Đồ án Peptide hoạt tính sinh học

Đồ án Peptide hoạt tính sinh học

LỜI MỞ ĐẦU

eptit có hoạt tính sinh học (Bioactive peptide) là một lĩnh vật đang được nhiều nhà khoa học nghiên cứu Với những tính năng đặc biệt, peptit có hoạt tính sinh học được ứng dụng tất nhiều trong y học và thực phẩm

P

Được sự hướng dẫn nhiệt tình của cô Trần Bích Lam, em đã nghiên cứu đề tài Đồ án môn học “Tổng quan về Biopeptide” Với những cố gắng của bản thân và sự chỉ dẫn ân cần của cô, em đã hoàn thành nhiệm vụ được giao Tuy nhiên, đây là một đề tài còn mới mẻ, tài liệu tham khảo chưa nhiều nên còn nhiều thiếu sót Rất mong được sự đóng góp của thầy cô và các bạn để đề tài này thêm phần hoàn thiện

Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn cô Trần Bích Lam, quý thầy cô trong Bộ môn và các bạn rất nhiều

Chương 1:

GIỚI THIỆU

eptit là các phân tử sinh học được cấu trúc từ một vài cho đến hàng chục amino axit Nó là một dạng protein mạch ngắn có chứa ít hơn 50 amino axit Tuy nhiên, người ta vẫn gọi những phân tử sinh học chứa một lượng không lớn các amino axit là peptit Liên kết peptit là liên kết giữa đầu – COOH của amino axit này với đầu – NH2 của amino axit kế tiếp bằng việc loại đi một phân tử nước để tạo thành liên kết: – CO – NH –

P

Khi một số amino axit liên kết với nhau thông qua liên kết peptit thì tạo ra oligopeptit Khi có nhều amino axit nối với nhau thì tạo ra chuỗi polypeptit Một phân tử protein có thể có một, hai hay nhiều chuỗi polypeptit Trong phân tử protein ngoài

axit tham gia trong chuỗi peptit Chính sự khác nhau giữa các mạch bên R, khác về số lượng và loại amino axit trong peptit làm cho điểm đẳng điện, khối lượng khác nhau Về mặt hóa học, peptit tham gia các phản ứng đặc trưng của 2 nhóm – NH2 và – COOH Liên kết peptit có thể bị bẻ gãy hoàn toàn trong môi trường HCl 6N, ở nhiệt độ 1100C, trong 24 giờ hoặc ở trong dung dịch kiềm Trong điều kiện này, các amino axit được tách ra ở dạng tự do Đây là công đoạn không thể thiếu được trong phương pháp phân tích định lượng amino axit Để xác định trình tự các amino axit, người ta cần gắn hóa chất đánh dấu vào các đầu N và C của amino axit Thông thường người ta gắn chất dabsylchlorid vào đầu N của peptit Sau đó tiến hành thủy phân bằng HCl 6N

ở 1100C trong 24 giờ và tiến hành tách được riêng từng loại amino axit lần lượt theo thứ tự Kết quả thu được amino axit tự do tách ra và có chứa chất đánh dấu đã được gắn vào đầu N của nó

Các liên kết peptit còn bị cắt bởi các enzym protease Enzym protease có mặt ở các tế bào và mô làm nhiệm vụ phân giải các phân tử protein

Nhiều peptit có hoạt tính sinh học đặc biệt đang được sử dụng rộng rãi trong thực tiễn y học Peptide có hoạt tính sinh học (bioactive peptide/ biologically active peptide) là những peptide mà ngoài giá trị dinh dưỡng chúng còn có một số ảnh hưởng đặc biệt đến chức năng sinh lý của cơ thể Tính chất này được quy định bởi thành phần và thứ tự của các amino acid trong peptide Mellander (1950) là người đầu tiên đưa ra thuật ngữ peptide có hoạt tính sinh học khi ông nhận thấy các peptide bị phosphoryl hóa có nguồn gốc từ casein hoạt động như chất mang các chất khoáng Những nghiên cứu về peptide đã có những bước tiến đáng kể trong vài thập niên gần đây Những hiểu biết về tác dụng và cơ chế tác dụng của peptide đã làm cho nó ngày càng nhận được nhiều sự quan tâm đặc biệt trong lĩnh vực y dược Ngoài ra, peptide có hoạt tính sinh học còn được sử dụng trong các loại thực phẩm chức năng, nhất là các thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ sữa

Hình1.1: Aûnh hưởng của các peptide có hoạt tính sinh học lên cơ thể

Khả năng chữa bệnh của peptit là rất cao Đến bây giời trên thị trường đã có 9 sản phẩm sử dụng peptit và trên 100 công ty đang sản xuất ra nhiều sản phẩm peptit mới và đưa vào thử nghiệm

• Peptit – hoocmon tham gia vào các quá trình trao đổi chất, vận chuyển thông tin hóa học giữa các tế bào mô và các cơ quan

• Insulin là peptit – hoocmon điển hình, là phân tử khá lớn, có 51 amino axit tạo thành 2 chuỗi polypeptit nối với nhau bằng cầu disulfid (-S-S) Glucagon là một peptit – hoocmon bao gồm 29 amino axit được tổng hợp từ tuyến tụy, có tác động ngược với insulin

