2.2.2 Peptide cĩ tính chất chống oxi hĩa
Một vài amino acid như Tyr, Met, His, Lys và Trp cĩ tính chất chống oxi hĩa. Các tripeptide cĩ chứa Tyr hoặc Trp ở đầu C thì cĩ hoạt tính dập tắt các gốc tự do rất mạnh, trong khi đĩ, hoạt tính dập tắt peroxynitrite thì yếu. Người ta nhận thấy các peptide cĩ tính chất chống oxi hĩa cĩ thể kết hợp với các chất chống oxi hĩa khác, ví dụ các hợp chất phenol, làm tăng mạnh khả năng chống oxi hĩa. Quá trình xử lý nhiệt khơng làm ảnh hưởng đến tính chất chống oxi hĩa của các peptide, điều đĩ cho thấy thành phần cấu tạo của peptide thì quan trọng hơn so với hình dạng của nĩ (trong việc chống oxi hĩa) (Matoba 2002). Các peptide chứa His được cho là cĩ thể hoạt động như là metal- ion chelator, cĩ khả năng dập tắt các oxi hoạt động và các gốc hydro tự do từ đĩ dẫn tới khả năng chống oxi hĩa của peptide
2.2.3 Peptide chống ung thư
Bằng chứng về mối quan hệ giữa các peptide/protein của đậu nành và khả năng chống ung thì chưa được rõ ràng. Brit và cộng sự (2001) đã kết luận rằng flavone và isoflavonone trong đậu nành cĩ tính chất chống ung thư, tuy nhiên cần phải cĩ những nghiên cứu sau nữa để làm sáng tỏ bản chất của sự tương tác của những thành phần này với peptide/protein đến khả năng chống ung thư.
Hoạt tính chống ung thư của protein đậu nành đã được đề cập đến từ những năm 1990. Ví dụ, trypsin inhibitor đã được cho là cĩ khả năng ức chế tế bào ung thư ovarian (Kobayashi 2004). Và cĩ nhiều khả năng hoạt tính chống ung thư của đậu nành cĩ được từ các peptide của nĩ. Ví dụ, các peptide cĩ được từ sự thủy phân protein đậu nành đã tách béo, thủy phân bằng thermolase, sau đĩ được tinh sạch bằng ethanol và sắc ký lọc gel, cho thấy giá trị IC50 0.16mg/ml in vitro (thí nghiệm trên chuột). Ơû nồng độ 1 mg/ml nĩ cĩ ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và sinh sản của tế bào nhờ khả năng giữ tế bào trong pha G2/M.
Lunasin là một peptide cĩ từ phần 2S albumin của đậu nành. Nĩ cĩ chứa 43 amino acid, cĩ đuơi là 9 gốc aspartic, nĩ cĩ khả năng bám dính vào tế bào. Lunasin cĩ khả năng bám dính vào non-acetylated H3 và H4 histone và ngăn cản chúng acetyl
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
hĩa. Người ta tin rằng chính cơ chế này làm cho nĩ cĩ khả năng chống ung thư (de Lumen 2005).
2.2.4 Peptide điều hịa hệ miễn dịch
Một peptide (MITLAIPVNKPGR) cĩ hoạt tính kích thích hoạt động của các bạch cầu. Peptide này được tách ra từ quá trình thủy phân protein đậu nành bằng trypsin. Nĩ cĩ nguồn gốc từ phần α' của β-conglycinin. Methionine ở đầu N của peptide cần thiết cho hoạt tính của nĩ, trong khi đĩ, amino acid thứ 3 kể từ đầu N lại cĩ ảnh hưởng đến hoạt tính của peptide (Thr < Phe < Trp). Đối với phần β của β-conglycinin thì amino acid đầu tiên là Ile, amino acid thứ 3 là Lys thì người ta khơng nhận thấy hoạt tính của peptide cĩ nguồn gốc từ nĩ. Qua quá trình đột biến, người ta đã thay thế amino acid thứ nhất của phần β này bằng Met và amino acid thứ 3 bằng Thr / Phe / Trp, từ đĩ người ta nhận thấy peptide thu được cĩ hoạt tính kích thích hoạt động của bạch cầu (Maruyama 2003).
