1) Các enzym giới hạn.
Trong Cơng nghệ di truyền, muốn tạo ra DNA tái tổ hợp để đưa vào tế bào chủ cần phải cĩ cơng cụ cắt plasmid hình vịng và đoạn DNA của tế bào rồi cho chúng nối lại với nhau. Cơng cụ cắt DNA là các enzym giới hạn.
a) Khái niệm về enzym giới hạn
Thơng thường tế bào vi khuẩn bị nhiễm phagơ (thể thực khuẩn) thì vi khuẩn đĩ bị phagơ phá hủy. Một số loại vi khuẩn sau khi nhiễm phagơ lại khơng bị phá hủy do trong tế bào vi khuẩn này cĩ loại enzym cĩ khả năng cắt DNA phagơ thành những đoạn nhỏ. Năm 1970, Hamilton Smith là người đầu tiên tách được loại enzym này từ vi khuẩn Haemophilus influenzae được gọi tên là HinII. Ngay sau đĩ, các nhà khoa học đã thấy rằng, phần lớn các lồi vi khuẩn mang loại enzym cĩ khả năng cắt DNA lạ xâm nhập để bảo vệ tế bào khỏi bị xâm nhập của các DNA lạ. Những enzym đĩ được gọi là enzym giới hạn.
Enzym giới hạn là enzym cĩ khả năng nhận biết những đoạn trình tự DNA nhất định và cắt DNA ở ngay điểm này hay điểm kế cận. Tùy theo phương thức cắt và nguồn gốc của enzym giới hạn mà người ta phân loại và đặt tên cho các enzym giới hạn đĩ.
b) Phân loại enzym giới hạn.
Các enzym giới hạn được phân thành 3 kiểu I, II và III. Các enzym giới hạn thường dùng phổ biến trong cơng nghệ DNA tái tổ hợp, Cơng nghệ di truyền là enzym giới hạn thuộc kiểu II. Các enzym này cắt bên trong mạch DNA (khơng phân hủy từ 2 đầu của DNA) nên cịn được gọi là enzym endonuclease. Enzym giới hạn kiểu II thực chất là endonuclease giới hạn kiểu II.
Các endonuclease giới hạn kiểu II:
Cách gọi tên các enzym giới hạn kiểu II cũng như các enzym giới hạn khác dựa trên qui ước chung. Tên enzym giới hạn được ghép bởi chữ cái đầu tiên là tên chi và 2 chữ cái tiếp theo là tên lồi của vi sinh vật mà enzym được tách chiết, những chữ và số La mã tiếp theo là tên của chủng và dịng của lồi vi sinh vật cụ thể đã tách chiết enzym .
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
Ví dụ:
Tên enzym Chi Lồi Chủng Thứ tự dịng
Escherichia coli Ry13
E.coRI E. co R I E.coRV E. co R Vi sinh vật Bacillus amyloliquefaciens H BamHI B am H I Haemophilus aegyptius HaeIII H ae III Serratia martesens SmaI S ma I
Giá trị của enzym giới hạn là ở tính chất cắt đặc hiệu của chúng. Mỗi enzym cụ thể cĩ thể nhận biết một đoạn trình tự đặc thù các cặp bazơ trên DNA. Đoạn nhận biết phổ biến nhất cĩ chiều dài 4, 5 hoặc 6 nucleotit tương ứng với khoảng 44 = 256 cặp bazơ, 45 = 1024 cặp bazơ hoặc 46 = 4096 cặp bazơ cĩ khả năng lặp lại một lần trong cấu trúc chung của DNA. Như vậy enzym giới hạn nhận biết đoạn trình tự 4 nucleotit sẽ cắt phân tử DNA ngắn hơn các enzym giới hạn nhận biết đoạn trình tự 5 hoặc 6 nucleotit
Cĩ 2 kiểu cắt của enzym giới hạn là: kiểu cắt tạo đầu bằng (blunt ends) và đầu so le (đầu dính – cohesive ends). Enzym giới hạn cắt đầu bằng khơng tự nối các đoạn DNA lại với nhau. Để nối các đoạn DNA sau khi cắt, cần sử dụng enzym nối ligase và các adaptor chuyên dụng cho mỗi loại enzym. Enzym giới hạn cắt đầu so le tạo đầu dính. Sau khi cắt chúng cĩ thể tự nối lại với nhau theo nguyên tắc bổ sung. Chính ví vậy trong cơng nghệ DNA tái tổ hợp người ta thường dùng các enzym giơi hạn cắt đầu so le.