• Corticotropin là peptit – hoocmon bao gồm 39 amino axit, được tạo ra từ phần trước của tuyến yên, có vai trò kích thích hoạt động của vỏ tuyến thượng thận.Ngoài ra, còn có nhiều loại peptit mạch ngắn có phổ hoạt động rộng Ví dụ: loại peptit tổng hợp hóa học L Aspatyl phenylalanin methylester là chất ngọt hơn đường tói hàng trăm lần hiện đang được dùng rộng rãi trong công nghiệp và chế biến thực phẩm để thay thế đường Peptit mạch ngắn tự nhiên bao gồm 9 amino axit do vùng

Hóa học tổ hợp đã đóng góp rất nhiều cho vấn đề nghiên cứu các peptit có hoạt tính sinh học Tuy nhiên có một hạn chế rất lớn đối với những peptit có giá trị sinh học

vì nhu cầu cuộc sống đòi hỏi một số lượng lớn Và Primm đã giải quyết được vấn đề này: từ các peptit sinh học có nguồn gốc tự nhiên, bằng phương pháp sinh học và nhiều phương pháp khác, ông đã phát triển chúng với qui mô công nghiệp áp dụng trong các lĩnh vực như y dược, hóa học chuẩn đoán và thực phẩm nông nghiệp Bằng cách đó, các peptit tiếp tục được cải tiến để đạt được những tính chất tốt nhất dùng để chữa bệnh Lợi thế lớn khi dùng peptit cải tiến là do nó có giá trị sinh học rất cao và hạn chế được tính độc Bên cạnh đó chi phí tổng hợp cũng thấp hơn Primm đã đưa ra các bước lựa chọn như sau:

1) Phát hiện ra chuỗi nhỏ nhất gây ra ảnh hưởng sinh học bằng cách kiểm tra và tổng hợp từ đoạn bắt đầu của chuỗi peptit

2) Phát hiện ra cấu hình hoạt động sinh học bằng cách xác định cấu tạo và cấu trúc hoạt động liên quan

3) Sự sắp xếp của peptit chứa trong cấu hình đó bằng sự hỗ trợ của máy tính

4) Tổng hợp hóa học

5) Định giá giá trị sinh học và dược lý, sau đó lập lại bước 3 – 5

Primm đã khai thác từ những hiểu biết về peptit hóa học hiện tại để phát triển, sản xuất và bán độc quyền những peptit được áp dụng trong nhiều lĩnh vực chữa bệnh như tìm được phân tử peptit mới dùng chữa bệnh HIV hay sự phát triển các chất đối kháng neurokinin…

Hiện nay, người ta có thể thu nhận các peptide có hoạt tính sinh học bằng nhiều phương pháp: thủy phân protein (dùng enzyme trực tiếp hoặc thông qua quá trình lên men của vi sinh vật), tổng hợp hóa học, kỹ thuật gen

Gần đây, những cơ sở dữ liệu về trình tự của các amino acid trong peptide có hoạt tính sinh học ngày càng được phát triển, từ đó ta có thể xác định những peptide có hoạt tính sinh học tiềm ẩn trong protein Ngoài ra, do chúng ta đã biết được vị trí thủy phân của các enzyme thủy phân protein như pepsin, trypsin, chymotrypsin, do đó sự

giải phóng các peptide có hoạt tính sinh học trong quá trình thủy phân nói chung và

tiêu hóa nói riêng là có thể dự đoán được

Chương 2:

CÁC PEPTIDE CÓ HOẠT

TÍNH SINH HỌC TRONG THỰC PHẨM

phân loại dựa trên nguồn gốc thực phẩm Đối với các peptide có hoạt tính sinh học tìm thấy trong mỗi loại thực phẩm chúng ta sẽ nói về những tính chất của chúng Người ta thường thấy các peptide có hoạt tính sinh học có trong 2 nguồn thực phẩm là sữa và đậu nành.

2.1 SỮA

Mặc dù protein của các động vật và thực vật khác có chứa các peptide có hoạt tính sinh học tiềm ẩn (nằm trong protein), nhưng hiện nay protein từ sữa vẫn là nguồn cung cấp peptide có hoạt tính sinh học chính Sữa có nhiều chất có hoạt tính sinh học và có tác động có lợi nhiều mặt lên cơ thể Hầu hết protein của sữa có rất ít hoặc không có hoạt tính sinh học khi ở trạng thái ban đầu, tuy nhiên qua quá trình tiêu hóa hoặc thủy phân thì nó giải phóng ra rất nhiều peptide có hoạt tính sinh học

Protein trong sữa bò chiếm khoảng 2.9-5% khối lượng [11] Protein này bao gồm:

 Casein (75-85%), bao gồm:

 αS -casein (47-57%)

 β-casein (25-35%)

 κ-casein (8-15%)

 γ -casein (3-7%)

 Protein hòa tan (15-25%), thành phần bao gồm:

