Sau khi xử lý sơ bộ hỗn hợp ban đầu thì hỗn hợp sau đĩ sẽ được xử lý thêm để cĩ thể cĩ được peptide mong muốn, một số phương pháp thường sử dụng:
Sắc ký lỏng cao áp pha đảo (reversed-phase HPLC : RP-HPLC): là phương pháp thơng dụng nhất để tách và tinh sạch peptide. Thuộc loại sắc ký cột cĩ pha động là chất lỏng. Hiệu quả phân tích cao của HPLC đạt được là do vật liệu nhồi cột cĩ kích thước hạt rất bé (5-10µm) và độ đồng nhất cao làm tăng
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
đáng kể số đĩa lý thuyết, việc sử dụng bơm cao áp duy trì áp suất cao ở đầu cột nhằm điều chỉnh và ổn định vận tốc dịng và tăng tốc quá trình phân tích. RP- HPLC dùng pha tĩnh kém phân cực hơn pha động. Khi đĩ các dung mơi sử dụng là dung mơi phân cực, thường ít độc hại hơn, rẻ hơn và khơng gây ơ nhiễm mơi trường.
Sắc ký lỏng cao áp pha thuận (normal-phase HPLC): tương tự trên, nhưng pha tĩnh phân cực hơn pha động. Thường dùng để tách các peptide ưa nước.
Sắc ký trao đổi ion (ion-exchange chromatography: IEC): thường dùng để tinh sạch protein. Cĩ thể coi đây là 1 dạng đặc biệt của sắc ký hấp phụ mà trong đĩ các cấu tử mẫu mang điện cĩ khả năng tương tác tĩnh điện 1 cách thuận nghịch với pha tĩnh là các hạt nhựa mang điện trái dấu, cịn pha động là các dung dịch điện ly. Lực liên kết phụ thuộc vào bán kính ion và mật độ ion của pha tĩnh (số điện tích trên 1 đơn vị thể tích phân tử).
Phương pháp này cĩ tiềm năng trong việc ứng dụng trong quy mơ lớn.
Sắc ký ái lực (affinity chromatography: AC): phương pháp này dựa trên khả năng giữ peptide bằng những chât nền khơng hịa tan, được nhồi vào trong các cột sắc ký.
Phương pháp này rất hữu dụng do cĩ tính đặc hiệu cao, ví dụ việc tách 1 peptide nào đĩ cĩ mặt với nồng độ thấp trong 1 dung dịch sinh học hoặc dịch chiết của tế bào.
Kháng thể thường được dùng để tách và tinh sạch kháng nguyên tương ứng. Trái lại cũng cĩ thể tách kháng thể nào đĩ bằng cách dùng kháng nguyên cố định trên cột.
Phương pháp điện di mao quản (capillary electrophoresis – CE): hiện nay được sử dụng rộng rãi để tách các peptide và protein, bao gồm cả các protein tái tổ hợp.
Xét về mặt lý thuyết, tất cả các phương pháp điện di (CE, ITP-isotachophoresis: điện di đẳng tốc, IEF-isoelectric focusing: điện di đẳng điện), đều cĩ thể được tiến hành với cột mao quản, trên cùng 1 loại thiết bị điện di. Hiện nay phương pháp điện di mao quản được sử dụng phổ biến nhất là phương pháp điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis- CZE). Khi áp đặt điện áp, hai hoạt động điện động sẽ xảy ra dưới tác động của điện trường, đĩ là sự điện di và sự điện thẩm (electroosmotic flow-EOF, đĩ là sự di chuyển của 1 lớp chất lỏng cĩ điện tích dưới tác dụng của điện trường).
Chịu tác động đồng thời của quá trình điện di và điện thẩm, các phần tử trong
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
mẫu mang điện tích dương, điện tích âm hoặc trung hịa về điện sẽ di chuyển về phía catode với vận tốc khác nhau. Các phần tử mang điện tích dương sẽ đến catode nhanh nhất, hay nĩi cách khác, peak của các cation trên điện di đồ sẽ xuất hiện trước EOF. Các anion cĩ linh độ điện di nhỏ hơn EOF sẽ ra sau EOF và các anion cĩ linh độ điện di lớn hơn EOF sẽ khơng phát hiện được vì di chuyển về phía anode. Các phần tử trung hịa về điện sẽ đi cùng với EOF và xuất hiện trên điện di đồ ở cùng vị trí của EOF.
Lượng mẫu được sử dụng khi tách thường rất nhỏ (dưới 20nl), do đĩ sẽ rất khĩ khăn nếu muốn phát hiện những thành phần cĩ tỉ lệ nhỏ trong 1 hỗn hợp phức tạp, chính vì vậy, trước khi phân tích ta cần phải làm giàu thành phần cần phân tích trong mẫu (bằng các phương pháp xử lý sơ bộ ở phần 4.1).
Sắc ký rây phân tử (size-exclusion chromatography: SEC): là phương pháp tách dựa trên sự khác nhau về kích thước phân tử của các chất.
Người ta cho dung dịch phân tích đi qua các vật liệu cĩ khả năng tạo thành bộ khung gel hoặc các rây phân tử. Pha tĩnh trong sắc ký gel là dung mơi ở trong các lỗ của gel, cịn pha động cũng chính là dung mơi chạy qua. Nĩi cách khác, pha tĩnh và pha động cũng chính trong sắc ký gel được cấu tạo từ 1 chất hay từ 1 hỗn hợp các chất
Các phân tử cĩ kích thước lớn hơn lỗ gel khơng hấp phụ lên gel mà chỉ khuếch tán vào các khe hở giữa các hạt rắn xốp, cịn các phân tử cĩ kích thước bé hơn cĩ thể đi xuyên vào các lỗ của gel vào sâu bên trong. Khi pha động đi ngang qua, các phân tử sẽ được rửa giải ra khỏi gel theo thứ tự khác nhau. Các phân tử cĩ kích thước lớn hơn lỗ gel sẽ theo pha động đi ra đầu tiên, các phân tử cĩ kích thước bé nhất sẽ đi ra sau cùng. Đối với các phân tử cĩ cấu trúc khơng gian gần giống nhau, thứ tự rửa giải sẽ giảm theo chiều giảm trọng lượng phân tử.