Nguyên tắc:
Dùng protease cĩ tính đặc hiệu phù hợp để thủy phân protein, từ đĩ thu được hỗn
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
hợp các peptide. Hỗn hợp peptide sau đĩ sẽ được tách và tinh sạch để thu được peptide mong muốn.
Theo Haileselassie và cộng sự (1999) thì trong phân tử peptide nếu cĩ chứa càng nhiều gốc proline thì peptide này sẽ càng cĩ nhiều khả năng kháng lại sự tấn cơng của các enzyme thủy phân.
Người ta cĩ thể kết hợp quá trình thủy phân và tách trong cùng một thiết bị: tiến hành thủy phân trong thiết bị phản ứng membrane. Trong thiết bị này, sự thủy phân protein đi kèm với việc tinh sạch các peptide từ hỗn hợp các sản phẩm nhờ quá trình lọc (hoặc kết tủa). Ngồi ra, do enzyme được giữ lại trong hệ thống nên làm cho hệ thống cĩ thể dễ dàng vận hành liên tục. Việc sử dụng màng siêu lọc (1-100nm hoặc MWCO 500-100000 Da) phù hợp cho việc giữ lại hầu hết enzyme (Prazeres và Cabral, 1994). Việc tách 1 peptide cụ thể nào đĩ từ hỗn hợp sau phản ứng thì buộc ta phải sử dụng enzyme cĩ tính đặc hiệu cao, giải phĩng các peptide mong muốn 1 cách nhanh chĩng, đồng thời các peptide cĩ phân tử lượng khác nhau sẽ được tách rời chọn lọc nhờ màng siêu lọc.
Ưu điểm chính của thiết bị phản ứng membrane: Năng suất cao do hoạt động liên tục
Khống chế sự chuyển hĩa của sản phẩm
Điều chỉnh phân tử lượng của sản phẩm thủy phân
Nhược điểm chính của phương pháp này: sự giảm năng suất theo thời gian do sự tăng nồng độ của các chất tích điện, sự vơ hoạt của enzyme (Perea và Ugalde, 1996).
Sự thủy phân casein glycomacropeptide bởi trypsin đã được thí nghiệm trong thiết bị này. Một màng siêu lọc với MWCO 3000Da tách những peptide nhỏ từ thiết bị, đồng thời, cơ chất mới được cho vào thiết bị với tốc độ phù hợp. So sánh với thiết bị phản ứng theo mẻ thì thiết bị này cho năng suất cao hơn 3 lần sau 3.5 giờ tiến hành thủy phân. Tuy nhiên lượng CMP được thủy phân thì chỉ khoảng 50%, do đĩ cần phải tối ưu hĩa nồng độ cơ chất và lưu lượng cho vào thiết bị (Bouhallab et al., 1992). Một nghiên cứu tương tự, immunomodulatory peptide β-casein (193-209) được phân tách từ việc thủy phân β-casein bởi chymosin. Khi thiết bị sử dụng màng lọc membrane làm từ
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
cellulose thì việc vận chuyển của peptide qua màng sẽ dễ dàng hơn (Bouhallab et al., 1993).
Khi tiến hành thí nghiệm gián đoạn (theo mẻ), người ta thu được 1 số oligopeptide cĩ phân tử lượng từ 1000Da trở xuống khi cho phần lịng đỏ trứng gà thủy phân bởi enzyme Newlase F thơ và sau đĩ cho lọc bằng màng lọc bán thấm (semi-permeable membrane filter). Trong những nghiên cứu sau đĩ, người ta nhận thấy các oligopeptide này cĩ khả năng làm ngăn chặn hiện tượng tăng huyết áp ở SHR (Yoshii et al, 2001).
Sử dụng thiết bị phản ứng siêu lọc 3 cấp, người ta đã thu được các peptide ức chế ACE bằng cách thủy phân gelatin lấy từ da bị và Alaska Pollack bởi alkalase, pronase E và collagenase.
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
Hình 3.8: Sơ đồ thiết bị phản ứng membrane ba 3 bước (three-step) tuần hồn để sản xuất sản phẩm thủy phân của gelatine.
TI: temperature indicator (nhiệt kế); PI: pressure indicator (áp kế); FI: flow indicator (lưu lượng kế); P1: recycling pump (bơm tuần hồn); P2: feed pump; P3: NaOH pump (bơm NaOH); PCV: pressure control valve (van điều chỉnh áp suất); pHIC: pH indicator controller; FH: first hydrolysate (sản phẩm thủy phân bước thứ nhất); SH: second hydrolysate (sản phầm thủy phân bước thứ 2); TH: third hydrolysate (sản phẩm thủy phân bước thứ 3) (Byun và Kim,2001).