Tên protein Hàm lượng

(% tổng khối

Phân tử gồm

123 gốc axit amin

Là sản phẩm thủy phân từ β-casein

IgG1, IgG2IgAIgM

162.000,152.000400.000950.000

Phân tử gồm

542 gốc axit amin

Một số hình tiếp theo sẽ cho chúng ta biết thành phần và thứ tự của các amino acid có trong một vài loại protein có trong sữa Trong bài này, khi ta nói đến 1 đoạn peptide nào đó, ví dụ đoạn 60-62 của α 1-cn thì ta có thể nhìn vào hình 2.1 để biết đoạn peptide này có cấu tạo là Met-Glu-Ala, do đó để đơn giản, trong những phần sau

ta chỉ cần viết số thứ tự của peptide mà không cần viết công thức của peptide

Bảng 2.1: Thành phần amino acid của một số loại casein trong sữa (Swaisgood, 1982)

Bảng 2.2: Thành phần amino acid của một số protein hòa tan trong sữa

(Whitney và cộng sự, 1976)

Amino acid Số gốc amino acid trong Amino acid Số gốc amino acid trong

bị biến tính trước (ví dụ bằng nhiệt hay acid) [11]

Tuy nhiên casein lại chứa rất ít các amino acid chứa lưu huỳnh, điều này làm giảm đi giá trị sinh học của nó α 1 và β-casein không chứa cysteine hay cystine, trong khi đó α 2 và κ-casein chứa 2 gốc cysteine trong phân tử mà thông thường tồn tại dưới dạng cầu disulphide

Hình 2.1: Thứ tự amino acid trong α 1-casein sữa bò (Swaisgood, 1992)

Hình 2.2: Thứ tự amino acid trong α 2-casein sữa bò (Swaisgood, 1992)

Hình 2.3: Thứ tự amino acid trong β-casein sữa bò (Swaisgood, 1992)

Hình 2.4: Thứ tự amino acid trong κ-casein sữa bò (Swaisgood, 1992)

Về chức năng, người ta có thể chia peptide có hoạt tính sinh học từ sữa thành nhiều loại [10,16]:

 Peptide ảnh hưởng lên hệ thần kinh

 Peptide liên kết với khoáng

 Peptide điều hòa hệ miễn dịch

 Peptide ảnh hưởng đến hệ tuần hoàn

2.1.1 Các peptide ảnh hưởng lên hệ thần kinh

 Khái niệm

Cho đến nay vẫn chưa có một định nghĩa chính xác về các peptide ảnh hưởng lên hệ thần kinh (neuropeptide – NP) Người ta gọi tên các peptide này chủ yếu là dựa vào kết quả những quan sát về ảnh hưởng của nó lên các hoạt động sinh lý của cơ thể (tên gọi có tính chất lịch sử) hơn là do những hiểu biết chi tiết về cơ chế tác động của chúng Ví dụ, trong một thời gian khá dài, người ta biết CCK (cholecytokinin) như là hormon ở hệ tiêu hóa, nhưng đến năm 1975 người ta lại phát hiện nó có trong não của chuột, tác động đến hệ thần kinh chuột [24]

Những NP có tính chất tương tự như morphin (như làm giảm đau, dễ ngủ) được gọi là “opioid peptide / opiate peptide – OP” Các OP có nguồn gốc từ protein thực phẩm được gọi là “exorphin” Các OP có nguồn gốc từ casein được gọi là “casomorphin”; tương tự, OP có nguồn gốc từ β -casein gọi là β-casomorphin, đây là một trong những

OP từ sữa đầu tiên được phát hiện(Smacchi 1998), từ α -LA gọi là α -lactorphin, từ serum albumin gọi là serorphin [10,18]

Tuy nhiên, người ta cũng tìm thấy trong protein sữa một số peptide có tính chất ngược lại (đối với hệ thần kinh) với các OP trên; những peptide này có từ sự thủy phân 1

α -casein vàκ-casein và được gọi là “casoxin”, nó ảnh hưởng lên chất thụ cảm loại

µ và κ, nhưng khả năng ức chế của chúng thì kém hơn naloxone [10,18]

 Tính chất

Trong các exorphin thường có gốc tyrosine ở đầu N và có các gốc amino acid chứa vòng thơm (như tyrosine và phenylalanine) ở vị trí thứ 3 hoặc thứ 4 (đối với α -casein và 1 vài κ-cn thì có 1 gốc arginine đứng trước tyrosine ở đầu N), cấu trúc này giúp cho peptide kết hợp tốt với các cơ quan thụ cảm (receptor) Ví dụ [10,4]:

 β-casomorphin: peptide đoạn 60-69 trong β-cn Ile-His-Asn-Ser-OH) kích thích cơ quan thụ cảm kiểu µ (µ -type receptor) (có tác dụng đối với các biểu hiện cảm xúc, mất cảm giác đau, hạn chế vận động của ruột và hệ hô hấp)

(Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro- α -casomorphin: peptide đoạn 90-96 trong α 1-cn Leu-Glu-OH) có tính chất kích thích cơ quan thụ cảm kiểu δ (có tác dụng đối với các biểu hiện cảm xúc và sự mất cảm giác đau) Ngoài ra còn có các đoạn khác như 90-95, 91-96

(Arg-Tyr-Leu-Gly-Tyr- α -lactorphin: đoạn 50-53 của α-LA (Tyr-Gly-Leu-Phe-OH) có tính chất kích thích cơ quan thụ cảm kiểu µ Các OP này có tác dụng điều hòa các hành vi cư xử, làm gia tăng hiện tượng mất cảm giác đau, kéo dài thời gian vận chuyển của thức ăn trong ruột, gia tăng sự hấp thụ các amino acid, chất

điện ly và nước; kích thích tiết insulin và somastotatin (Meisel 1997b; Xu 1998).

