Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Phân lập và đánh giá khả năng đối kháng nấm Colletotrichum gloeosporioides của nấm men có trong vỏ xoài cát hòa lộc sau thu hoạch

TÓM TẮTĐề tài “Phân lập và đánh giá khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum gloeosporioides của nam men có trong vỏ xoài Cát Hòa Lộc sau thu hoạch” được thựchiện nhằm xác định sự có mặ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

PHAN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG DOI KHÁNG NAM Colletotrichum gloeosporioides CUA NAM MEN CÓ TRONG VO

XOAI CAT HOA LOC SAU THU HOACH

Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOC

Sinh viên thực hiện =: HÀ KIEU ANH

Mã số sinh viên : 18126002

Niên khóa : 2018 - 2022

TP Thủ Đức, 08/2023

; BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

-KHOA -KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

PHAN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ KHA NĂNG ĐỐI KHÁNG NAM Colletotrichum gloeosporioides CUA NAM MEN CÓ TRONG VO

XOAI CAT HOA LOC SAU THU HOACH

Hướng dẫn Khoa học Sinh viên thực hiện

ThS ĐÀO UYEN TRAN DA HA KIÊU ANH

ThS TRAN THI THU HA

TP Thu Đức, 08/2023

LỜI CẢM ƠN

Quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp được xem la một cột mốc quan trọng củacuộc đời sinh viên, đó là giai đoạn đánh giá kết quả học tập của người sinh viên trongsuốt những năm tháng đại học, luận văn tốt nghiệp sẽ là tiền đề nhằm trang bị cho emnhững kỹ năng nghiên cứu, những kiến thức quý báu trước khi bước vao chặn đườngtiếp theo của mình mang tên “Đường đời”

Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu Trường ĐHNông Lâm TP HCM, quý thầy cô khoa Khoa học Sinh học đã cung cấp những kiến thứccần thiết và tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài này

Em xin gửi lời cảm ơn đến hai người cô hướng dẫn của em là ThS Đào UyênTrân Đa và ThS Trần Thị Thu Hà đã giúp đỡ, chỉ dẫn tận tình, luôn bao dung và tạomọi điều kiện cho em hoàn thành khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn anh Trần Trọng Nghĩa và chị Vũ Ngọc Khánh Như,anh chị đã tận tình giúp đỡ và truyền đạt những kinh nghiệm, kiến thức của bản thântrong học tập và cả trong đời sống dé giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tải

Cảm ơn những người bạn, những người em đã hết lòng giúp đỡ hỗ trợ, động viên

tôi trong suốt thời gian làm đề tài

Cuối cùng, con xin cảm ơn ba mẹ và mọi người trong gia đình đã ủng hộ yêu

thương và luôn là chỗ dựa cho con trong tất cả mọi việc

Tuy đã cố gắng thực hiện dé tài nhưng do còn thiếu kinh nghiệm thực tiễn mà nộidung bài nghiên cứu khó tránh khỏi có thiếu xót, em rất mong nhận được sự góp ý củaquý thay cô đề có thé hoàn thiện đề tài của mình tốt hơn Em xin chân thành cảm ơn

XÁC NHAN VA CAM DOAN

Tôi tên Hà Kiều Anh, MSSV: 18126002, Lớp: DHI8SHD thuộc ngành Côngnghệ Sinh học Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây là Khóaluận tốt nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên

cứu là hoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước

Hội đồng về những cam kết này

Tp Hô Chi Minh, ngày 31 tháng 07 năm 2023

Người viết cam đoan

Hà Kiều Anh

il

TÓM TẮT

Đề tài “Phân lập và đánh giá khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum

gloeosporioides của nam men có trong vỏ xoài Cát Hòa Lộc sau thu hoạch” được thựchiện nhằm xác định sự có mặt của các dòng nam men có trong vỏ xoài Cát Hòa Lộcđồng thời tìm ra dòng nắm men có khả năng ức chế nam Colletotrichum gloeosporioidesgây bệnh than thư trên trái xoài sau thu hoạch 30 mẫu xoài Cát Hòa Lộc đã được thuthập từ nhà vườn tại thành phố Cao Lãnh, tinh Đồng Tháp , phân lập được 13 dòng nammen và nam C gloeosporioides, dựa vào các đặc điểm hình thái và sinh hóa các dòng

nam men được chia làm 6 nhóm và dòng nam gây bệnh là nam C gloeosporioides gây

bệnh thán thư trên xoài Thí nghiệm đối kháng thực hiện trong phòng thí nghiệm trong

10 ngày, thu được 6 dòng nam men có khả năng ức chế sự phát triển của nam C.gloeosporioides cao nhất của từng nhóm đem gửi mẫu giải trình tự, kết quả thu được 4

loài nắm men đó là Hanseniaspora thailandica, Hanseniaspora oputiae, Piachia barkeri

va Candida tropicalis Trong đó nam men có khả năng đối khang cao là Candida

tropicalis (54,4%) và Piachia barkeri (44,7%).

Từ khóa: Nấm men trên xoài, kha năng đối kháng, nắm Colletotrichum

gloeosporioides, Hanseniaspora, Pichia, Candida.

1H

The study " Isolation and evaluation of yeast's ability to antagonize

Colletotrichum gloeosporioides in post-harvest Cat Hoa Loc mango peel" was carried out to determining the presence of yeast species present in the skin Cat Hoa Loc mango, and the same time, found a yeast strain capable of inhibiting the fungus Colletotrichum gloeosporioides that causes anthracnose in mangoes The 30 samples of Cat Hoa Loc mango were collected from growers in Cao Lanh city, Dong Thap province, obtained

13 yeasts and C gloeosporioides, based on the morphological and biochemical characteristics that the yeast divided into 6 groups and the isolated pathogenic fungus is

C gloeosporioides causing anthracnose disease on mango Antagonist experiments were carried out in the laboratory for 10 days and obtained 6 yeasts strains with the

highest ability to inhibit the growth of C gloeosporioides of each group sending samples

for sequencing, the results obtained four species of yeasts are Hanseniaspora thailandica, Hanseniaspora oputiae, Piachia barkeri and Candida tropicalis Among them, yeasts with high antibiotic resistance are Candida tropicalis (54.4%) and Piachia barkeri (44.7%).