[30]
Một số peptide cĩ tính chất chống oxi hĩa, chống lại sự oxi hĩa các acid béo chưa no. Chúng làm mất các gốc tự do, kết hợp tạo phức với ion kim loại mà cĩ khả năng xúc tác cho sự oxi hĩa. Tyrosine và histidine rất dễ bị ảnh hưởng bởi sự oxi hĩa, nĩ cĩ rất nhiều trong thành phần của các peptide từ đậu nành. Methionine, lysine và tryptophan cũng cĩ tính chất tương tự. Khả năng chống oxi hĩa của peptide được gia tăng khi cĩ mặt gốc proline trong phân tử, nĩ là tăng khả năng tương tác với các acid béo chưa no (Dziuba 1999a).
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
2.3 CÁC THỰC PHẨM KHÁC
Bảng 2.8: Các peptide cĩ hoạt tính sinh học cĩ nguồn gốc từ một số thực phẩm
Nguồn gốc Cách thu nhận Peptide Hoạt tính Tham khảo Rubisco từ rau spinach Tổng hợp; pepsin và leucine aminopeptidase (LAP) Rubiscolin-5 YPLDL, Rubiscolin-6 YPLDLF IC50 = 51.0µM và 24.4µM khi thí
nghiệm với chuột
Yang 2001
Gluten Lấy từ gluten Gluten exophin: GEA5:GYYPT GEA4:GYYP GEB5:YGGWL GEB4:YGGW GEC: YPISL GEA5 thể hiện hoạt tính δ - opiois cao hơn GEA4. GEB5 > GEB4 > GEC > GEA. Yoshikawa 2003 Lúa mì Pepsin, chymotrypsin và trypsin VK, FY, YQY, PSY Ưùc chế ACE, IC50 = 140µg/ml
(trước khi thủy phân IC50 = 360µ g/ml) IC50 = 13, 25, 4, 16 µM tương ứng Liam 2002 Albumin từ gạo trypsin Gly-Tyr-Pro- Met-Tyr-Pro- Leu-Pro-Arg. Điều hịa hệ thần kinh Kitts và Weiler 2003 α -Zeinα Thermolysin LQP, LLP, LSP, LAA, FY Ưùc chế ACE, IC50 = 1.9, 57, 1.7, 13vgb, 25µM tương ứng Yamamoto 2003 Protein isolates từ hoa hướng dương Dùng pepsin rồi dùng tiếp pancreatin
FVNPQAGS Ưùc chế ACE, IC50
= 5.7µM Megias 2004
Cá bonito Thermolysin (LKP)MN Ưùc chế ACE Yoshikawa,2000 Thịt gà Thermolysin Ile-Lys-Trp và Leu-Lys-Pro Chống cao huyết áp Korhonen và Pihlanto 2003 Protein cá mịi Bacillus licheniformis alkaline protease The ethanol fraction obtained with a chromatographic Ưùc chế ACE, IC50 = 15µg/ml Matsui 1993 Trang 31
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
Nguồn gốc Cách thu nhận Peptide Hoạt tính Tham khảo resin Ovalbumin của trứng gà *Chymotrypsin và trypsin * Pepsin * RADHPF (đoạn 359-364 của ovalbumin) * FRADHPFL
Điều hịa việc co dãn mạch máu. Matoba 1999 Sữa ong chúa Trước tiên dùng pepsin, kế đến dùng trypsin và chymotrypsin Các sản phẩm sau thủy phân
Ưùc chế ACE, IC50
= 90µg/ml Matsui 2002
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
Bảng 2.9: Một vài peptide cĩ hoạt tính ức chế ACE [14]
Nguồn protein Thứ tự acid amin IC50 (µ
M) Giảm SBP (mmHg ở [mg/kg BW])O Tham khảo gelatin GPAGAZ + GPPGAZ 8 Oshima et al., 1979
α -zein LRP 0.3 15 [30]a Miyoshi et al., 1991a
Mơ cơ heo MNP 67 Arihara et al., 2001
Đậu xanh 0.1 Pedroche et al., 2002
wakame YNKL 21 50 [50] Suetsuna và
Nakano,2000.