 β-lactorphin: đoạn 102-105 của β-LG (Tyr-Leu-Leu-Phe-OH) có tính chất kích thích cơ quan thụ cảm kiểu µ Tính chất tương tự α-lactorphin

 Casoxin: các đoạn peptide từ 25-34, 35-41, 57-60 và 58-61 của κ-cn

Khi được đưa vào máu, những peptide này có thể đi tới não hay các cơ quan khác và thể hiện những tính chất tương tự như thuốc phiện hoặc morphine Đó có thể là lý

do khiến cho những đứa trẻ sơ sinh trở nên dễ ngủ sau khi uống sữa

Người ta đã làm thí nghiệm với các con bê sơ sinh cho thấy β-casomorphin được vận chuyển nguyên vẹn qua thành ruột vào máu, sau đó nó gây ảnh hưởng lên hệ thần kinh gây nên hiện tượng buồn ngủ và trầm tĩnh (Clare 2000)

2.1.2 Các peptide liên kết với khoáng

Phospho trong sữa có khoảng 900mg/lít, có thể phân thành các loại [11]:

 Vô cơ: phosphate hòa tan và ở dạng dung dịch keo

 Hữu cơ: trong phospholipid, casein và đường phosphate, nucleotide

Casein chứa khoảng 0.85% phospho; trong đó α 1, β và κ-cn chứa tương ứng là 1.1, 0.6, 0.16% phospho Nếu tính theo mol thì α 1, α 2, β và κ-cn chứa tương ứng 8(9), 10-13, 5(4), và 1(2,3) mol phospho trong 1 mol phân tử protein

Phospho có vai trò rất quan trọng trong sữa[11]:

 Về mặt dinh dưỡng, nó có thể kết hợp với các chất khoáng như Ca2+, Zn2+…

 Làm tăng tính hòa tan của casein

 Làm tăng tính bền nhiệt cho casein

 Có ảnh hưởng tới quá trình đông tụ để sản xuất phô mai

Ơû đây chúng ta quan tâm đến khả năng liên kết với khoáng của phospho trong sữa

Phospho liên kết hóa trị với protein khá bền vững Liên kết này chỉ bị phá vỡ khi có chế độ xử lý nhiệt cao, pH cao và sử dụng phosphatase Phosphate chủ yếu tạo liên kết ester với serine (và một ít với threonine) tạo monoester:

Từ thứ tự các amino acid trong phân tử protein (casein) và từ các thí nghiệm thực tế, người ta nhận thấy hầu hết CPP (calcium-binding phosphopeptides) có chứa 3 nhóm serine phosphate và theo sau bởi 2 gốc glutamic (Ser-Ser-Ser-Glu-Glu) [10, 11, 25, 30] CPP là 1 trong những chất bền vững nhất đối với sự thủy phân của enzyme trong ruột, và hầu hết nó được tìm thấy dưới dạng phức với canxi phosphate [10] Sự kết hợp với Ca2+ tạo nên khả năng hòa tan cao hơn và do đó Ca2+ dễ dàng được hấp thu hơn Từ đó, CPP có thể có tác dụng có ích cho việc giúp xương cứng chắc Ngoài ra, CPP cũng giúp làm giảm hiện tượng sâu răng thông qua việc tái tạo canxi cho men răng và ức chế sự bám dính của các vi khuẩn hình thành bựa răng Do có tính chất này, chúng được ứng dụng để điều trị các bệnh về răng và được cho vào trong kem đánh răng (Darragh 2002).

2.1.3 Các peptide ảnh hưởng lên hệ miễn dịch của cơ thể

Cho đến nay thì người ta vẫn chưa hiểu rõ ràng cơ chế làm cho các peptide có ảnh

hưởng lên hệ miễn dịch của cơ thể (immunopeptide-IP) Một số peptide từ sữa có thể

ảnh hưởng đến cả hệ miễn dịch và sự sinh sản của tế bào

Bảng 2.3 Một số peptide ảnh hưởng lên hệ miễn dịch của cơ thể có trong sữa

IgA và giảm kích thước các khối u dưới da (Leblanc 2002) Một số IP từ sữa cũng có khả năng làm giảm sự nhiễm trùng ở các bệnh nhân giai đoạn đầu của bệnh AIDS

Trong nhóm peptide này, ta có thể nói đến một số peptide có khả năng kháng khuẩn Casecidin là một trong những peptide đầu thuộc loại này mà người ta đã phát hiện được (có được khi cho thủy phân casein bởi chymosin ở pH trung tính, là thành phần của α 1-cn và κ-cn, có phân tử lượng khoảng 4000-6000 Da) Peptide này có khả

năng ức chế một số vi khuẩn Gram (+) như Staphylococcus, Sarcina, Bacillus subtilis,

Diplococcuspneumoniae, và Streptococcus pyogenes [10] Peptide casocidin-I (đoạn

165-203 của α 2-cn) có khả năng ức chế Staphylococcus carnosus và E.coli Peptide

isracidin (đoạn 1-23 của α 1-cn có được nhờ thủy phân bởi chymosin và chymotrypsin)

có khả năng ức chế Staphylococcus aureus và Candida albicans [10].