Keywords: Mango yeast, antagonistic ability, Co/letotrichum gloeosporioides, Hanseniaspora, Pichia, Candida.

Iv

MỤC LỤC

; Trang

TOM TAT ooo cccccccsscessesssessesseessessesssessessessssessissssesiessessssssesasssessesssesstsatsnsessessiessesaeseeees iii

| ae iv 10/9092 ÔÒÔÒ v

DANH SÁCH CHỮ VIET TAT ccccsscsscssessessessesssssvesvessssessvsssssssssssssssssssssseaeseaeeees ViiPhe T nnrnenossebneeeiogoiobobkcGiGOGS0n,G005000010008080 030000309800 gi viiiDANH SÁCH CÁC HÌNH -2©22222222221221122122112112211211211211211211211211211 12 xe ix

CHƯƠNG 1 MO DAU ooo csscecscsssssessseessssssueessesuessssssesisssssssstisesussisssssussseceteeseeseseseeees |

1.1 Đặt vấn đề - + s2 2 12212112112121121111211211112111111112112111211111211 221 ce |

OE , 3

1.3 NOE dung G6 tat 8 4 2

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIBU 2-5522522EE+2EzEEezEezrserszrsrrsrrsesrxcr -3

2.1 Giới thiệu chung về nắm MeN eececceecceeceesssessesssessessseesesseessesseessesseestsssesseestessees 3

; 8t»; ẩn c8 16: 0 Ẻ7Ẻ.7 42.3 Cấu tạo của nấm men 2-2 %SS£SE92E9EE9EE9219212121171171121121121111121121121 212 c0 52.4 Ung dumg ctia on aẽăắảỘỎOỪOẠ+ 62.5 Giới thiệu về bệnh than thư trên Xxoài - 2-2 2 +S2+E22E£EE2EE2E+EE2EE2E2E2EEZEcrxzer 72.6 Sơ lược về nam Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh than thư 9

22s INDUS ñEHISH CIN (ONE VAT BOA MIG sosessseeinnneinddindrBoadgaoiDddlGlGE000005024800/860037685 10 2/1, Các 1rphiÊn cứu ÍTOTIH:THỂU:¿::<s:sxsscspestixc2E14016316618508054G1501656k5sLSG6GG1488k00248855L3058508 10 2.7.2 Các nghiên cứu ngoai NGC - - +: cece %2 E1 E9E*EE2E2 SE 1111110111 rệt 10

CHƯƠNG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP -2- 5+ ©5222z+2xc2z+zrxeez 113.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - 2 22+2+2E+2E+2EE+EE+2EEEEE+2EEzExzrrerxees 11

3.2 Vat Liew Tie hi6n el ersessn sean cureneenaveusunmaceninen mimes G35838810486.)4g010208./04,8 11

3.2.1 Thiết bị và dụng Cụ - 5-52 522222122525221211212212112121211212121121112121212 re, 113.2.2 Hóa Chat eo cec cee ccccesessessessessssssssssnessssnsssessssnssnessesnssnsssssussnsssssnssssssssssesesseeeeaee 11

3„3„-HữGØ PHáP TEHIỂT (GỮ Na csssncnncesmensrmmreennemnar naam 12

3.3.1 Phân lập và định danh nam Colletotrichum gloeosporioides dựa vào đặc điểm

HÌNH THÁI básceegssseabssbitibisasiG84381386491959/805L58G0853536G3SS3SSĐISSSSESEIS.AG1ESEBSISSSE1SH048088330503079851438 12

3.3.2 Phân lập và định danh nam men dựa vào đặc điểm hình thái và các phản ứng

SINH DOS ko ngang te nhG1AEBENhESASHSNSABGRGESERSASNEAGESGESSISSSATGKSSNS.GESSS/S3B.2HSSHNGESIMESAEAGISEEENSIES0E58E/G5ĐA 13

BA XU LY 0:87 434 15

CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN -2©22¿©2222E+zE2EE+rxczreerxeee 16

4.1 Phân lập và định danh nắm Colletotrichum gloeosporioides dựa vào đặc điểm

010071015 16

4.1.1 Phan lập Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh trên trái xoài sau thu hoạch

ln seg eb pea gen NESE tem Ete eH ARR em ie Pe ESET SRR ESET 16

4.1.2 Định danh nam Collletotrichum gloeosporioides dựa vào đặc điểm hình thai 164.2 Phân lập và định danh các dòng nắm men dựa vào đặc điểm hình thái và các phản

4.2.1 Phân lập các dong nắm men trên vỏ xoài Cát Hòa Lộc 2- 2-5552 184.2.2 Định danh các dòng nam men dựa vào đặc điểm hình thái và các phản ứng sinh

HO rnc eit Sli tir ci rr i Se a toe ere 18

4.3 Đánh giá khả năng đối khang giữa các dong nam men và nam Colletotrichumgloeosporioides trong phòng thí nghiỆm 0 1222122112 1211 SErrkererrrrrkrrke 27

CHUONG 5 KET LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ 2- 2+2+E2EE2E2E2EEEEE2EEEEEEE2EExcExrree 32

Be Se Ẽ 325,2 Đề nghị 25-22 22122121121221211211212112111211211110121121112112111211211222122 re 32TAT LU pášš£ 4: 000155

PHỤ LỤC

VI

DANH SÁCH CHU VIET TAT

PGA : Potato Glucose Agar

YPGA : Yeast extract Petone Glucose Agar

YPG : Yeast extract Petone Glucose

Vil

DANH SÁCH CÁC BANG

Trang

Bảng 3.1 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR - 5 252222 eee eeeeeeteeseeeeeeeees 15

