Sau khi tinh sạch thì cần phải kiểm chứng về mức độ đồng nhất (homogeneity) và những tính chất về cấu trúc (structural characterization) để cĩ được sản phẩm theo yêu cầu. Cĩ nhiều phương pháp phân tích được sử dụng.
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
Hình 4.1: Mối quan hệ giữa các phương pháp phân tích
Hình trên cho ta thấy mối quan hệ của các phương pháp phân tích. Các phương pháp phân tích amino acid (amino acid analysis) thì thích hợp để phân tích cấu trúc hĩa trị của phân tử; trong khi đĩ phương pháp phân tích thứ tự (sequence analysis) cho phép đánh giá cả mức độ đồng nhất lẫn cấu trúc phân tử. Phương pháp ghi phổ khối lượng (mass spectrometry) cũng là một phương pháp quan trọng để phân tích protein. Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân ( nuclear magnetic resonance- NMR) là một trong những phương pháp chính để phân tích cấu trúc của peptide hay protein trong dung dịch. Phương pháp quang phổ tử ngoại (ultraviolet spectroscopy) thường dùng để phân tích amino acid cĩ chứa vịng thơm (đặc biệt là Trp), nĩ cũng là cơng cụ để đánh giá, kiểm sốt việc tinh sạch peptide. Tuy nhiên những thơng tin về các liên kết hĩa trị của peptide thì vẫn cịn nhiều hạn chế.
Kết quả đánh giá định lượng quá trình tinh sạch peptide hay protein được gọi là “hoạt tính”. Thuật ngữ này thường được sử dụng cho enzyme. Sự phân tích enzyme dựa trên những phản ứng xúc tác đặc hiệu của enzyme, trong khi đĩ, protein thì dựa trên những tính chất vật lý của nĩ, ví dụ dựa trên cộng tố cĩ khả năng sinh màu cao (highly chromogenic cofactor) ta cĩ thể biết được thơng qua phương pháp quang phổ.
Hoạt tính riêng là thước đo cho mức độ tinh sạch, nĩ được định nghĩa là tỉ số giữa lượng protein thể hiện hoạt tính trong dung dịch so với tổng số protein trong dung dịch. Hoạt tính riêng gia tăng trong quá trình tinh sạch do ta đã loại bỏ những protein khác khơng cĩ hoạt tính này. Một protein hồn tồn tinh sạch nếu nĩ thể hiện hoạt tính riêng của protein ấy cao nhất.
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
Chương 5:
XỬ LÝ VÀ TỒN TRỮ PEPTIDE
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
5.1 TÍNH ỔN ĐỊNH CỦA PEPTIDE
Nĩi chung, peptide và protein thu được từ quá trình tinh sạch thường cĩ giữ lại 1 lượng nước và acid. Trong quá trình tồn trữ một số biến đổi cĩ thể diễn ra như sự oxi hĩa, sự hấp phụ, sự hấp thụ hay giải phĩng ẩm, biến đổi do tiếp xúc với ánh sáng, nhiệt…. Nhìn chung thì trạng thái rắn bền hơn so với trạng thái dung dịch tương ứng. Ơû trạng thái dung dịch thì bản chất của dung mơi, nồng độ, pH, và nhiệt độ cĩ ảnh hưởng rất lớn đến tính ổn định. Sự hấp phụ lên bề mặt vật chứa, sự vơ hoạt, sự racemic hĩa, oxi hĩa, deamin hĩa, phá mạch, hình thành diketoptperazine (hợp chất được tạo thành từ việc hydrate hĩa 2 phân tử Gly) và sự sắp xếp lại mạch là những hiện tượng xảy ra cho peptide nếu nĩ khơng ổn định trong dung dịch. Cĩ một vài trường hợp mà khi ở dạng rắn người ta lại nhận thấy nĩ kém bền hơn so với khi ở dạng dung dịch. Đối với dạng rắn, sự khơng ổn định nếu xảy ra thì cũng tương tự như dạng dung dịch (phá mạch, hình thành các liên kết, sự sắp xếp lại, thay thế…).
Những phản ứng điển hình như: Sự deamin hĩa của Asn và Gln
Sự oxi hĩa nguyên tử lưu huỳnh của Cys và Met Sự thay đổi cầu disulfur ở Cys
Sự phân hủy liên kết peptide
Sự dime hĩa hoặc sự kết hợp các phân tử.
Peptide trong thực phẩm cũng như trong dược phẩm cĩ thể phản ứng với những hợp chất khơng phải protein. Sự thiếu hụt Lys trong protein thực phẩm chủ yếu do phản ứng Maillard, một vài gốc amino acid khác như Asn, Arg, Gln cũng cĩ khả năng phản ứng với đường khử.