2.1.3 Các peptide ảnh hưởng lên hệ tuần hoàn

Trong loại peptide này, người ta thường quan tâm đến các peptide có khả năng làm giảm huyết áp do hiện nay có rất nhiều người mắc bệnh cao huyết áp

Angiotensin I converting enzyme (ACE- peptidyldipeptide hydrolase, EC 3.4.15.1) có liên quan đến hệ rennin-angiotensin, có liên quan đến huyết áp và cũng liên quan đến cân bằng muối và nước ACE chuyển angiotensin I thành angiotensin II (một chất

có khả năng làm co mạch máu (vasoconstrictor)), đồng thời phân hủy bradykinin (một chất có khả năng làm giãn mạch máu (vasodilator)) Chính vì vậy việc ức chế enzyme

này sẽ dẫn đến việc chống lại hiện tượng cao huyết áp

Hình 2.5: Hệ renin-angiotensin, sự tương tác giữa các peptide có hoạt tính sinh học

với các cơ quan thụ cảm và những ảnh hưởng.

ACE hoạt động như một dipeptidyl carboxypeptidase, nó loại dipeptide từ đầu C của cơ chất (có đầu C tự do) Nó ưu tiên kết hợp đối với cơ chất có các amino acid kị nước ở 3 vị trí cuối, và có 1 ít ái lực đối với cơ chất có amino acid có 2 nhóm carboxy ở đầu C (Glu, Asp) hoặc có Proline ở vị trí áp chót

Hình 2.6: Mô hình tâm hoạt động của ACE và tương tác của nó với cơ chất peptide

(Bunning, 1987)

Chất ức chế ACE đầu tiên được phát hiện trong nọc rắn Bothrops jararaca vào

năm 1970 Trong nọc rắn này có các peptide ức chế ACE có từ 5-13 gốc amino acid trong phân tử, trong số đó có peptide Glu-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln-Ile-Pro-Pro là có hoạt

tính cao nhất in vivo Một peptide khác là bradykinin-potentiating peptide 5a (BPP5a) Glu-Lys-Trp-Ala-Pro có thứ tự 3 amino acid cuối ở đầu C rất phù hợp cho việc kết hợp

với tâm hoạt động của ACE, tuy nhiên peptide này lại dễ bị phân hủy trong điều kiện in

vivo Do đó, người ta đã thay thế gốc Trp trong phân tử bằng gốc Phe để có được phân

tử bền hơn nhưng vẫn có hoạt tính ức chế ACE mạnh Và cũng từ đó, hầu hết các thuốc ức chế ACE được sử dụng đều có cấu trúc tương tự hay liên quan đến tripeptide Phe-Ala-Pro

Hình 2.7: Giả thuyết về sự tương tác của peptide với tâm hoạt động của ACE

Hình 2.8: Giả thuyết về sự tương tác của Captopril với tâm hoạt động của ACE

Hình 2.9: Giả thuyết về sự tương tác của Enalaprilat với tâm hoạt động của ACE

Hai hình trên cho thấy 2 loại thuốc ức chế ACE có cấu trúc tương tự như peptide Ala-Pro và Phe-Ala-Pro Captopril tương tự như Ala-Pro, trong đó Alanin ứng với peptide được thay thế bởi nhóm có –HS (sulfhydryl) có khả năng tương tác mạnh hơn ion Zn2+ trong enzyme Còn đối với Enalaprilat thì tương tự như Phe-Ala-Pro nhưng Enalaprilat liên kết mạnh hơn với ACE nhờ nhóm carboxyl so với nhóm carbonyl trong

nhau So với các peptide đi từ casein thì các peptide đi từ huyết thanh sữa ít được nghiên cứu hơn.

 Tính chất:

Như trên đã nói, peptide ức chế ACE thường có 3 amino acid kị nước ở vị trí cuối và nhất là gốc amino acid cuối cùng(đầu C) Gốc amino acid cuối cùng ở đầu C thường là Pro, tuy nhiên nó cũng có thể là Lys hoặc Arg, 2 amino acid này (ưa nước) tích điện dương ở nhóm ε -amino Người ta nhận thấy có mối liên hệ giữa cấu trúc của peptide với khả năng ức chế ACE là hoạt tính ức chế ACE của dipeptide có Pro ở đầu C thì cao hơn so với khi đầu C là Tyr, và Tyr > Phe Khi được đưa vào cơ thể thì peptide có Tyr ở đầu C có tác động chậm hơn nhưng kéo dài hơn so với peptide có Phe ở đầu C (Suetsuna, 1998) Việc có các amino acid kị nước trong phân tử và nhất là protein làm cho các peptide này có khả năng chống lại sự thủy phân tốt hơn Trp-Ala-Pro là peptide có cấu trúc thích hợp nhất cho việc kết hợp với tâm hoạt động của ACE

Bảng 2.4: Một số peptide có tác dụng làm giảm huyết áp đã được nghiên cứu in vivo

Thủy phân α 1-casein bằng

trypsin

Các sản phẩm thủy phân Sekiya et al (1992)

Val-Pro-Pro /Ile-Val-Pro-Pro-Val-Pro-Pro

Hata et al (1996)

