc loại bỏ lớp màngbao này sẽ làm giảm bớt khả năng sống sót của chúng, chỉ còn 3% [15].

1.2.2.5 Con đường sinh tổng hợp BC.

Sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được điều hòa một cáchchuyên biệt và chính xác, liên quan đến một lượng lớn enzyme, các chất xúc tác vàprotein điều hòa Tiến trình này bao gồm sự sinh tổng hợp urdine diphosphoglucose(UDPGIc), tiền chất của cellulose, tiếp đến là sự polymer hóa glucose vào mỗi chuỗi

-1,4-glucan và sự kết hợp các sợi mới vào dải (ribbon), được hình thành từ hàngtrăm, thậm chí hàng ngàn sợi cellulose riêng lẻ

Trong quá trình sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn, UDPGIc được xem là tiềnchất của cellulose Đầu tiên glucose được phosphoryl hóa thành glucose-6-phosphate,phản ứng này được xúc tác bởi glucokinase, tiếp theo đó phản ứng isomer hóaglucose-6-phosphate thành glucose-1-phosphate được xúc tác bởi enzymephosphoglucomutase Sau đó, enzyme UDPGIc pyrophosphorylase xúc tác phản ứngchuyển glucose-1-phosphate thành UDP-glucose, tiền chất của cellulose Cuối cùng,UDP-glucose được chuyển thành cellulose nhờ xúc tác của enzyme cellulose sythase[15, 16]

Hình 1.4 Con đường sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum [1].

Lòng trắng

Dung dịch muối 12%

T 0 C = 65 0 C Thời gian: 24h

T 0 C = 80 0 C Thời gian: 10 - 15 phút

Màng BC hấp phụ nisin

Sơ đồ 1.1 Quy trình sản xuất lòng đỏ trứng vịt muối [4].

1.3.2 Tiêu chuẩn trứng vịt muối

Sản phẩm trứng vịt muối được đánh giá theo tiêu chuẩn 32TCN 30 – 67

1.3.2.1 Yêu cầu kỹ thuật

a Nguyên liệu chính và phụ:

Trứng: trứng tươi có hình bầu dục, vỏ trứng sạch không dính bẩn, có mùi hơitanh của trứng Chiều cao buồng khí không quá 9mm màng không bị rách Lòngtrắng, lòng đỏ còn tốt, chưa có hiện tượng gì hư hỏng

Muối: muối khô sạch, không có tạp chất

b Chỉ tiêu vi sinh vật: không được phép có vi sinh vật gây bệnh và không có hiệntượng hư hỏng do vi sinh vật gây ra

c Chỉ tiêu hóa lý: theo các yêu cầu ghi trong bảng 1

Bảng 1.3 Bảng chỉ tiêu hóa lý

Khối lượng quả không

Bảng 1.4 Bảng chỉ tiêu cảm quan

Tên chỉ

Mùi vị Trứng đã luộc chín có mùi hơi đậm mặn tự nhiên của trứng muối Không

được có mùi vị lạLòng đỏ Lòng đỏ nguyên vẹn, hình cầu, có màu vàng đỏ và rắn, không cho phép

bị vữa, bị ám đen, có những tia máu

[14]

1.4 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về ứng dụng bacteriocin và màng BC hấp phụ bacteriocin để bảo quản thực phẩm

1.4.1 Các nghiên cứu trong nước

Trần Thị Tưởng An (2006), bước đầu nghiên cứu sử dụng màng mỏng BC hấp

phụ bacteriocin của Lc lactis để bảo quản thịt sơ chế tối thiểu Kết quả có thể bảo

quản thịt tươi 3 ngày bằng màng mỏng BC hấp phụ dịch thô bacteriocin 200 AU/mlvẫn đảm bảo chất lượng thịt theo tiêu chuẩn TCVN 7046 : 2002[1]

Nguyễn Thị Mỹ Lệ (2009), đã khảo sát khả năng hấp phụ dịch bacteriocin vàomàng BC để bảo quản mực một nắng Kết quả có thể bảo quản mực mốt nắng 13ngày bằng màng BC hấp phụ dịch nisin tinh sạch 200 IU/ml vẫn đảm bảo chất lượngmực theo TCVN 5649:1992 và TCVN 5289:1992 Thời gian bảo quản mực một nắngđược kéo dài thêm 8 ngày so với mẫu đối chứng [7]

1.4.2 Các nghiên cứu ngoài nước

Siragusa và cs (1999) đã kết hợp nisin vào trong màng polyethylene dùng đểbao gói chân không thịt bò tươi Hoạt động của nisin trong màng bao giúp chống lại

Lactobacillus helveticus và B thermosphacta được cấy vào trên bề mặt mô của thịt.