Thiết bị phản ứng siêu lọc tính từ thiết bị phản ứng thứ nhất đến thứ 3 thì giảm dần MWCO từ 10kDa đến 5kDa rồi 1kDa. Sự kết hợp các enzyme khác nhau cho ta mức độ thủy phân sâu sắc hơn. Lượng peptide ức chế ACE càng tăng trong sản phẩm thủy phân nếu ta giảm MWCO của membrane. Đối với gelatin lấy từ da của Alaska Pollack thì giá trị IC50 của sản phẩm thủy phân ở thiết bị phản ứng thứ 3 (0.63mg/ml) lớn gấp đơi so với sản phẩm thủy phân của thiết bị phản ứng thứ nhất (1.4mg/ml). Sản phẩm thủy phân ở thiết bị phản ứng thứ 3 cĩ chứa các peptide ức chế ACE là Gly-Pro- Met và Gly-Pro-Leu (Byun và Kim, 2001). Đối với gelatin lấy từ da bị, giá trị IC50 tương tự cũng được phát hiện, ngồi ra thu được 2 peptide ức chế ACE (khi người ta tinh sạch các sản phẩm thủy phân ở thiết bị phản ứng thứ 3) là Gly-Pro-Val và Gly-Pro- Leu (Kim, 2001).
Trong tài liệu [25], người ta đã sử dụng quá trình siêu lọc 2 cấp để tách sản phẩm thủy phân:
Nguồn protein: whey protein. Whey protein concentrate (WPC, 35% protein) hoặc
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
whey protein isolate (WPI, 94% protein) cĩ được nhờ quá trình sắc ký trao đổi ion (BiPRO, Davisco Foods International, LeSueur, MN) được sử dụng làm nguồn protein cho nghiên cứu này.
Điều kiện thủy phân: Trypsin (Type III-S và Type XIII của Sigma, hoặc PTN 6.0S của Novo Nordisk) và chymotrypsin (800S oral grade của Novo Nordisk) được sử dụng là enzyme thủy phân (sử dụng riêng). Hai enzyme này cĩ tính đặc hiệu đối với cơ chất khác nhau. Trypsin thủy phân tại đuơi C cuối của gốc Arg và Lys (2 amino acid cĩ tính base), trong khi đĩ chymotrypsin thủy phân tại amino acid cĩ gốc thơm hoặc chuỗi khơng phân cực (kị nước) (Phe, Tyr, Trp, Leu, Met). Đối với cả 2 enzyme, phản ứng thủy phân được thực hiện ở pH 8.0 và nhiệt độ từ 42-45oC, và kỹ thuật pH-stat (duy trì pH) được sử dụng để duy trì pH tối thích cho enzyme.
Quá trình siêu lọc (UF) 2 cấp:
Hình 3.9: Quá trình siêu lọc 2 cấp được đề nghị bởi Turgeon và Gauthier (1990)
Phương pháp này tiếp tục được nghiên cứu thêm. Đầu tiên, dung dịch sau thủy phân được cho qua membrane 30kDa để loại enzyme và những protein khơng bị thủy phân, phần này được gọi là retentate hoặc reaction mixture, trong khi đĩ phần đi qua màng lọc (permeate) được gọi là total hydrolysate (TH). Phần TH này sẽ được tiếp tục cho đi qua membrane 1kDa, khi đĩ phần retentate sẽ chứa hỗn hợp các peptide, cịn
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
phần permeate sẽ chứa các amino acid. Những peptide này sẽ tiếp tục được đưa đi phân tích để đánh giá tính chất của chúng.
Quá trình tách các peptide:
Nĩi chung, đầu tiên phần peptide sẽ được phân tách bởi quá trình sắc ký trao đổi ion (cation hoặc anion) hoặc bởi ampholyte-free isoelectric focusing (Rotofor cell, Bio- Rad Laboratories, Hercules, CA) để cĩ được các phần peptide cĩ tính chất khác nhau, thuận lợi cho quá trình xác định tính chất sau này. Sau đĩ những phần peptide này sẽ được phân tích bằng RP-HPLC sử dụng cột C18 (Nova-Pak, 3.9 i.d. x150 mm, Waters, Milford, MA). Quá trình rửa giải được tiến hành theo gradient tuyến tính (0 đến 60%) của dung mơi acetonitrile : nước : TFA (60 : 40 : 0.1%) và lưu lượng 1 ml/phút. Sử dụng bước sĩng hấp thụ ở 214nm. Peak peptide chính được thu lại, sấy trong Speed-Vac concentrator, sau đĩ được đem đi thủy phân (trong điều kiện chân khơng) bằng HCl 6N trong 24h ở 110oC trong Pico-Tag station (Waters). Amino acid được tạo dẫn xuất với phenyllisothiocyanate theo phương pháp của Bidlingmeyer (1984). Kết quả phân tích thành phần amino acid sẽ cho ta biết về cấu tạo của peptide thu được.