Tỏi FY 4 25 [200] Suetsuna, 1998
Lúa kiều mạch YQY, PSY 4 30 [100]b Li et al., 2002 Sữa ong chúa DGL 2 23 [1000] Matsui et al., 2002c Mầm lúa mạch I(VY) 0.5 (5) 19 [5]a (18 [50]) Matsui et al., 1999; Matsui et al., 2000 Cá bonito (LKP)NM 2 (0.3) 14 [15] (16 [9]) Fujita và
Yoshikawa,1999. Hemoglobin
máu heo
FQKVVA 6 30 [50] Mito et al., 1996 Ruột cá bonito IRPVQ 1 19 [100] Karaki et al., 1993
Đậu nành DLP 5 38 [100]b* Wu và Ding,
2001;2002.
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
Cyclo (His-Pro) (CHP) là 1 dipeptide mạch vịng cĩ nhiều chức năng sinh học. Như nhiều di-tripeptide khác, CHP cĩ thể được hấp thụ trong ruột non khi vào cơ thể. CHP-LI ( cyclo (His-Pro)-like immunoreactivity) đãđược tìm thấy trong 1 số thực phẩm.
Bảng 2.10: CHP-LI trong một số thực phẩm
Loại thực phẩm CHP-LI (pmol/g
thực phẩm) Protein (g) Hàm lượng /100gChất béo (g) Glucid (g)
Mì ống 76 13.0 2.9 73 Hot dog 73 12.5 27.6 1.8 Thịt đùi heo 131 14.4 14.4 <1 Trứng gà 23 12.8 11.5 0.7 Bánh mì (trắng) 88 7 3.5 49 Cá ngừ 2058 84 7 0
Sữa nguyên kem 6 3.2 3.7 4.6
Nước mắm 5209 21.1 1.2 0
Tơm khơ 6576 83.1 7.06 3.7
Nguồn gốc chính xác của CHP-LI trong thực phẩm thì khơng được rõ ràng, nhưng cĩ nhiều bằng chứng cho thấy nĩ hình thành từ quá trình thủy phân protein trong quá trình chế biến thực phẩm hơn là do sự thủy phân bởi enzyme trong thực phẩm.
Một vài peptide cĩ khả năng làm co cơ trơn, việc này được phát hiện khi người ta nghiên cứu in vitro khi sử dụng 1 đoạn ruột hồi. Ví dụ: albutensin A từ serum albumin sữa bị, β-lactotensin từ β -lactoglobulin và oryzatensin từ gạo [14].
Một số peptide cĩ khả năng ức chế các enzyme, ví dụ prolyl endopeptidase mà cĩ ảnh hưỡng đến chứng hay quên (Dziuba 1999a), và amio- và endopeptidase của vi khuẩn lactic và Pseudomonas fluorescens ( Smacchi 1998).
Chương 3:
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
CÁC PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN PEPTIDE
CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC
eptide cĩ hoạt tính sinh học cĩ nhiều ứng dụng trong thực phẩm và dược phẩm. Người ta cĩ thể thu nhận được các peptide này bằng nhiều phương pháp khác nhau, mỗi phương pháp cĩ những ưu, nhược điểm riêng và phù hợp cho từng loại peptide.
P
3.1 PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP HĨA HỌC
Liên kết peptide được hình thành từ sự kết hợp giữa nhĩm carboxy của amino acid thứ nhất với nhĩm amino của amino acid thứ hai và loại đi một phân tử nước.
Sự hình thành liên kết peptide dưới điều kiện ơn hịa chỉ cĩ thể xảy ra khi nhĩm carboxy của amino acid được hoạt hĩa; đồng thời, amino acid cịn lại tấn cơng vào
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
nhĩm carboxy này (theo cơ chế ái nhân) và từ đĩ hình thành dipeptide.