Một số enzym giới hạn thường được sử dụng cùng với đoạn trình tự nhận biết và vị trí cắt của chúng .
Bảng3.4: Một số enzym giơi hạn thường dùng
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
Các enzym giới hạn cắt đầu so le cắt theo 2 kiểu hình dạng. Các đoạn cĩ thể sinh ra đĩ là các đoạn cĩ đầu 3’ nhơ ra và các đoạn cĩ đầu 5’ nhơ ra
HaeIII PstI EcoRI
5’ – GG CC – 3’ CC GG 5’ – C TGCA G – 3’ G ACGT C 5’ – G AATT C – 3’ C TTAA G
Đầu bằng Đầu so le 3’ Đầu so le 5’
Hình 3.7 : Các dạng đầu mút tạo bởi các loại enzym giới hạn
Hai loại enzym tạo đầu so le 3’ và đầu so le 5’ thường được dùng trong Cơng nghệ di truyền do khả năng tự nối lại với nhau, hoặc với các đoạn DNA khác cĩ đầu tương tự. Khi sử dụng từng loại enzym giới hạn cần cĩ các điều kiện nhiệt độ, độ pH, dung mơi thích hợp. Nguyên tắt chung cắt DNA bằng một enzym giới hạn nào đĩ là ủ DNA sợi kép với một lượng enzym giới hạn thích hợp trong một chế độ dung dịch đệmtheo hướng dẫn của nhà sản xuất và ở một nhiệt độ tối ưu cho chính loại enzym này. Trong
Trang 55
Enzym Vi khuẩn cĩ enzym Đoạn nhận biết và cắt trên DNA
BamHI Bacilus amyloliquefaciens CCTAG GGGATCC EcoRI E.coli RY13 CTTAA GGAATTC
HhaI Haemophilus haemolyticus G CGCC GCG HindIII Haemophilus influenzae A AGCTTTTCGA A
PstI Providencia stuartii CTGCA GG ACGTC HaeIII Haemophilus aegyptipus GG CCCC GG
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
điều kiện thích hợp, phản ứng cắt hồn tồn 1 microgam DNA sợi kép kéo dài 1-3 giờ và thường ở 370C. một số loại enzym cĩ hoạt tính yếu, do vậy khi cắt cĩ thể kéo dài thêm thời gian, hoặc bổ sung thêm enzym giới hạn sau 1-2 giờ rồi lại ủ tiếp.
2) Các enzym polymerase
Các enzym polymerase xúc tác cho quá trình sao chép các axit nucleotit (DNA hoặc ARN) được sử dụng nhiều trong Cơng nghệ di truyền. Khi nĩi về một enzym polymerase nào đĩ, người ta thường dùng thuật ngữ “phụ thuộc DNA” hoặc “phụ thuộc ARN” để chỉ axit nucleic mà enzym này xúc táccho việc sao chép. DNA polymerase phụ thuộc DNA thì sao chép DNA sang DNA; DNA polymerase phụ thuộc ARN thì sao chép ARN sang DNA, cịn enzym ARN polymerase phụ thuộc DNA thì phiên mã DNA sang ARN. Các enzym này tổng hợp axit nucleic bằng cách nối các nucleotit với nhau theo nguyên tắc bổ sung dựa theo mạch khuơn. Quá trình tổng hợp mạch mới bổ sung diễn ra theo chiều từ 5’-3’ và sự khởi đầu cần cĩ đầu 3’-OH tự do.