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
Bảng 3.6: Một số peptide xác định được khi thủy phân whey protein
1Turgeon et al., 1992a; Nadeau, 1995; Barbeau et al., 1996; Wijers et al., 1998; Pouliot et al., 1999, 2000; Persaud et al., 2000; Lajoie, 2001.
2Phân tử lượng và điểm đẳng điện được tính từ ExPaSy.
3Độ kị nước (hydrophobicity) trung bình được tính theo phương pháp Bigelow (1967)
4Các peptide cĩ được do bị thủy phân bởi chymotrypsin. 5Các peptide cĩ tạo cầu disulfide.
Trong thí nghiệm này người ta thấy hầu hết các peptide cĩ được thì cĩ nguồn gốc từ β −LG, chỉ cĩ đoạn 105-108 cĩ từ β −LA (mặc dù β −LG chỉ chiếm 15% WPI). Ngồi ra, trong bảng cĩ 1 số peptide cĩ mặt do sự thủy phân bởi chymotrypsin, điều
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
này cho thấy trong sản phẩm trypsin thương mại cũng cĩ mặt chymotrypsin.
Bảng 3.7: Sản phẩm thủy phân của whey protein bởi chymotrypsin
1Sản phẩm thủy phân cĩ bởi chymotrysin 800S oral grade của Novo Nordisk. 2Phân tử lượng và điểm đẳng điện được tính từ ExPaSy.
3Độ kị nước (hydrophobicity) trung bình được tính theo phương pháp Bigelow (1967)
4Các peptide cĩ được do bị thủy phân bởi trypsin.
Nếu theo lý thuyết thì sẽ cĩ hơn 35 loại peptide được giải phĩng, tuy nhiên thí nghiệm này đã khơng phát hiện được tất cả các peptide. Lý do cĩ thể là chúng cĩ nồng độ quá thấp hoặc ở bước sĩng 214nm thì chúng quá bé để cĩ thể phát hiện được.
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
Chương 4:
TINH SẠCH CÁC PEPTIDE
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học
ể thực hiện bất cứ quá trình tách thu nhận chế phẩm nào thì việc nghiên cứu việc tinh sạch ở mức độ phân tích luơn là bước đầu tiên, nĩ dùng để tối ưu hĩa quá trình tách thu nhận chế phẩm.
Đ
Dù peptide được tạo bằng phương pháp nào thì nĩ cũng cĩ lẫn tạp chất, muốn cĩ được sản phẩm cĩ hàm lượng peptide cao thì ta phải trải qua quá trình tinh sạch
Ta cĩ thể chia làm 2 mức độ tinh sạch:
Mức độ phân tích (analytical level): dùng để phân tích định tính, định lượng các cấu tử trong mẫu
Mức độ tách chế phẩm (preparative level): dùng để tách, làm sạch và thu nhận các cấu tử.
Quá trình tinh sạch này tốn rất nhiều thời gian và cơng sức. Quá trình tinh sạch khơng hiệu quả cĩ thể dẫn đến những kết luận sai lầm. Những gốc như Trp, Met, Gln ở đầu N, và Cys được biết như là những nguyên nhân gây ra những phản ứng khơng mong muốn trong quá trình thực hiện các phản ứng, thao tác hay bảo quản. Cys, Met và Trp dễ bị oxi hĩa. Sự oxi hĩa Cys và Met thường là thuận nghịch, cịn Trp thì khơng thuận nghịch. Gln ở vị trí đuơi-N của chuỗi peptide cĩ khả năng hình thành cấu trúc lactam, thường được gọi là pyroglutamte. Thơng thường người ta phân biệt thành petide “thơ” và peptide “tinh sạch”. Peptide tinh sạch được chia ra làm 3 mức độ: đồng nhất (homogeneous), rất tinh sạch (very pure), tinh sạch mức độ sắc ký (chromatographically pure). Đối với các ứng dụng khác nhau thì người ta sử dụng peptide với các mức độ tinh sạch khác nhau. Ví dụ, polyclonal antisera sử dụng như là kháng nguyên thì cần mức độ tinh sạch thấp; cịn peptide được sử dụng để nghiên cứu về tính chất, cấu tạo và hoạt tính sinh học của nĩ thì cần phải cĩ mức độ tinh sạch rất cao.
Hầu hết việc tinh sạch protein hay peptide liên quan tới rất nhiều giai đoạn. Đầu tiên, thơng thường người ta sẽ tách chọn lọc bằng phương pháp kết tủa, siêu lọc, sắc ký hoặc trích ly pha rắn để cĩ được một hỗn hợp (giàu peptide mong muốn hơn ban đầu). Hỗn hợp này sau đĩ sẽ tiếp tục được tinh sạch (thường sử dụng phương pháp RP- HPLC) để cĩ được peptide mong muốn.
Tổng quan về peptit cĩ hoạt tính sinh học