Khác với nhiều loại hợp chất hữu cơ khác, các phản ứng tổng hợp (điều chế) peptide rất phức tạp. Khơng thể tổng hợp được peptide mong muốn nhờ phản ứng trùng ngưng các phân tử aminoacid khác nhau vì sẽ tạo ra hỗn hợp các peptide. Ví dụ trường hợp đơn giản nhất là ngưng tụ 2 phân tử amino acid sẽ tạo ra tới 4 dipeptide:
Gly + Ala →−H O2 Gly-Gly Gly + Ala →−H O2 Ala-Ala Gly + Ala →−H O2 Gly-Ala Gly + Ala →−H O2 Ala-Gly
Do vậy để tổng hợp một peptide cĩ trật tự xác định các đơn vị amino acid trong phân tử thì cần phải “bảo vệ” nhĩm amino hay nhĩm carboxyl nào đĩ khi khơng cần chúng tham gia phản ứng tạo ra liên kết peptide.
Do đĩ, quá trình tổng hợp peptide thì cần phải trải qua 3 bước:
Bước 1: Bảo vệ nhĩm amino hay carboxy nào đĩ mà chúng khơng cần tham gia phản ứng tạo liên kết peptide.
Bước 2: Hình thành liên kết peptide. Gồm 2 bước nhỏ:
Amino acid mà cĩ nhĩm amino được bảo vệ phải được hoạt hĩa nhĩm carboxy để cĩ thể chuyển thành dạng trung gian cĩ hoạt tính cao.
Hình thành liên kết peptide
(Hai bước nhỏ này cĩ thể diễn ra liên tục hay tách rời thành 2 bước)
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
Bước 3: Tách rời các nhĩm bảo vệ (một phần hoặc tồn bộ). Mặc dù cần phải tách các nhĩm này sau khi tồn bộ chuỗi peptide được hình thành, nhưng người ta thường tách chọn lọc trong quá trình tổng hợp để cĩ thể tiếp tục quá trình trùng ngưng.
Nhĩm bảo vệ cần phải thỏa mãn một số tiêu chuẩn sau: Dễ gắn vào phân tử amino acid.
Bảo vệ được nhĩm chức trong điều kiện hình thành các liên kết peptide. Trong quá trình thực hiện khơng xảy ra hiện tượng racemic hĩa
Dễ loại ra mà khơng ảnh hưởng đến sự tồn tại của các liên kết peptide và các nhĩm bảo vệ bán vĩnh viễn.
3.1.1 Bảo vệ nhĩm amino
Nhĩm amino thường được bảo vệ bởi nhĩm benzyloxicarbonyl (C6H5–CH2– COO–cịn gọi là carbobenzoxi) bằng cách cho aminoacid phản ứng với benzyl clofomiat (C6H5 – CH2 – COO – Cl, carbobenzoxi clorua) trong dung dịch kiềm.
Sau khi tổng hợp được peptide, nhĩm bảo vệ sẽ được loại ra khỏi phân tử peptide nhờ phản ứng hydro phân.
Bảng 3.1: Ví dụ về một số nhĩm cĩ tác dụng bảo vệ nhĩm Nα -amino
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
3.1.2 Bảo vệ nhĩm carboxyl
Nhĩm carboxyl thường được bảo vệ bằng cách chuyển thành metyl hay etyl hoặc benzyl este. Nhĩm este dễ thủy phân hơn nhĩm peptide nên được loại ra khỏi phân tử peptide bằng cách thủy phân bởi dung dịch kiềm.
Riêng nhĩm benzyloxi (C6H5 – CH2O –) cịn được loại nhờ phản ứng hydro phân.
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
Bảng 3.2: Ví dụ về một số nhĩm cĩ tác dụng bảo vệ nhĩm Cα -carboxy
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
Quá trình tổng hợp peptide trở nên phức tạp hơn bởi một số amino acid cĩ các nhĩm chức khác cần phải bảo vệ ( 10 amino acid: Ser, Thr, Tyr, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Sec (selenocysteine (ký hiệu bằng 1 chữ cái là U)) và Cys). Do đĩ, cần phân biệt một số nhĩm chức cần được bảo vệ tạm thời và một số nhĩm chức cần phải được bảo vệ “bán vĩnh viễn”. Những nhĩm cĩ nhiệm vụ bảo vệ tạm thời (intermediary / temporary / transient group) những nhĩm chức amino hay carboxy cĩ liên quan đến sự hình thành liên kết peptide sau này, những nhĩm này cần phải được “tháo ra” dưới điều kiện sao cho khơng làm ảnh hưởng đến sự ổn định của các liên kết peptide đã được hình thành và các nhĩm bảo vệ bán vĩnh viễn. Các nhĩm bảo vệ bán vĩnh viễn thường được tháo ra ở cuối quá trình tổng hợp peptide hoặc cĩ thể là ở một số giai đoạn trung gian của quá trình.