Bảng 2.5: Aûnh hưởng ức chế ACE và giảm huyết áp của một số peptide thu nhận từ

quá trình thủy phân whey protein bởi một số enzyme

1411 protein Thành phần protein chủ yếu là β- conglycinin và glycinin, chiếm từ 65%

- 80% tổng lượng protein Ngoài ra cũng có nhiều loại enzyme trong đậu nành (lipoxygenase, chalcone synthase, catalase, urease) tuy nhiên nó chỉ chiếm một lượng nhỏ khoảng 1%

Bảng 2.6: Một vài protein trong đậu nành

Cytochrome C

β-amylase

LipoxygenaseHemagglutininesGlobulin

β-conglycinine

1200062000102000110000140000175000

Glycinin (gồm 6 tiểu phần) không chứa carbohydrate, trong khi đó β- conglycinin (gồm 6 tiểu phần) là một glycoprotein có chứa khoảng 4-5% carbohydrate (chủ yếu là mannose và N-acetyl-D-glucosamine) Một số protein khác cũng có thể bị phosphoryl hóa và/hoặc glycosyl hóa [30]

Protein đậu nành chứa 11 amino acid cần thiết cho cơ thể, nhưng nó lại ít amino acid chứa lưu huỳnh (nhất là Met) [19]

Trong các sản phẩm thủy phân của đậu nành hoặc trong thực phẩm từ đậu nành lên men thì protein chỉ bị thủy phân một phần, bởi vì các protease không thể phá vỡ glycoprotein, phosphoprotein, những protein bị biến đổi sau khi dịch mã Để thu được nhiều peptide, một số thí nghiệm đã sử dụng alkaline phosphatase và endoglycosidase để xử lý trước, sau đó mới dùng protease để thủy phân Trong các thí nghiệm của mình, Astwood, Leach và Fuchs (1996) đã nhận thấy β- conglycinin khá bền với sự thủy phân bằng acid và trypsin Việc dephosphoryl hóa và deglycosyl hóa trước khi thủy phân protein sẽ giúp quá trình thủy phân xảy ra thuận lợi hơn, đặc biệt là đối với β- conglycinin Một số glycosidase được sử dụng như: N-glycanase, O-glycanase, a-mannosidase và endoglycosidase H Glycinin là tiền chất của hầu hết các peptide mà người ta tách được; trong khi đó, β- conglycinin thì chỉ bị thủy phân một phần thậm chí ngay cả khi nó đã được loại bỏ 4% những vùng bị glycosyl hóa

chống tăng huyết ápdipdptidyl-aminopeptidase IV inhibitorđiều hòa hệ miễn dịch

liên quan đến hệ thần kinhchống oxi hóa

chống đông máu, chống lại chứng hay quên

: có tác dụng khác (ức chế, liên kết, điều hòa…)

Bảng 2.7: Ví dụ về một số peptide có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ đậu nành

pepsin, papain, và chymotrypsin và 1 số proteases:

alcalase, Protamex, và Flavourzyme

Mức độ thủy phân SPI từ 1.7% đến 20.6%

Chống oxi hóa Cả thành phần thủy phân và chưa được thủy phân làm giảm thiobarbituric acid (từ 28-65%), trừ mẫu được thủy phân bằng papain Mẫu được thủy phân bằng chymotripsin và flavourzyme (0.5 giờ) có tính ức chế quá trình oxi hóa lipid mạnh nhất.

Pena-Ramos Và Xiong 2002

Các peptide có phân tử lượng khác nhau được tách bởi quá trình siêu lọc

Tăng sự hấp thu và phân giải low-density

lipoproteins bởi “HepG2 cell receptors”

Arnoldi 2001

tách bởi siêu lọc

Kích thích sự phát triển (thí nghiệm với chuột)

Franek 2000

X-Met-Leu-Pro-Ser- Ser-Pro-Tyr

tách nhờ nhựa trao đổi cation

2000

Tyr-Val-Val-Phe-Lys (2) Pro-Asn-Asn-Lys-

2002

Nguồn gốc Cách thu nhận Peptide Hoạt tính Tham khảo

Pro-Phe-Gln (3) Asn-Trp-Gly-Pro- Leu-Val

(4) Val-Pro-Tyr-Trp-Thr (5) Thr-Pro-Arg-Val- Phe.

hiện thí nghiệm in vitro

cao huyết áp

Korhonen 2003

Sản phẩm đậu dạng paste

được lên men của Hàn

2.2.1 Peptide ảnh hưởng đến hệ tuần hoàn

2.2.2 Peptide có tính chất chống oxi hóa

Một vài amino acid như Tyr, Met, His, Lys và Trp có tính chất chống oxi hóa Các tripeptide có chứa Tyr hoặc Trp ở đầu C thì có hoạt tính dập tắt các gốc tự do rất mạnh, trong khi đó, hoạt tính dập tắt peroxynitrite thì yếu Người ta nhận thấy các peptide có tính chất chống oxi hóa có thể kết hợp với các chất chống oxi hóa khác, ví dụ các hợp chất phenol, làm tăng mạnh khả năng chống oxi hóa Quá trình xử lý nhiệt không làm ảnh hưởng đến tính chất chống oxi hóa của các peptide, điều đó cho thấy thành phần cấu tạo của peptide thì quan trọng hơn so với hình dạng của nó (trong việc chống oxi