Sau 20 ngày bảo quản ở nhiệt độ tủ lạnh thì mẫu được bao bọc bằng màng có chứa

nisin có mật độ B thermosphacta thấp hơn mẫu đối chứng (không có nisin) [33].

Scannel và cs (2000) đã tìm hiểu khả năng hấp phụ nisin và lacticicin 3147 vàomàng cellulose để bảo quản phomai và thịt jambon Đầu tiên, khi khảo sát khả nănghấp phụ của hai bacteriocin nói trên thì người ta nhận thấy rằng lacticicin 3147 khôngcó khả năng hấp phụ tốt vào màng, trong khi đó nisin lại có khả năng thấm vào màngrất tốt và có thể ổn định trong vòng 3 tháng trong điều kiện bảo quản ở nhiệt độ tủlạnh Người ta bao gói phomai và thịt jambon bằng phương pháp MAP và bảo quản ởnhiệt độ tủ lạnh đề làm mẫu đối chứng Đối với mẫu thí nghiệm, người ta thực hiệnbao gói với màng cellulose có hấp phụ nisin Sự kết hợp nisin với màng cellulose đã

làm giảm số lượng L innocula xuống còn 1.5 log10 CFU/g sau 12 ngày bảo quản (trongkhi số lượng ban đầu có trong mẫu là 2 – 4 x105 CFU/g Và số lượng tế bào S aureus

1.5 log10 CFU/g trong phomai và 2.8 log10 CFU/g trong phomai Nghiên cứu này càngcho thấy tính hiệu quả trong việc kết hợp bacteiocin trong màng bao thực phẩm đềkéo dài thời gian bảo quản [32]

Coma và cs (2001) đã hấp phụ nisin vào trong màng bao ăn được có nguồn gốctừ cellulose ( màng hydroxypropylmethylcellulose) Những khảo sát cho thấy màng có

thể chống lại sự phát triển của L innocua và S aureus, nhưng việc thêm vào chất phụ

gia để tăng khả năng thấm nước của màng là stearic acid sẽ làm giảm khả năng khángkhuẩn của nisin Nghiên cứu này đã đánh dấu khả năng ứng dụng nisin kết hợp màngbao ăn được vào lĩnh vực thực phẩm [19]

Hudaa Neetoo và cs (2007) đã nghiên cứu tiềm năng của nisin kết hợp vớimàng bao plastic sử dụng trong bảo quản cá hồi Nghiên cứu cho thấy khi ủ cá hồi vớimật độ ban đầu là 5 x 102 CFU/cm2 Listeria monocytogene đem ủ trong màng bao có

nisin với hoạt tính 2000IU/cm2 và bảo quản ở nhiệt độ 100C hay 40C Kết quả cho

thấy, mẫu ủ với nisin 2000IU/cm2 thì giảm đi 3,9 lần so với mẫu đối chứng (khôngchứa nisin) sau 56 ngày ủ ở 40C hay 49 ngày ở 100C Còn mẫu ủ với nisin 500IU/cm2

thì giảm 0.5 đến 1,7 lần sau 56 ngày ủ ở 40C hay 49 ngày ở 100C [24]

Young-Min Kim và cộng sự (2000) đã sử dụng hai loại bacteriocin là nisin vàlacticicin NK24 hấp phụ vào màng có mật độ polyethylene thấp kết hợp với 2%polyamide Các chất phụ gia cũng được thêm vào như sodium chloride, citric acid vàchất hoạt động bề mặt để làm tăng hiệu quả của việc hấp phụ và hoạt động kháng

khuẩn của bacteriocin trên màng Vi sinh vật chỉ thỉ được sử dụng là Micrococcus flavus ATCC 10240 Kết quả nghiên cứu cho thấy sự hấp phụ nisin vào màng bao hiệu

quả hơn lacticicin NK24 Hoạt động kháng khuẩn của màng bao hấp phụ bacteriocinkhông bị ảnh hưởng đơn lẻ bởi độ hấp phụ của bacteriocin, và bản chất tự nhiên bêntrong của dung dịch chống lại vi khuẩn là nhân tố quan trọng trong việc kiểm soát sựgia tăng của vi sinh vật Sự kết hợp của sodium chloride, citric acid và chất hoạt độngbề mặt không làm cải thiện khả năng hấp phụ của nisin vào màng và hoạt động khángkhuẩn của nisin trên màng [35]