Bang 4.1 Mô tả hình thái nam Collletotrichum gloeosporioides 2-52 17Bang 4.2 Đặc điểm hình thái của 13 dòng nấm men -. -2- 52552522552 19Bang 4.3 Phân nhóm các dòng nắm men 2-2: 2©2222222E22E22EZ2EE22E+22Ecz2z2 20Bang 4.4 Kết quả phản ứng sinh hóa của 13 dong nắm men 2 22522522522 25Bảng 4.5 Phân nhóm nắm men dựa vào đặc điểm hình thái và các phản ứng sinh hóasal rs ed wt a a eu lain tab cin Uae a RR UN dae alti ase 0018 00 naam rian 27Bảng 4.6 Ty lệ đối kháng của 13 dong nam men đối với nam Colletotrichum

gloeosporioides qua các ngày theo dỗõi - cà SH re 28

Bang 4 7 Tỷ lệ đối kháng của 6 dòng nắm men 2- 2: 2222222222E+z£E222zzzzz++ 30

Bang 4 8 Kết quả so sánh độ tương đồng các dòng nam men với dữ liệu trên NCBI

Vill

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

huấn 5.1: Tin tae bẫu tWUHHEHssessoeaiodhtissoisdduiiliRGilSngSii8G03001080003610810g.G038Ú 4Hình 2.2 Cấu tạo tế bào nắm men 2 2+ Ss+S2E£EE£EE2EEE121123212112121211211111 212 Xe 5

Hình 2.3 Triệu chứng bệnh than thư trên Xxoài - - 55 552222 *++2*£++££++eeezseeezess 8

Hình 4.1 Mẫu xoài bệnh thu thập được -+- 2-52 5+222222222E+2E££EzE+zEzxzzrzrrred 16Hình 4.2 Đặc điểm hình thái nam Colletotrichum gloeosporioides -. 17Hình 4.3 Mẫu xoài Cát Hòa Lộc thu thập được ¿- ¿252252 ++2++z+zxzzzzrzxzrs 18Hình 4.4 Hình đĩa ria khuẩn lạc đơn của 6 nhóm nam men 2: 22 22 222 20Hình 4.5 Hình thái khuẩn lạc của 6 nhóm nam men 22 2+S2+££££zE2z£z£zzzz 21Hình 4.6 Hình thái tế bao của 6 nhóm mam men - 2-22 2+222£22E2+E2E22z22222+2 21Hình 4.7 Kết quả phản ứng lên men đường Glucose - 2: 2¿©2222+222++22+z2 22Hình 4.8 Kết quả phản ứng lên men đường Sucrose 2- 2 22+2z+2z222zz2+z>zz 22Hình 4.9 Kết qua phản ứng lên men đường Lactose 2: 2¿522222z22z+2zz>+2 23Hình 4.10 Kết quả của phản ứng citrafe 2- 2 22222222222EE2EE2EE2E222222222222zczxe2 23Hình 4.11 Kết qua phản ứng urc 2-©22©222SS2E2EE22E2EE£EE22EE2232221221222222 22x 24Hình 4 12 Kết quả đối kháng giữa các dòng nam men với nam Colletotrichum

\6l108GSTTGRIGIGS GRII TU TỒN: saanaaainbtgnditiCGOUBAGGEGESRSSYSRGSGHSSSĐN/0/NRG3VESSIA-SGSEA43G10%3.ĐĐA 4/5/7388 29

Hình 4.13 Kết qua PCR của 6 dong nam men với cặp mỗi NL1/NLA4 30

1X

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Xoài Cat Hòa Lộc thuộc chi Mangifera indica L., họ Đào lộn hột, là loại trai cây

có vị ngọt thanh, mùi thơm ngảo ngạt đặc trưng Theo cục nông nghiệp Hoa Ky, trong

xoài có chứa nhiều loại vitamin như vitamin C, E, A, K, Bó, các khoáng chất phospho,

kali, kém, va các chất xơ mang lại rất nhiều lợi ít cho cơ thể Chính vì những yếu tổtrên mà năm gần đây giống xoài này đang rất được mọi người trên thế giới chào đón và

là giống xoài được xuất khẩu nhiều nhất trong các loại xoài ở nước ta Việt Nam là một

nước nông nghiệp hội tụ nhiều lợi thế về vị trí địa lý, khí hậu thích hop dé trồng xoài

Theo tổng cục thống kê Việt Nam, tính đến tháng 6 năm 2022 thì sản lượng xoài đạt590,6 nghìn tan, tăng 1,3% so với cùng kỳ năm trước Tuy nhiên, thực tế số lượng xoàitươi ở Việt Nam được xuất khâu ra nước ngoài có tăng nhưng lại không cao và gặp nhiềuhạn chế và nguyên nhân chủ yếu là do giai đoạn bảo quan trái xoài, trái xoài sau khi thuhoạch sẽ có sự thay đôi đột ngột về hô hấp và sự thay đôi về sinh lý, sinh hóa trong quátrình chín, giảm dần các hợp chất resorcinol (Kobiler và cộng sự, 1998), hợp chất này

suy giảm chính là lý do dé một số loài nắm đã tồn tại trên trái xoài trước đó phục hoạt

và phát triển, gây ra các triệu chứng trên trái rõ rệt, làm giảm chất lượng dinh dưỡngcũng như giá trị thương phẩm của trái xoài, trong đó bệnh than thư do namColletotrichum gloeosporioides gây ra chính là bệnh phô bién và gây thiệt hại nghiêmtrọng nhất Triệu chứng ban đầu của bệnh đó là trên vỏ xoài xuất hiện các đốm nâu đennhỏ, nếu không phát hiện kịp thời thì các đốm nhỏ phát triển dần, có thể liên kết vớinhau, lan rộng trên bề mặt vỏ xoài, gây thối quả Dé lam giam tan suất xuất hiện bệnh

thán thư trên trái xoài sau khi thu hoạch, người ta đã sử dụng các biện pháp xông hơi

nước nóng, xông khí SOa, chiếu xa dé điệt các vi sinh vật gây bệnh nói chung và nam

Colletotrichum gloeosporioides nói riêng Tuy nhiên, các biện pháp này rất khó kiểm

soát thời gian thực hiện do từng vùng khác nhau thì trái xoài sẽ có sự phát triển riêngnếu tác động của nhiệt độ các tia cực bức xạ giống nhau có thé làm cho các chất dinhdưỡng trong quả xoài bị giảm hay biến tính, quả xoài không còn giữ được nguyện vẹn

hương vị ban đầu hoặc không thể kiểm soát được trái xoài khỏi nắm Colletotrichum

gloeosporioides gây bệnh.