hóa) (Matoba 2002) Các peptide chứa His được cho là có thể hoạt động như là

metal-ion chelator, có khả năng dập tắt các oxi hoạt động và các gốc hydro tự do từ đó dẫn

tới khả năng chống oxi hóa của peptide

2.2.3 Peptide chống ung thư

Bằng chứng về mối quan hệ giữa các peptide/protein của đậu nành và khả năng chống ung thì chưa được rõ ràng Brit và cộng sự (2001) đã kết luận rằng flavone và isoflavonone trong đậu nành có tính chất chống ung thư, tuy nhiên cần phải có những nghiên cứu sau nữa để làm sáng tỏ bản chất của sự tương tác của những thành phần này với peptide/protein đến khả năng chống ung thư

Hoạt tính chống ung thư của protein đậu nành đã được đề cập đến từ những năm

1990 Ví dụ, trypsin inhibitor đã được cho là có khả năng ức chế tế bào ung thư ovarian (Kobayashi 2004) Và có nhiều khả năng hoạt tính chống ung thư của đậu nành có được từ các peptide của nó Ví dụ, các peptide có được từ sự thủy phân protein đậu nành đã tách béo, thủy phân bằng thermolase, sau đó được tinh sạch bằng ethanol và sắc ký lọc gel, cho thấy giá trị IC50 0.16mg/ml in vitro (thí nghiệm trên chuột) Ơû nồng

độ 1 mg/ml nó có ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và sinh sản của tế bào nhờ khả năng giữ tế bào trong pha G2/M

Lunasin là một peptide có từ phần 2S albumin của đậu nành Nó có chứa 43 amino acid, có đuôi là 9 gốc aspartic, nó có khả năng bám dính vào tế bào Lunasin có khả năng bám dính vào non-acetylated H3 và H4 histone và ngăn cản chúng acetyl

hóa Người ta tin rằng chính cơ chế này làm cho nó có khả năng chống ung thư (de Lumen 2005).

2.2.4 Peptide điều hòa hệ miễn dịch

Một peptide (MITLAIPVNKPGR) có hoạt tính kích thích hoạt động của các bạch cầu Peptide này được tách ra từ quá trình thủy phân protein đậu nành bằng trypsin Nó có nguồn gốc từ phần α' của β-conglycinin Methionine ở đầu N của peptide cần thiết cho hoạt tính của nó, trong khi đó, amino acid thứ 3 kể từ đầu N lại có ảnh hưởng đến hoạt tính của peptide (Thr < Phe < Trp) Đối với phần β của β-conglycinin thì amino acid đầu tiên là Ile, amino acid thứ 3 là Lys thì người ta không nhận thấy hoạt tính của peptide có nguồn gốc từ nó Qua quá trình đột biến, người ta đã thay thế amino acid thứ nhất của phần β này bằng Met và amino acid thứ 3 bằng Thr / Phe / Trp, từ đó người ta nhận thấy peptide thu được có hoạt tính kích thích hoạt động của bạch cầu (Maruyama 2003)

[30]

Một số peptide có tính chất chống oxi hóa, chống lại sự oxi hóa các acid béo chưa

no Chúng làm mất các gốc tự do, kết hợp tạo phức với ion kim loại mà có khả năng xúc tác cho sự oxi hóa Tyrosine và histidine rất dễ bị ảnh hưởng bởi sự oxi hóa, nó có rất nhiều trong thành phần của các peptide từ đậu nành Methionine, lysine và tryptophan cũng có tính chất tương tự Khả năng chống oxi hóa của peptide được gia tăng khi có mặt gốc proline trong phân tử, nó là tăng khả năng tương tác với các acid béo chưa no (Dziuba 1999a)

2.3 CÁC THỰC PHẨM KHÁC

Bảng 2.8: Các peptide có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ một số thực phẩm

Rubiscolin-5 YPLDL, Rubiscolin-6 YPLDLF

GEA5 thể hiện hoạt tính δ - opiois cao hơn GEA4 GEB5 >

VK, FY, YQY, PSY

Met-Tyr-Pro-Điều hòa hệ thần kinh

Kitts và Weiler 2003

Leu-Lys-Pro

Chống cao huyết áp

Korhonen và Pihlanto 2003 Protein cá

mòi

Bacillus licheniformis alkaline protease

The ethanol fraction obtained with a

chromatographic

Ưùc chế ACE, IC 50

Nguồn gốc Cách thu nhận Peptide Hoạt tính Tham khảo

resin Ovalbumin

của trứng

gà

*Chymotrypsin và trypsin

* Pepsin

* RADHPF (đoạn 359-364 của ovalbumin)

* FRADHPFL

Điều hòa việc co dãn mạch máu.

Các sản phẩm sau thủy phân

Ưùc chế ACE, IC 50

Bảng 2.9: Một vài peptide có hoạt tính ức chế ACE [14]

M)

Giảm SBP (mmHg ở

GPPGAZ

Nakano,2000.

Matsui et al., 2000

Yoshikawa,1999 Hemoglobin

máu heo

2001;2002.