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu

2.1.1 Giống vi sinh vật

- Vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm dùng làm chủng chỉ thị cho hoạt tính kháng

khuẩn của bacteriocin: Bacillus subtilis (PTN), Bacillus cereus (PTN), Salmonella typhimurium SA – 1.06, Escherichia coli ATCC 2592

- Vi khuẩn Acetobacter xylinum BC16 dùng để lên men thu nhận màng mỏng BC

được cung cấp từ Bộ sưu tập giống của Bộ môn Công nghệ Sinh học, trườngĐại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh

2.1.2 Môi trường nuôi cấy

MT 1: Môi trường giữ giống Acetobacter xylinum

- Nước dừa già 1lit

MT 2: Môi trường nhân giống và lên men BC

- Nước dừa già 1000ml

2.1.3 Vật liệu, hóa chất

HCl, NaOH, thuốc nhuộm xanh Methylene, thuốc nhuộm Gram

Bacteriocin với các nồng độ 100, 200, 300 và 500 IU/ml từ chế phẩm Nisaplin

có nguồn gốc từ Lactococcus lactis.

2.1.4 Thiết bị và dụng cụ

- Tủ cấy vô trùng, tủ ấm, tủ sấy, nồi hấp tiệt trùng, máy lắc nhiệt độ thấp, máylắc tròn, lò viba, bếp điện, đĩa nhựa

- Thiết bị phân tích: kính hiển vi, cân kỹ thuật, cân phân tích, pH kế

- Dụng cụ thủy tinh dùng trong phân tích: erlen, becher, đĩa Petri, ống nghiệm,bình định mức

2.2 Nội dung thí nghiệm

Các bước tiến hành thí nghiệm được thể hiện ở sơ đồ 2.1

Sơ đồ 2.1 Nội dung các bước thí nghiệm của đề tài.

2.3 Phương pháp thí nghiệm

2.3.1 Khảo sát khả năng tạo màng mỏng BC bằng phương pháp lên men truyền

Màng BC hấp phụ dịch nisin ở điều kiện tối ưu

Bảo quản lòng đỏ trứng vịt muối

Phương pháp A:

Nhúng trứng vào nisin, bao bên ngoài 1 lớp PE

Phương pháp B:Bọc trứng màng

BC hấp phụ dịch nisin, bao ngoài lớp PE

Đánh giá chất lượng sản phẩm:

Vi sinhCảm quan

Phương pháp ĐC1:

Lòng đỏ trứng vịt

muối bao bên

ngoài 1 lớp PE

Sơ đồ 2.2 Các bước lên men thu nhận màng BC [23].

Giống được nhân giống cấp 1 ở điều kiện nhiệt độ thường trong 24 giờ với tỷ lệgiống là 20% Sau đó tiếp tục nhân giống cấp 2 ở điều kiện nhiệt độ phòng trong vòng

48 giờ với tỷ lệ giống 20% Tiếp theo, giống được lên men trong môi trường nhângiống để tạo màng BC

Để thu được lớp màng có bề dày mong muốn, thí nghiệm được thiết lập nhưsau: giống và môi trường nhân giống được trộn với nhau, sau đó đem đổ dịch giốngvào đĩa nhựa có kích thước đường kính là 10,5 cm với thể tích dịch giống là: 12ml,14ml, 16ml, 18ml, 20ml

2.3.2 Phương pháp xử lý màng BC trước khi hấp phụ

Màng BC sau khi thu được chứa một lượng lớn môi trường lên men và các sảnphẩm của quá trình trao đổi chất (acid acetic,…) Mục đích của đề tài là sử dụng màng

Giống

A.xylinum

Nhân giống cấp I

Nhân giống cấp II

Cấy giống:10-20%

giống

Lên men tĩnh 2ngày)

(1-Thu nhận BC thô