Trước các van đề trên cần đưa ra giải pháp dé bảo quản xoài tránh sự gây hại của

nam Colletotrichum gloeosporioides vừa phải đảm bảo giữ nguyên hàm lượng dinh

dưỡng trong xoài cũng như hương vị nguyên ban của quả Đề tài: “Phan lập và đánh giá

kha năng đối kháng với nam Colletotrichum gloeosporioides của nam men có trong vỏ

xoài Cát Hòa Lộc sau thu hoạch” được đề xuất và thực hiện Việc sử dụng thành phầnnam men có sẵn trên vỏ quả xoài dé ức chế sự phát triển của nam Colletotrichum

gloeosporioides gay bệnh than thư trên xoài sau thu hoạch sẽ là một giải pháp mới gop

phần trong việc bảo quản trái xoài sau thu hoạch

1.2 Mục tiêu đề tài

Xác định thành phần nắm men có trong vỏ xoài Cát Hòa Lộc và có khả năng đối

kháng với nam Colletotrichum gloeosporioides

1.3 Nội dung đề tài

Phân lập và định danh nam Colletotrichum gloeosporioides dựa vào đặc điềm

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Giới thiệu chung về nắm men

Nam men là những vi nam có cau tạo đơn bào hay các tập hợp đơn bào, là namsinh sản vô tính bằng phương thức nảy chéi hay phân hạch Nam men phát triển nhanh,trong tế bảo nấm men chứa nhiều vitamin, acid amin không thay thé và hàm lượngprotein cao Nắm men không tạo thành một nhóm phân loại duy nhất, tuy nhiên có théphân biệt nấm men thông qua ngành: nganh Ascomycota và ngành Basidiomycota(Lương Đức Phẩm, 2009) Hiện nay đã có hơn 1000 loài nắm men đã được nghiên cứu

và mô tả.

Nam men sử dụng các hợp chất hữu cơ làm nguồn dinh dưỡng, là các vi sinh vậthiếu khí bắt buộc hoặc là các vi sinh vật ky khí Hiện nay người ta vẫn chưa thấy nammen nao thuộc loại ky khí bắt buộc Khi thiếu oxy, các loài nam men chuyền hóa các

carbohydrate thành carbon dioxide và ethanol hoặc acid lactic đề tạo ra năng lượng duy

trì sự sống của cơ thé Da số các loài nam men đều có khả năng sử dụng nguồn cácnguồn carbon từ đường monosaccarit và disaccarit, chỉ một số ít nắm men có thé chuyểnhóa đường polysaccarit dé lay nguồn carbon nuôi cơ thể, đồng thời sinh ra khí CO2.Nam men trao đổi chất thông qua quá trình lên men (nam men ky khí) hay qua quá trình

hô hap (nam men hiểu khí) Những loài nam men hiếu khí có khả năng sinh sinh khối

và nồng độ enzyme nhiều hơn những loài nắm men ky khí, nắm men ky khí khó hình

thành bào tử hơn nam men hiểu khí ( Lưu Chí Thắng, 2020)

Nắm men tổn tại trong môi trường tự nhiên như mô thực vật, trái cây, ngũ cốc,

lá, phân, đắt, dịch tiết của thực vật, các chủng nấm men có trên bề mặt trái cây có thê

lên men nhiều loại đường thành rượu và có thể chịu được nồng độ cồn cao ( Tika B

Kark và cộng sự, 2017).

Theo Nguyễn Lân Dũng (2010) nam men sinh san chủ yêu bằng hai hình thức đó

là sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính

Sinh sản vô tính: hình thức nảy chồi là hình thức sinh sản vô tính phổ biến củanam men, khi nam men trưởng thành sẽ hình thành một chuỗi nhỏ và phát triển dần, mộtphan nhân của tế bào mẹ được chuyền sang chéi, tách ra thành một nhân mới sau đóchổi hình thành vách ngăn sau đó chồi tach ra khỏi tế bào mẹ và trở thành một tế bàomới, tuy nhiên có một số dòng nắm men tế bào mới hình thành không tách ra khỏi tế

3

bảo mẹ mà tiếp tục dính trên tê bao mẹ và hình thành tế bao mới, chéi có thé moc theo

một hướng nhất định (nảy chồi một hướng) hay nảy chéi theo nhiều hướng Một số it

dòng nam men sinh san bằng cách phân chia tế bao như vi khuan, tế bào dài ra sau đósinh ra những vách ngăn đặc biệt và phân chia thành hai hay nhiều tế bào mới Điển hìnhcho hình thức sinh sản nay là các nắm men thuộc chi Schizosaccharomyces

Sinh sản hữu tính: khi trong điều kiện dinh dưỡng kém tế bào nấm men có thésinh sản bằng túi hay nang bảo tử, trong mỗi túi có chứa một hoặc nhiều bảo tử Túi bào

tử được sinh ra do sự tiếp hợp của hai tế bào nắm men Khi hai tế bào khác giới đứnggần nhau, ở mỗi đầu của hai tế bao sẽ mọc ra mấu lỗi và tiến sát vào nhau, hai tế bao sẽtiếp hợp với nhau và hình thành hợp tử, sau đó sẽ có quá trình phối nguyên sinh chất vàphối nhân tạo thành bao tử Bào tử gặp điều kiện thích hợp sẽ phát triển thành một tếbào nắm men mới Chi Saccharomyces và chi Hanseniaspora là hai ví dụ điền hình của

trường hợp này.

