Giới thiệu:
Trong những giai đoạn đầu của hĩa học tổng hợp peptide, những phản ứng tổng hợp peptide đều thực hiện trong dung dịch. Việc tổng hợp peptide trong dung dịch tốn rất nhiều cơng sức, nĩ địi hỏi phải cĩ kiến thức vững vàng để cĩ thể chọn mục tiêu và nhĩm bảo vệ, phương pháp kết nối cũng như giải quyết vấn đề hịa tan trong dung mơi hữu cơ. Một trong những ưu điểm chính của phương pháp tổng hợp trong dung dịch là sản phẩm cĩ độ tinh sạch cao (mặc dù điều này cịn phụ thuộc vào quá trình tinh sạch sản phẩm).
Phương pháp tổng hợp peptide trên chất mang rắn (solid phase peptide synthesis - -
SPPS) này lần đầu tiên được nĩi đến vào năm 1963 bởi Robert Bruce Merrifield. Ngày
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
nay, phương pháp này được nhắc đến như là phương pháp tổng hợp Merrifield. Nguyên tắc:
Phương pháp tổng hợp peptide pha rắn được diễn ra như sau:
Chuỗi peptide sẽ được gắn với chất mang polymer khơng tan, đây là polymer nhân tạo cĩ chứa các nhĩm hoạt động (X) (ví dụ nhĩm -OH). Các nhĩm này phản ứng dễ dàng với nhĩm carboxyl của amino acid đã được bảo vệ đầu N, từ đĩ hình thành liên kết giữa phân tử amino acid và polymer. Nhĩm (Y) bảo vệ đầu N cĩ thể được loại bỏ và một phân tử amino acid
được bảo vệ đầu N thứ 2 cĩ thể được kết hợp tiếp tục. Quá trình được lặp đi lặp lại cho tới khi được mạch peptide theo yêu cầu.
Cuối quá trình tổng hợp, một tác nhân được sử dụng để phân hủy liên kết giữa đuơi C của peptide và chất mang rắn, từ đĩ peptide đi vào dung dịch.
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
Hình 3.1: Sơ đồ quá trình tổng hợp peptide pha rắn
Các ký hiệu: Y - nhĩm bảo vệ tạm thời cho đầu N; R1, R2, Rn, Rn+1 – mạch của amino acid.
Chất mang rắn:
Yêu cầu: cần phải trơ về mặt hĩa học, bền cơ học, khơng tan trong dung mơi được sử dụng, và cĩ thể tách ra dễ dàng trong quá trình lọc. Ngồi ra, nĩ cịn phải cĩ đủ số lượng các vùng hoạt hĩa để cĩ thể gắn các amino acid đầu tiên của chuỗi peptide vào.
Một số vật liệu làm chất mang được sử dụng: polyethylene, cellulose, silica,
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
controlled pore glass (CPG) và chitin
Một số hình dạng chất mang: dạng màng mỏng, dạng hạt, dạng sợi
Mức độ amino acid đầu tiên gắn vào chất mang cĩ giá trị tối ưu là 0.2- 0.5mmol/g chất mang. Từ đĩ cĩ thể tính tốn ra rằng peptide sau khi gắn 15 amino acid thì chiếm 50% khối lượng. Tốc độ tăng tỉ lệ khối lượng giữa peptide/chất mang thường khơng làm giảm hiệu quả của quá trình tổng hợp mặc dù khi đĩ tính chất phồng lên trong dung mơi khơng phân cực của chất mang bị giảm đi rõ rệt. Những vật liệu phân cực hơn (ví dụ polyamide) thường dùng để tổng hợp các peptide mạch dài hơn.