Cyclo (His-Pro) (CHP) là 1 dipeptide mạch vòng có nhiều chức năng sinh học Như nhiều di-tripeptide khác, CHP có thể được hấp thụ trong ruột non khi vào cơ thể

CHP-LI ( cyclo (His-Pro)-like immunoreactivity) đã được tìm thấy trong 1 số thực phẩm.

Bảng 2.10: CHP-LI trong một số thực phẩm

Loại thực phẩm CHP-LI (pmol/g

thực phẩm) Protein (g) Hàm lượng /100gChất béo (g) Glucid (g)

Một vài peptide có khả năng làm co cơ trơn, việc này được phát hiện khi người ta

nghiên cứu in vitro khi sử dụng 1 đoạn ruột hồi Ví dụ: albutensin A từ serum albumin

sữa bò, β-lactotensin từ β -lactoglobulin và oryzatensin từ gạo [14]

Một số peptide có khả năng ức chế các enzyme, ví dụ prolyl endopeptidase mà có ảnh hưỡng đến chứng hay quên (Dziuba 1999a), và amio- và endopeptidase của vi

khuẩn lactic và Pseudomonas fluorescens ( Smacchi 1998).

CÁC PHƯƠNG PHÁP

THU NHẬN PEPTIDE

CÓ HOẠT TÍNH

SINH HỌC

eptide có hoạt tính sinh học có nhiều ứng dụng trong thực phẩm và dược phẩm Người ta có thể thu nhận được các peptide này bằng nhiều phương pháp khác nhau, mỗi phương pháp có những ưu, nhược điểm riêng và phù hợp cho từng loại

peptide

P

3.1 PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP HÓA HỌC

Liên kết peptide được hình thành từ sự kết hợp giữa nhóm carboxy của amino acid thứ nhất với nhóm amino của amino acid thứ hai và loại đi một phân tử nước

Sự hình thành liên kết peptide dưới điều kiện ôn hòa chỉ có thể xảy ra khi nhóm carboxy của amino acid được hoạt hóa; đồng thời, amino acid còn lại tấn công vào

nhóm carboxy này (theo cơ chế ái nhân) và từ đó hình thành dipeptide

Khác với nhiều loại hợp chất hữu cơ khác, các phản ứng tổng hợp (điều chế) peptide rất phức tạp Không thể tổng hợp được peptide mong muốn nhờ phản ứng trùng ngưng các phân tử aminoacid khác nhau vì sẽ tạo ra hỗn hợp các peptide Ví dụ trường hợp đơn giản nhất là ngưng tụ 2 phân tử amino acid sẽ tạo ra tới 4 dipeptide:

Gly + Ala →−H O2 Gly-Gly

Gly + Ala →−H O2 Ala-Ala

Gly + Ala →−H O2 Gly-Ala

Gly + Ala →−H O2 Ala-Gly

Do vậy để tổng hợp một peptide có trật tự xác định các đơn vị amino acid trong phân tử thì cần phải “bảo vệ” nhóm amino hay nhóm carboxyl nào đó khi không cần chúng tham gia phản ứng tạo ra liên kết peptide

Do đó, quá trình tổng hợp peptide thì cần phải trải qua 3 bước:

 Bước 1: Bảo vệ nhóm amino hay carboxy nào đó mà chúng không cần tham gia phản ứng tạo liên kết peptide

 Bước 2: Hình thành liên kết peptide Gồm 2 bước nhỏ:

 Bước 3: Tách rời các nhóm bảo vệ (một phần hoặc toàn bộ) Mặc dù cần phải tách các nhóm này sau khi toàn bộ chuỗi peptide được hình thành, nhưng người

ta thường tách chọn lọc trong quá trình tổng hợp để có thể tiếp tục quá trình trùng ngưng

Nhóm bảo vệ cần phải thỏa mãn một số tiêu chuẩn sau:

 Dễ gắn vào phân tử amino acid

 Bảo vệ được nhóm chức trong điều kiện hình thành các liên kết peptide

 Trong quá trình thực hiện không xảy ra hiện tượng racemic hóa

 Dễ loại ra mà không ảnh hưởng đến sự tồn tại của các liên kết peptide và các nhóm bảo vệ bán vĩnh viễn

3.1.1 Bảo vệ nhóm amino

Nhóm amino thường được bảo vệ bởi nhóm benzyloxicarbonyl (C6H5–CH2–COO–còn gọi là carbobenzoxi) bằng cách cho aminoacid phản ứng với benzyl clofomiat (C6H5 – CH2 – COO – Cl, carbobenzoxi clorua) trong dung dịch kiềm

Sau khi tổng hợp được peptide, nhóm bảo vệ sẽ được loại ra khỏi phân tử peptide nhờ phản ứng hydro phân

Bảng 3.1: Ví dụ về một số nhóm có tác dụng bảo vệ nhóm Nα -amino

3.1.2 Bảo vệ nhóm carboxyl

Nhóm carboxyl thường được bảo vệ bằng cách chuyển thành metyl hay etyl hoặc benzyl este Nhóm este dễ thủy phân hơn nhóm peptide nên được loại ra khỏi phân tử peptide bằng cách thủy phân bởi dung dịch kiềm

Riêng nhóm benzyloxi (C6H5 – CH2O –) còn được loại nhờ phản ứng hydro phân

Bảng 3.2: Ví dụ về một số nhóm có tác dụng bảo vệ nhóm Cα -carboxy