2.2 Đặc điểm hình thái

Nắm men có sự đa dạng về hình thái như hình cầu, hình oval, hình elip, hình bầu

dục hoặc có thể là hình dài Một số loài nắm men khi sinh sản bằng hình thức nảy chồi

thì chỗi con không tách ra khỏi tế bao mẹ và tiếp tục phát triển rồi tiếp tục hình thành

chéi mới, bằng cách này mà hình thành một chuỗi các tế bảo, gitra các tế bào có thắc eo được gọi là sợi nam giả, bên cạnh đó cũng có một số loài nấm men có khả năng hình

thành sợi nắm thật và có vách chéo

So với vi khuan thì tế bào nắm men có kích thước khá lớn, thường to gấp 10 lần

vi khuẩn, đường kính nắm men khoảng 7 um, chiều dai từ 5 — 10 pm, chiều rộng từ 3 —

5 um Tuy nhiên, nam men có thé thay đổi về hình thái và kích thước tùy thuộc vào cácgiai đoạn phát triển hay điều kiện môi trường xung quanh (Lương Đức Phẩm, 2009)

2.3 Câu tạo của nầm men

Hình 2.2 Cấu tạo tế bao nắm men

Tế bao nam men có thành phan và cấu tao khá phức tạp, nhưng nhìn chung thì

nắm men được cấu tạo chủ yếu bởi các thành phan sau:

Thành tế bào: thành tế bào là phức chất protein — polysaccharide, phosphate vàlipid tạo thành lớp màng đàn hồi và mang điện, thành tế bao dày khoảng 25 wm, chiếm25% khói lượng tế bao Thanh tế bào giúp bảo vệ tế bào trước các tác động bên ngoài

cũng như chất độc, bên cạnh đó thành tế bào còn có tác dụng giữ áp suất thâm thấu nộibào và điều chỉnh các chất dinh dưỡng đi qua các lỗ nhỏ vào bên trong tế bào

Màng tế bào chất: cấu tạo chủ yếu là protein, bao quanh tế bảo chất, là một lớpmàng rất mỏng, dày không quá 0,1 nm, có tác dụng như rào chắn thâm thấu, điều hòavận chuyển các chất dinh dưỡng ra vào tế bào, là nơi khu trú của một số enzyme

Chất tế bào: ở dạng keo, được cấu tạo chủ yếu bởi protein, lipid, chất khoáng,

nước và nhiều hợp chất khác, là môi trường cần thiết để tế bào hoà tan các chất dinhdưỡng, và cũng là nơi thực hiện các phản ứng sinh hoá.

Ty thể: được cấu tạo từ chất béo và protein, ty thé tham gia thực hiện các phảnứng oxy hóa giải phóng năng lượng khỏi co chất, chuyền thành năng lương có ich chohoạt động ống của tế bào.

Nhân tế bào: nhân tế bào là nhân thực, nhân tế bảo có màng vỏ, hạch nhân vàchất nhân, thành phần hóa học chủ yếu của nhân tế bảo nắm men là DNA, ngoài ra còn

có RNA, nucleprotein và các gen, do đó nhân đóng vai trò quan trọng trong sinh san di

truyền các tính trạng cho thé hệ sau

Các cơ quan con khác: ribosome, không bào, mạng lưới nội chất,

2.4 Ứng dụng của nắm men

Từ xa xưa nắm men đã có ý nghĩa rất quan trọng đối với đời sống con người, nắmmen hầu như có mặt trong mọi lĩnh vực từ khoa học, y tế đến các ngành công nghiệpliên quan đến thực phẩm Đối với các ngành công nghiệp truyền thống nắm men lànguyên liệu không thé thiếu trong các quá trình lên men các loại rượu, bia, bánh mì, phômai, Trong các ngành công nghiệp lâu đời thì nam men xuất hiện trong các quá trìnhsản xuất nhiên liệu ethanol, thức ăn chăn nuôi, Và gần đây nhất nam men đã được ứng

dụng trong việc sản xuất enzyme và các protein di hợp (Nguyễn Lân Dũng, 2010) Ngày

nay có rất nhiều nghiên cứu đã ứng dụng nắm men vào xử lý các tác nhân sinh học mang

lại ý nghĩa to lớn trong ngành nông nghiệp.

Một số ứng dụng mà nắm men đem lại cho con người trong hàng thế kỷ qua

Đồ uống có cồn: các đồ uống có cồn (hay đồ uống có chứa ethanol) đều được sảnxuất bằng quá trình lên men và đó chính là quá trình nam men chuyền hóa carbonhydrate

trong điều kiện ky khí hoặc trong điều kiện thiếu oxy

Làm bánh: nam men, đặc biệt là S cerevisiae là được xem là một nguyên liệu

không thé thiếu trong công đoạn làm bánh, bởi hầu hết các chủng S cerevisiae đều chịuđược nồng độ pH thấp, hàm lượng đường và nồng độ ethanol cao nhưng hiệu suất lênmen ở nhiệt độ trên 35°C khá thấp đều này giúp bột nở lên dé dang tạo độ mềm và xốpcho bánh Bên cạnh đó, nam S exiguus hay S minor, một loại nam men duoc tim thaytrên thực vat, trái cây va ngũ cốc cũng có thé sử dung dé làm bánh

Thực phẩm bồ sung: nắm men được xem như là một thành phan trong thực phẩm,

được dùng dé tạo vị umami vì trong nắm men thường chứa axit glutamic tự đo

Men vi sinh: nam men S boulardii được dùng dé sản xuất chất bồ sung giúp duytrì và phục hồi hệ thực vật tự nhiên trong đường tiêu hóa và có khả năng làm giảm các

6

triệu chứng tiêu chảy cấp tính, giảm kha năng nhiễm trùng do Clostridium difficile.