a) Các DNA polymerase
Enzym DNA polymerase I (pol I) là enzym DNA polymerase I xúc tác cho việc lấp đầy chỗ trống trên phân tử DNA hoặc mạch đơn của DNA ngắn. Enzym DNA polymerase I xúc tác tổng hợp mạch đơn mới đồng thời cĩ vai trị trong việc sửa chữa các sai sĩt trong quá trình sao chép DNA. Ngồi chức năng tổng hợp, enzym DNA polymerase I cịn cĩ hoạt tính exonuclease, nghĩa là nĩ cĩ khả năng thủy phân liên kết giữa các nucleotit từ 2 đầu của phân tử DNA, cắt rời từng nucleotit theo cả 2 chiều 5’-3’ và 3’-5’. Trong nhiều trường hợp, enzym DNA polymerase I được sử dụng trong kỹ thuật xác định trình tự DNA bằng phương pháp dideoxy, tổng hợp mẫu dị cĩ đánh dấu phĩng xạ hoặc thiết kế các vector mạch đơn.
Trong thực tế enzym DNA polymerase I ít được sử dụng mà người ta thường sử dụng một sản phẩm thủy phân của nĩ được gọi là đoạn Klenow (Klenow fragment). Đoạn này vẫn giữ được hoạt tính của polymerase và exonuclease 5’-3’. Đoạn Klenow được sử dụng khi cần sao chép một phân tử DNA mạch đơn vì chức năng exonuclease bị thiếu khả năng cắt đầu 3’-5’ nên enzym này khơng thể thủy phân mạch đơn làm khuơn trong quá trình tổng hợp DNA mới.
Enzym T4 DNA polymerase cĩ nguồn gốc từ thể thực khuẩn T4 (phageT4) xâm
nhiễm vi khuẩn E.coli. Hoạt tính của enzym T4 DNA polymerase tương tự đoạn
Klenow. Do nĩ cĩ hoạt tính exonuclease 3’-5’ mạnh nên thường được sử dụng để tổng hợp mẫu dị cĩ độ phĩng xạ cao.
Enzym Tag polymerase được chiết xuất từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermophilus aquaticus. Enzym Tag polymerase thường được sử dụng trong việc nhân gen trong kỹ thuật chuỗi trùng hợp (kỹ thuật PCR). Enzym Tag cĩ khả năng tăng cường sự bắt cặp
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
tạo DNA bổ trợ (cDNA-complementary DNA) nhưng khơng hoạt động trên các phân tử DNA.
Hiện nay cịn cĩ nhiều loại DNA polymerase khác lưu hành trên thị trường như T7
DNA polymerase, Vent DNA polymerase …
b) Các enzym DNA polymerase
Cĩ 3 loại enzym DNA polymerase thường được dùng trong thực tế, đĩ là SP6DNA polymerase, T3 DNA polymerase và T7 DNA polymerase. Enzym SP6 DNA
polymerase được tách chiết từ phage xâm nhiễm vi khuẩn Samonella typhimurium. Enzym T3 DNA polymerase và T7 DNA polymerase được tách chiết từ phage xâm
nhiễm E.coli. Các enzym này xúc tác quá trình phiên mã tổng hợp ARN từ mạch khuơn của phân tử DNA theo chiều từ 5’-3’ (mạch khuơn cĩ chiều 3’-5’). Trên thực tế DNA polymerase được ứng dụng trong tổng hợp mẫu dị ARN và trong việc nghiên cứu quá trình phiên mã tổng hợp mARN.
c) Enzym phiên mã ngược (Reverse transcriptase)
Enzym phiên mã ngược cĩ khả năng tổng hợp DNA một mạch gọi là DNA bổ trợ (cDNA) từ khuơn mARN hoặc từ một đoạn polynucleotit được tổng hợp bằng con đường hĩa học. Nhờ cĩ enzym phiên mã ngược này mà cĩ thể tổng hợp được hầu hết các gen riêng biệt nào đĩ nếu như cĩ mặt mARN của gen đĩ. Các cDNA mạch đơn cĩ thể biến thành mạch kép nhờ DNA polymerase và được gọi là cDNA mạch kép (c- DNA duplex). Đoạn cDNA mạch kép cĩ thể gắn vào plasmid rồi biến nạp vào vi khuẩn, từ đĩ tạo dịng c-DNA. Nếu cDNA cĩ nguồn gốc từ 1 gen thì ta tạo được dịng gen. Trong trường hợp mARN trưởng thành khi đã ở ngồi nhân thì ta sẽ thu được dịng gen chỉ chứa những đoạn mã hĩa (exon), khơng cĩ đoạn khơng mã hĩa (nitron).