Trong quá trình tổng hợp peptide, một số phản ứng xuất hiện mà cĩ liên quan đến những nhĩm chức mà thường được liên kết với tâm khơng đối xứng, do đĩ sẽ cĩ nguy cơ bị racemic hĩa.
Sự tách rời các nhĩm bảo vệ thường là bước cuối cùng của quá trình tổng hợp peptide ngoại trừ dipeptide. Vì sự tách chọn lọc chỉ sử dụng khi ta muốn tăng chiều dài mạch peptide. Tùy thuộc vào mục đích ta muốn mà nhĩm bảo vệ đầu Nα -amino sẽ được tách chọn lọc hay nhĩm bảo vệ đầu carboxy sẽ được tách chọn lọc.
3.1.3 Phương pháp tổng hợp peptide pha rắn
Giới thiệu:
Trong những giai đoạn đầu của hĩa học tổng hợp peptide, những phản ứng tổng hợp peptide đều thực hiện trong dung dịch. Việc tổng hợp peptide trong dung dịch tốn rất nhiều cơng sức, nĩ địi hỏi phải cĩ kiến thức vững vàng để cĩ thể chọn mục tiêu và nhĩm bảo vệ, phương pháp kết nối cũng như giải quyết vấn đề hịa tan trong dung mơi hữu cơ. Một trong những ưu điểm chính của phương pháp tổng hợp trong dung dịch là sản phẩm cĩ độ tinh sạch cao (mặc dù điều này cịn phụ thuộc vào quá trình tinh sạch sản phẩm).
Phương pháp tổng hợp peptide trên chất mang rắn (solid phase peptide synthesis - -
SPPS) này lần đầu tiên được nĩi đến vào năm 1963 bởi Robert Bruce Merrifield. Ngày
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
nay, phương pháp này được nhắc đến như là phương pháp tổng hợp Merrifield. Nguyên tắc:
Phương pháp tổng hợp peptide pha rắn được diễn ra như sau:
Chuỗi peptide sẽ được gắn với chất mang polymer khơng tan, đây là polymer nhân tạo cĩ chứa các nhĩm hoạt động (X) (ví dụ nhĩm -OH). Các nhĩm này phản ứng dễ dàng với nhĩm carboxyl của amino acid đã được bảo vệ đầu N, từ đĩ hình thành liên kết giữa phân tử amino acid và polymer. Nhĩm (Y) bảo vệ đầu N cĩ thể được loại bỏ và một phân tử amino acid
được bảo vệ đầu N thứ 2 cĩ thể được kết hợp tiếp tục. Quá trình được lặp đi lặp lại cho tới khi được mạch peptide theo yêu cầu.
Cuối quá trình tổng hợp, một tác nhân được sử dụng để phân hủy liên kết giữa đuơi C của peptide và chất mang rắn, từ đĩ peptide đi vào dung dịch.
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
Hình 3.1: Sơ đồ quá trình tổng hợp peptide pha rắn
Các ký hiệu: Y - nhĩm bảo vệ tạm thời cho đầu N; R1, R2, Rn, Rn+1 – mạch của amino acid.
Chất mang rắn:
Yêu cầu: cần phải trơ về mặt hĩa học, bền cơ học, khơng tan trong dung mơi được sử dụng, và cĩ thể tách ra dễ dàng trong quá trình lọc. Ngồi ra, nĩ cịn phải cĩ đủ số lượng các vùng hoạt hĩa để cĩ thể gắn các amino acid đầu tiên của chuỗi peptide vào.
Một số vật liệu làm chất mang được sử dụng: polyethylene, cellulose, silica,
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
controlled pore glass (CPG) và chitin
Một số hình dạng chất mang: dạng màng mỏng, dạng hạt, dạng sợi
Mức độ amino acid đầu tiên gắn vào chất mang cĩ giá trị tối ưu là 0.2- 0.5mmol/g chất mang. Từ đĩ cĩ thể tính tốn ra rằng peptide sau khi gắn 15