Xử lý sinh học: S cerevisiae đã được chứng minh có khả năng xử lý sinh học các

chất ô nhiễm độc hại như asen từ nước thải công nghiệp

Nghiên cứu khoa học: một số loài nam men được sử dụng rộng rãi tronng ditruyền học do nam men là tế bao nhân thực đơn giản, rất thích hợp phục vụ trong quárình nghiên cứu cơ bản của tế bào, phân tích đi truyền hay các nghiên cứu liên qua đếnprotein, trong đó S cerevisiae và S pombe là hai loài tiêu biểu thường được ứng dụngnhiều nhất

2.5 Giới thiệu về bệnh thán thư trên xoài

Xoài (Mangifera indica L.) là một trong những loại trái cây nhiệt đới mang lại

giá trị kinh tế cao do trong xoài chứa hàm lượng dinh dưỡng cao, bao gồm vitamin,khoáng chất và chất phytochemical Chính vì thế mà những năm gần đây diện tích trồng

xoài ở nước ta đang ngày càng mở rộng, song song đó thì việc bệnh trên trái xoài sau

khi thu hoạch lại làm giảm đi chất lượng của quả xoài từ đó ảnh hưởng về mặt kinh tế

cho các nước trồng xoài cũng như xuất khẩu xoài Trong đó, bệnh thán thư trên xoài sau

thu hoạch là bệnh phô biến và ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng trái

Bệnh thán thư là có thể làm giảm đến 60% năng suất, cũng như chất lượng củaquả xoài ( Amn và cộng sự, 1997) Bệnh có thể xảy ra nghiêm trọng hơn ở những vùng

có điều kiện khí hậu âm ướt kéo dài

Triệu chứng bệnh thán thư

Trên lá: Trên các lá non, đặc biệt là từ giai đoạn lá màu đồng thiếc đến khi lá cómàu xanh nhạt là lúc lá mẫn cảm nhất với bệnh Lúc nảy các SỢI nam, các bào tử namrat dé bám vào và xâm nhập các lá non nay thông qua các lỗ khí không hoặc các vếtthương do bị rách, bị xây xước Đầu tiên xuất hiện các đốm đen nhỏ rải rác, sau đó cácvết đốm này mở rộng và liên kết với nhau tạo thành những mảng lớn không định hìnhmàu nâu tối Các vết bệnh thường tròn hoặc có góc cạnh theo gân lá, màu sậm khi lá còn

màu đỏ nâu, đến khi lá chuyển sang màu xanh thì vết bệnh có màu nâu, viền màu nâuđậm Khi vết bệnh già có màu trắng xám, gây rách, thủng lá và rụng di Nếu bị nặng,

nhiều vết bệnh liên kết với nhau làm cho lá xoài bị vặn vẹo, xoắn cong

Trên hoa: Cũng như lá, khi các gié hoa còn non, các bào tử bám dính, xâm nhập

và gây hại tạo thành những chấm đen nhỏ rải rác trên trục và nhánh hoa Các chấm nhỏnày mở rộng và liên kết với nhau thành các mảng lớn làm cho các hoa không nở, không

7

thụ phan được Bệnh phát triển mạnh làm rụng hoa, các gié hoa, cành hoa bị thối đen,khô héo và chết.

Trên quả: Ở giai đoạn quả non bệnh thường xuất hiện ở hom của cuống quả Cácvết dom nâu lan rộng khắp vùng đó tạo nên màu nâu đen làm cho quả không lớn đượchoặc gây dị hình méo mó Nếu bệnh phát triển nặng hơn có thê gây rụng quả hàng loạt.Nhiệt độ và âm độ là hai trong những yếu tố chủ yếu ảnh hưởng đến diễn biến của bệnhthan thư trên cây xoài Trong tháng 3 - 4 4m độ cao (trên 80%), trời ấm (nhiệt độ 25 -

26°C) điều kiện để nắm bệnh phát triển mạnh Giai đoạn này ba con cần hết sức déphòng Trong các vườn xoài ít được chăm sóc, hoặc chăm sóc không tốt như bón phân

không cân đối và dư đạm, không cắt tỉa cảnh vô hiệu làm tán lá rậm rạp, thiếu ánh nắngchiếu vào, nên làm tăng âm độ của vườn thì bệnh thường nặng ( Wayne Nishijima,

Trước thu hoạch: dé tránh lây lan bệnh thán thư trên diện tích rộng người dân cần

thu gom, tiêu hủy các bộ phận bị bệnh trên xoài Chọn giống xoài kháng bệnh thán thư,

bón phân cân đối và tạo điều kiện khô thoáng, giảm độ âm của vườn và bao trái khi cây

ra quả, phòng trừ bệnh hai bằng cách phun thuốc bảo vệ thực vật như Copper — B 75WP(hoạt chất Benomyl + Bordeaux + Zineb), Score 250EC (hoạt chất Difenoconaziole),Ridomil Gold 68wp (hoạt chất Metalxyl + Mancozeb),

Sau thu hoạch: ngâm trái trong nước nóng khoảng 51 ° — 55 °C, trong 20 - 30

phút, phương pháp nhiệt hơi, làm lạnh ở 10°C, xử dụng các tia bức xạ gamma,

2.6 Sơ lược về nam Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh than thư

Giới: Fungi

Ngành: Ascomycota

Lớp: Sordariomycetes

Bộ: Incertaesedis Họ: Glomerellaceae Chi: Colletotrichum

Loai: Colletotrichum gloeosporioides

Nam C gloeosporioides là nam gây bệnh than thư phổ biến và nghiêm trọng cho

cây ăn quả nhiệt đới như thanh long, bơ, xoài, đu du, Nam xâm nhập vào quả lúc còn

nhỏ và không biểu hiện bệnh ngay, sau khi thu hoạch thì mầm bệnh sẽ biểu hiện ra và

gây thối quả, ảnh hưởng rất nghiệm trọng trong quá trình bảo quản và xuất khẩu

Đặc điểm hình thái nam C gloeosporioides

Soi nấm: sợi nam C gioeosporioides mảnh, màu trắng, khi quan sát dưới kínhhiển vi sợi nam không mau, có vách ngăn, phân nhánh, trong sợi nam có chứa nhữnggiọt dầu, khi già sợi nấm chuyển sang màu nâu sậm Tản nam: có mau trắng hay trang