3) Các enzym nối (Ligase)
Enzym ligase là enzym nối quan trọng trong tế bào. Các enzym này xúc tác hình thành các liên kết phosphodiester để nối các đoạn axit nucleic với nhau. DNA ligase xúc tác nối 2 đoạn DNA với nhau, ARN ligase xúc tác nối các đoạn ARN với nhau. Trong cơng nghệ DNA tái tổ hợp, DNA ligase là enzym chủ yếu được sử dụng rộng rãi. Cĩ một số enzym nối khác nhau nhưng enzym T4 DNA ligase kết hợp với 2 loại
enzym T4 polynucleotit kinase và alkaline phosphatase được sử dụng rộng rãi nhất
trong các thí nghiệm về Cơng nghệ di truyền.
Cĩ 3 loại enzym nối thường dùng trong Cơng nghệ di truyền. Enzym E.coli DNA ligase được tách chiết từ vi khuẩn E.coli, xúc tác phản ứng nối 2 đoạn trình tự DNA cĩ đầu so le. Enzym T4 DNA ligase được tách chiết từ phage T4 xâm nhiễm vào E.coli cĩ chức năng giống như E.coli DNA ligase nhưng lại cĩ khả năng nối 2 đoạn trình tự DNA cĩ đầu bằng và là enzym nối được ưa chuộng nhất hiện nay. Enzym T4 DNA
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
ligase tách chiết từ phage T4xâm nhiễm E.coli cĩ khả năng nối 2 trình tự ARN bằng các liên kết phosphodiester.
Ngồi các loại enzym kể trên, hiện nay người ta cịn sử dụng các đoạn nối (đầu dính-adaptor) cho các enzym cắt đầu bằng. Adaptor xúc tác nối các đoạn DNA do các enzym giới hạn cắt đầu bằng, từ đĩ tạo nên đầu so le. Mỗi loại enzym cắt đầu bằng đều cĩ các loại adaptor đặc trưng riêng.
4) Các enzym nuclease
Các enzym nuclease phân hủy các axit nucleic bằng cách làm đứt các liên kết phosphodiester là liên kết nối các nucleotit cùng một mạch với nhau. Ngồi các enzym giới hạn đã nêu ở trên cịn cĩ các loại nuclease chủ yếu sau:
Enzym ADNase I (endonuclease) tách chiết từ tụy của bị, xúc tác phản ứng thủy phân các liên kết ngay sau 1 bazơ nitơ ở cả mạch đơn và mạch kép hồn tồn ngẫu nhiên.
Enzym S1 nuclease (endonuclease) là enzym tách chiết từ nấm mốc Aspegillus oryzae. S1 nuclease phân cắt các DNA mạch đơn và cả ARN
Enzym nuclease BAL 3 (endonuclease) phân cắt cả 2 đầu 5’ và 3’ của DNA và khơng cĩ khả năng cắt nội liên kết.
Enzym exonuclease III là một 3’ exonuclease cắt đầu 3’ của mạch đơn và tạo thành các đoạn DNA cĩ đầu 5’ nhơ ra.
Enzym ARNase A tách chiết từ tụy bị. Enzym này thường được sử dụng để loại bỏ ARN trong hỗn hợp DNA và ARN.
Enzym ARNase H dùng để loại bỏ ARN trong các phân tử lai DNA-ARN, nhất là sau phản ứng phiên mã ngược để hình thành mạch thứ 2 của cDNA, từ đĩ tạo nên phân tử cDNA kép.
3.3.3. Các vector sử dụng trong cơng nghệ DNA tái tổ hợp
Muốn chuyển được gen mong muốn từ thể cho sang vật chủ nhận (thể nhận), hoặc tách dịng gen, điều cơ bản là cần phải cĩ vật chuyển gen (vector chuyển gen). Vector chuyển gen là phân tử DNA nhỏ cĩ khả năng mang được gen cần thiết.
a) Yêu cầu của vector chuyển gen:
- Cĩ điểm khởi đầu sao chép (origin of replication – ori) để tự sao chép mà độc lập trong tế bào.