Nhĩm chức hoạt động trên chất mang: cĩ thể xem như là tương ứng với nhĩm bảo vệ đầu C của peptide (tức là cĩ tác dụng bảo vệ đầu C của peptide). Tùy thuộc vào đầu C của peptide nào mà người ta cần 1 carboxylate, 1 carboxamide, 1 hydrazide, 1 ester, 1 thioester , hoặc 1 alcohol. Trong hầu hết các trường hợp, amino acid đầu tiên được gắn với chất mang nhờ liên kết ester. Việc lựa chọn phù hợp sẽ giúp quá trình gắn và tách peptide khỏi chất mang thuận lợi, đồng thời tránh được hiện tượng racemic hĩa (trong quá trình gắn amino acid đầu tiên) và sự hình thành diketopiperazine (trong quá trình tạo thành dipeptide).
Chất mang đầu tiên được sử dụng trong SPPS là 1 copolymer của polystyrene và 1-2% divinyl benzene. Hạt chất mang khơ cĩ đường kính khoảng 20-80µm và cĩ thể phồng lên đến thể tích lớn hơn thể tích ban đầu từ 5-6 lần tùy loại dung mơi (dung mơi dùng cho tổng hợp peptide). Do đĩ, chất mang polymer (thường lơ lửng trong dung mơi) khơng phải dạng mạng rắn (solid matrix) mà ở dạng gel được solvate hĩa tốt và chuỗi polymer khá linh động. Điều này giúp cho các chất phản ứng dễ khuếch tán tới các vùng phản ứng. Người ta nhận thấy cĩ thể cĩ khoảng 1012 chuỗi polypeptide giữ trên hạt chất mang Polystyrene/divinylbenzene cĩ đường kính 50 µm và cĩ thể chứa 0.3mmol peptide/g chất mang.
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
Hình 3.2: Chất mang Polystyrene/divinylbenzene
Bảng 3.3: Độ phồng lên của chất mang Polystyrene/divinylbenzene (so với thể tích ban đầu) trong một số dung mơi
Dung mơi Độ phồng lên
Tetrahydrofuran 5.5 N,N-Dimethylacetamide 3.4 Dichloromethane 5.1 Diethylether 2.5 Dioxan 4.6 Acetonitrile 2.0 Toluene 4.5 Ethanol 1.05 N,N-Dimethylformamide 3.5 Methanol 0.95
Ưu điểm của phương pháp SPPS so với phương pháp tổng hợp trong dung dịch: Trong quá trình tổng hợp ta khơng phải thực hiện việc tách và làm sạch các
sản phẩm trung gian rất tốn thời gian như khi làm trong dung dịch. Trong phương pháp này, sản phẩm của phản ứng được giữ lại trên chất mang rắn, cĩn những chất tham gia phản ứng cịn dư hoặc sản phẩm phụ sẽ được loại
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
bỏ bằng cách lọc.
Chu kỳ sản xuất ngắn hơn, năng suất cao hơn. Nhược điểm của phương pháp SPPS:
Để cĩ thể cĩ phản ứng xảy ra hồn tồn thì cần cĩ một lượng lớn các amino acid mỗi loại
Vẫn cĩ thể xảy ra các phản ứng khơng mong muốn (bởi các nhĩm chức khác trong mạch của amino acid) trong quá trình hoạt hĩa, kết nối, tháo các chất bảo vệ.
Việc theo dõi tiến trình phản ứng và phân tích xem phản ứng đã hồn tồn chưa thì rất khĩ thực hiện
Sự phồng lên (swelling) của polymer và sự khuếch tán của các chất phản ứng trong quá trình tổng hợp là điều hết sức quan trọng
Hiện tượng kết tụ của chuỗi peptide làm cho việc tổng hợp trở nên phức tạp Điều kiện phản ứng để giải phĩng peptide khỏi polymer cĩ thể gây phá hủy
sản phẩm
Cĩ thể xảy ra hiện tượng ráp mạch khơng đúng:
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
Điều này xảy ra khi cĩ sự acyl hĩa khơng hồn tồn, việc loại các nhĩm bảo vệ khơng hồn tồn hoặc cĩ một vài amino acid thành phần khơng được ráp vào mạch, việc tách các sản phẩm khơng mong muốn này tốn nhiều thời gian, cơng sức, do đĩ cần cĩ biện pháp phịng tránh những hiện tượng này xảy ra.