Hình 5.1: Bước đầu của phản ứng Maillard
Việc những phản ứng phân hủy vẫn cĩ thể xảy ra ở trong cả dạng rắn (ít ẩm) vẫn
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
chưa được hiểu rõ ràng. Sự hút ẩm, nhiệt độ và sự hình thành các “excipient” (ví dụ như polymer) được xem là những nhân tố chính ảnh hưởng đến sự khơng ổn định của peptide hay protein ở dạng rắn.
5.2 SỬ DỤNG VÀ TỒN TRỮ PEPTIDE
Các peptide khác nhau cĩ những tính chất hịa tan khác nhau. Sự khĩ khăn trong việc hịa tan peptide cĩ liên quan đến sự hình thành cấu trúc bậc 2. Sự tạo thành cấu trúc bậc 2 này xuất hiện với hầu hết các peptide (trừ những peptide cĩ độ dài mạch quá ngắn) và đặc biệt là những peptidec cĩ chứa nhiều amino acid ưa béo. Sự hình thành cấu trúc bậc 2 này cĩ thể được thúc đẩy bởi muối. Khi sử dụng, trước tiên ta cần hịa tan peptide trong nước cất, sĩng siêu âm cĩ thể giúp tăng khả năng hịa tan của peptide.
Khi cần tồn trữ peptide trong thời gian dài thì ta cần phải tiến hành sấy lạnh peptide. Peptide được sấy lạnh cĩ thể bảo quản vài năm ở nhiệt độ -20o
C hoặc thấp hơn mà hầu như khơng cĩ sự phân hủy. So với dạng tồn trữ này thì peptide ở trong dạng dung dịch ít bền hơn. Peptide dễ bị tác động bởi vi sinh vật, do đĩ chúng cần được hịa tan trong nước cất.
Peptide cĩ chứa Met, Cys hoặc Trp thì cĩ thời gian bảo quản ở dạng dung dịch ngắn hơn do chúng bị oxi hĩa. Những peptide này cần phải được hịa tan trong dung mơi đã được loại oxi.
Peptide thường được bán dưới dạng bột mịn được sấy lạnh, đựng trong các lọ nhỏ. Cần phải trữ lạnh chúng sau khi mua về. Để hồn nguyên (reconstitute) peptide thì nên dùng nước cất hoặc dung dịch đệm, cĩ thể dùng dung dịch acetic acid hoặc ammonium bicarbonate đối với peptide khĩ hịa tan. Một số dung mơi khác cĩ thể được sử dụng để hịa tan peptide như acetonitrile, DMSO, DMF, hoặc isopropanol. Những dung mơi này nên dùng với một lượng tối thiểu, sau đĩ thêm nước hoặc dung dịch đệm đến thể tích yêu cầu. Sau khi peptide được hồn nguyên, chúng cần phải được sử dụng ngay để tránh bị phân hủy trong dung dịch. Phần peptide cịn dư thì nên tiến hành sấy lạnh trở lại, giữ ở -20o
C. Cần tránh việc lạnh đơng, rã đơng nhiều lần.
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
Phương pháp hịa tan peptide:
Cách tốt nhất để hịa tan peptide là dùng nước. Đối với các peptide khơng tan trong nước thì ta cĩ thể dùng những cách sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đối với peptide cĩ tính acid (tích điện âm), ta dùng một lượng nhỏ base ví dụ ammonium bicarbonate 10% để hịa tan peptide, thêm nước vào đến nồng độ theo yêu cầu. Khơng sử dụng base cho peptide cĩ chứa Cys
Đối với peptide cĩ tính base (tích điện dương), sử dụng một lượng khoảng acid acetic 30%, thêm nước đến nồng độ yêu cầu.
Đối với peptide rất kị nước, cố gắng hịa tan peptide trong một lượng nhỏ DMSO, thêm nước đến nồng độ yêu cầu.
Đối với peptide cĩ khuynh hướng kết tủa (thường là những peptide cĩ chứa Cys), thêm urea 6M với acid acetid 20%, hoặc guanidine. HCl 6M vào peptide, thêm nước tới nồng độ yêu cầu.
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
Chương 6:
ỨNG DỤNG
CỦA PEPTIDE CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC
o cĩ những tính chất đặc biệt, ảnh hưởng đến chức năng sinh lý của cơ thể nên các peptide cĩ hoạt tính sinh học cĩ thể được ứng dụng trong dược phẩm và trong thực phẩm (thực phẩm chức năng).
D