- Cĩ các đoạn trình tự nhận biết cho enzym giới hạn cắt rồi để hở tạo nơi lắp ráp cho các đoạn gen lạ/
- Cĩ đoạn trình tự khởi điểm (prơmter).
- Cĩ dấu chuẩn chọn lọc cho phép dễ dàng phát hiện nhận biết chúng trong tế bào chủ nhận. Thơng thường dấu chuẩn chọn lọc là các gen kháng chất kháng sinh, hoặc gen tổng hợp chất màu.
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
Để đảm bảo được tính bền vững của DNA tái tổ hợp, ngồi các đặc điểm trên vector chuyển gen cần những đặc tính khác để cho việc tạo, tách dịng dễ thực hiện như:
- Chứa các gen vơ hiệu hĩa các đoạn DNA khơng mong muốn bị gắn nhầm vào. - Cĩ khả năng tạo nhiều bản sao để khi tách khỏi tế bào được số lượng lớn, đảm
bảo sự khuếch đại của gen lạ mong muốn được gắn vào.
Giá trị của các vector chuyển gen ở chỗ nĩ được cấu tạo thuận tiện cho mục đích sử dụng. Hiện tại chưa cĩ loại vector chuyển gen tồn năng, mà cần phải lựa chọn vector chuyển gen cho từng đối tượng và tùy thuộc vào kích thước của đoạn gen cần được chuyển.
b) Ứng dụng chủ yếu của vector chuyển gen :
- Tạo dịng, nhân dịngcác đoạn trình tự hoặc gen để tạo nhiều bản sao giống nhau.
- Nghiên cứu sự biểu hiện của một đoạn trình tự DNA hoặc một gen - Chuyển gen vào tế bào của vi sinh vật khác (vật chủ nhận).
- Sản xuất các ARN.
- Sản xuất các protein được tổng hợp từ gen đã được tạo dịng. Do tính chất quan trọng và nhiều ứng dụng nên các vector chuyển gen ngày càng được khám phá, hồn thiện khơng ngừng. Từ những vector chuyển gen sẵn cĩ trong tự nhiên như plasmid ở vi khuẩn, ngày nay người ta đã tạo ra nhiều loại vector phức tạp ứng dụng vào nhiều mục đích khác nhau thậm chí tạo ra cả nhiễm sắc thể nhân tạo.
c) Các vector chuyển gen:
Plasmid
Plasmid là những phân tử của DNA cực nhỏ nằm ở bào tương của Procaryote. Plasmid cĩ một số đặc điểm cơ bản sau:
+ Cĩ kích thước nhỏ hơn kích thước của DNA ở nhân tế bào. + Hồn tồn giống mã di truyền của DNA trong nhân.
+ Cĩ khả năng tái tạo độc lập.
+ Cĩ khả năng truyền lại một số tính chất đặc biệt cho thế hệ sau, thí dụ như tính kháng nguyên tố nặng, tính kháng sinh, tạo nhân tố CoIE1 (tức Plasmid cĩ E1). Các vector chuyển gen thường được sử dụng là các plasmid của vi khuẩn và các
Bacteriophage. Plasmid được coi như vector chuyển gen và được nghiên cứu rất sớm, ngày càng hồn thiện.
Thế hệ thứ nhất: là các plasmid tự nhiên. Hiện nay người ta khơng sử dụng loại plasmid này nữa.
Thế hệ thứ hai: là các plasmid cĩ cấu tạo phức tạp hơn. Một trong những plasmid loại này được sử dụng nhiều nhất là pBR322. Ðây là plasmid được cấu tạo từ nhiều đoạn nhỏ của các
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
plasmid khác nhau, để vừa cĩ được các gen kháng thuốc, vừa cĩ các điểm nhận biết cho các gen hạn chế và chúng cĩ chiều dài khoảng 5000 cặp base. Plasmid này cĩ khả năng sao chép độc