xám, có vòng tròn đồng tâm Bao tử: nấm C gloeosporioides có bào tử hình trụ, có haiđầu tròn hay một dau tròn một đầu nhọn, không màu, kích thước bào tử 9 — 24 x 3 — 4,5

um Giác bám: có màu nâu đen, hình trứng ngược, hình tròn, hình chùy hay hình dạng

bat định, kích thước 6 — 20 x 4— 12 pm

Nam C gloeosporioides sinh sản vô tinh bằng bao tử đính phát triển từ đĩa cành

Đĩa cành có hình đĩa, có hoặc không có gai, gai có màu nâu đen, không phân nhánh, có hoặc không có vách ngăn, sự hiện diện của gai phụ thuộc vào độ âm của môi trường.

2.7 Những nghiên cứu trong và ngoài nước

2.7.1 Các nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, hiện nay không có nhiều nghiên cứu về nắm men trên xoài, các

nghiên cứu về nam men đa phần đều về lĩnh vực lên men rượu từ các trái cây khác nhau

Nghiên cứu về nấm men lên men từ dịch xoài Cát Chu (Trần Thị Kim Ngân,2013) Năm 2017, Nguyễn Thị Thanh Hải và cộng sự đã nghiên cứu lên men dịch xoài;Nghiên cứu của Lưu Chí Thắng (2020) về phân lập một số loại nắm men có khả năngtăng sinh mạnh dé sản xuất bánh mì Tuy nhiên, hiện vẫn chưa có nghiên cứu nao ghinhận về việc sử dụng nam men dé đối kháng với nam Colletotrichum sp gây bệnh than

thư ở Việt Nam.

2.7.2 Các nghiên cứu ngoài nước

Năm 2018, Carlos Alberto Tuão Gava và cộng sự đã phân lập và chứng minh

nam Pichia kudriavzevii và hai chủng Saccharomyces sp có khả năng kiểm soát bệnhthan thư do nam Colletotrichum gloeosporioides gây ra

Năm 2019, Mauricio Ramirez — Castrillon và cộng sự đã nghiên cứu về mức độ

hiện diện của nấm men trong thịt quả xoài va phân lập được 11 loài nấm men chi

Hanseniaspora, Candida, Clavispora, Meyerozyma, Aureobasidium va Pichia.

Nam 2020, Wilasinee Konsue và cộng su đã nghiên cứu các biện pháp kiểm soát

sinh học đối với bệnh thán thư trên xoài sau thu hoạch bằng nắm men, kết quả cho thấy

loài Papiliotrema aspenensis có khả nang ức chế sự phat triển của nấm Colletotrichum

gloeosporioides gay bệnh than thư.

Năm 2021, Adikshita Sharma và cộng sự đã nghiên cứu hiệu lực đối khang của

nam men đối với nắm Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh than thư trên xoài vàghi nhận được nam Pichia anomala có khả năng ức chế tác nhân gây bệnh than thư

10

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Hóa chất phân lập nắm men

Môi trường Christensen.

Môi trường Simmons citrate.

Hoa chat tách chiết DNA nắm men

Lysis buffer (50 mM Tris HCI; 50 mM EDTA; 3% SDS; 1% f3 - mercaptoethanol)

pH 8.0.

Hỗn hop Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol PCI (25:24:1).

Hỗn hợp Chloroform: Isoamyl alcohol CI (24:1).

Isopropanol.

Ethanol 70%.

Dung dich TE (10 mM Tris HCl; 1 mM EDTA; pH 8.0).

11

Hoá chất dùng cho PCR

dNTPs (dATP; dTTP; dGTP; dCTP).

MgCl.

10X PCR buffer.

Taq DNA polymerase.

Hoá chat dùng trong điện di gel agarose

Agarose dạng bột.

Dung dịch TAE 0,5%.

Dung dịch Loading Dye, Gelred.

Thang DNA 1 Kb và thang 100 bp.

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phân lập và định danh nắm Colletotrichum gloeosporioides dựa vào đặc điểm

hình thái

3.3.1.1 Phân lập nắm Colletotrichum gloeosporioides trên trái xoài

Thu các mẫu xoài có các triệu chứng của bệnh than thư như có vết đốm đen nhở

hoặc to, có thé bị lõm vào trên vỏ, dem rủa sạch dưới vòi nước, thu vỏ xoài có chứa phan

vỏ nguyên lẫn phan bệnh, khử trùng bằng cồn 70 °, rửa lại với nước 2 - 3 lần, sau đó sửdụng dao cắt mẫu dé phân lập, mẫu lay giữa phần mô khỏe và mô bệnh, phơi mẫu từ 20

— 30 phút sau đó cấy trên môi trường WA, theo đõi mẫu cấy đến khi hình thành các sợi

nam đồng nhất

Sử dụng que cấy truyền cắt giữa phần môi trường và đỉnh sinh trưởng của nắm,

cấy truyền sang môi trường PGA dé nắm phát triển, ủ ở nhiệt độ phòng, từ 12 — 14 ngày,

quan sát hình thái tản nam và xem tiêu ban nam dé xác định hình thái bao tử, đĩa cành,giác bám ở vật kính 40X Dựa vào các đặc điểm trên dé định danh dòng nam

3.3.1.2 Định danh nắm Colletotrichum gloeosporioides dựa vào đặc điểm hình thái

Mẫu Colletotrichum sp sau khi phân lập thì làm tiêu ban dé quan sát về hìnhdạng và kích thước bao tử, đặc điểm hình thái của giác bám, quan sat 6 bào tử có gaihay không gai trên kính hiển vi, quan sát hình thái, màu sắc giọt dầu trên kính soi nổinếu có, quan sát hình thái tan nam va sợi nam dựa theo khóa định danh của Sutton

(1980), Swart (1999).

12

3.3.2 Phân lập và định danh nắm men dựa vào đặc điểm hình thái và các phản ứng

sinh hoá

3.3.2.1 Phân lập các dòng nắm men có trên vỏ xoài Cát hòa Lộc

Các mẫu xoài sau khi thu thập được phân lập theo phương pháp tạo khuan lạc

đơn ( Nguyễn Văn Minh và Dương Nhật Linh, 2008)

Thu thập và xử lý mẫu xoài Cát Hòa Lộc

Thu thập và xử ly mẫu: loại bỏ bụi ban và khử trùng bề mặt vỏ xoải

Tăng sinh: trong môi trường YPG trong 48 giờ đẻ nấm men phát triển

Cay trang: pha loãng mẫu và cấy trang ở nồng độ 101, 10°, 105 trên môi trườngYPGA và ủ mẫu trong 2 ngày.

Cay ria: chọn khuẩn lạc nằm riêng lẻ, cấy ria tạo dòng thuần

3.3.2.2 Định danh nắm men dựa vào đặc điểm hình thái và thực hiện các phản ứngsinh hóa các dong nắm men

Định danh dựa vào các đặc điểm hình thái: quan sát hình thái khuẩn lạc đơn trênkính soi nồi, cũng như quan sát hình thái, kích thước tế bào, hình thức sinh sản nắm men

và tiễn hành định danh dựa theo Kurtzman và cộng sự (2011)

Định danh dựa vảo các phản ứng sinh hóa

Phan ứng lên men đường Glucose, đường Sucrose và đường Lactose: lắc tăngsinh khối các dòng nắm men trong môi trường YPG ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ HútIml dung dich tăng sinh nấm men vào ống nghiệm có chứa sẵn 9ml dung dịch đường(Glucose 2%, Sucrose 2% và Lactose 2%) và ống Durham (đã được khử trùng ở 115 °Ctrong 15 phút) và ủ lên men Quan sát và đo cột khí trong ống Durham bắt đầu từ sau 2giờ cho đến thấy cột khí đầy, mỗi thời điểm đo cách nhau 2 giờ

là

Phản ứng Citrate: lấy khuẩn lạc đơn của các dòng nắm men cấy vào ống nghiệm

chứa môi trường Citrate theo đường ziczac rồi quan sát kết qua trong 48 giờ

Phản ứng ure: Tăng sinh các dòng nam men trong môi trường YPG ở nhiệt

độ phòng trong vòng 24 giờ Hút 0,5 ml dịch tăng sinh nam men vào ống nghiệm có

chứa sẵn 4,5 ml môi trường Christensen (đã được khử trùng ở 115 °C trong 15 phút)

và ủ ở 30°C trong vòng 1 tuần

3.3.3 Đánh giá khả năng đối kháng giữa các dòng nắm men và nắm Colletotrichum

gloeosporioides gay bệnh than thư trên trái xoài trong phòng thí nghiệm

Thực hiện đánh giá đối kháng giữa các dòng nấm men và nam Colletotrichum

gloeosporioides phan lập trên môi trường PGA (Potato 200g/L, D - Glucose 20 g/L, agar

20g/L) trong phòng thi nghiệm dé chon dòng nam men mạnh nhất của từng nhóm cókhả năng đối kháng với nam Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh

Cách bé trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn nguyên

tố, gồm 3 lần lặp lại, trên môi trường PGA, nghiệm thức đối chứng chỉ có nam

Colletotrichum gloeosporioides Các dòng nam men được cấy ria hai đường thang đốixứng nhau và cách thành đĩa 1,5cm và đem ủ trong 48 giờ cho nắm men phát triển, sau

đó cay nam Colletotrichum gloeosporioides vào giữa hai đường ria nam men

Thời gian theo đõi lần lượt là sau 2, 4, 6, 8, 10 ngày sau khi cấy nấm

Colletotrichum gloeosporioides.

Chỉ tiêu theo dõi là bán kính nắm Colletotrichum gloeosporioides từ đó tính tỷ lệ

đối kháng của các dòng nắm men theo công thức:

H= ((R1-R2)/R1) x 100

Ri: bán kính nắm Colletotrichum gloeosporioides trên đĩa đối chứng (cm)

Ra: bán kính nắm Colletotrichum gloeosporioides trên đĩa đối kháng với nam men (cm)

Thực hiện phản ứng PCR

Ly trích DNA

Bước 1: Lay tơ nam (dùng dau tip) cho vào eppendoft, thêm 200 uL lysis bufferrồi nghiền Tiếp tục thêm 400 uL và nghiền tiếp

Bước 2: U ở 65 °C trong 1 giờ, cứ 15 phút đảo nhẹ eppendoft

Bước 3: Thêm 600 mL dung dich Phenol/chloroform/isoamyl alcohol PCI

(25:24:1), vortex dé trộn đều dung dich

14

Bước 4: Ly tâm 12000 x g trong 5 phút ở 25 °C.

Bước 5: Chuyển dich nổi vào expendoft mới (500 HL)

Bước 6: Thêm 500 pL chloroform/1soamyl alcohol CI (24:1), lac nhe

Bước 7: Ly tâm 12000 x g trong 5 phút ở 25 °C.

Bước 8: Hút dich nỗi vào expendoft mới (400 pL)

Bước 9: Thêm 0,03 V (12 nL) Sodium acetate 3M và 1V (400 pL) Isopropanol.

Tron đều bang micropipette (dao nhẹ), ủ ở 20 °C trong 1 giờ

Bước 10: Ly tâm 13000 x g trong 10 phút.

Bước 11: Loại bỏ dịch nổi, thêm 400 pL Ethanol 70% lạnh Ly tâm 13000 x gtrong 3 phút Loại bỏ dung dịch Thực hiện 2 lần

Bước 12: Làm khô DNA kết tủa, hòa tan DNA với 50 uL TE 1X, bảo quản -20°C

Thực hiện phản ứng PCR

Chuẩn bị gel agarose 1,5%: Cân 0,75 gram agarose cho vào 50 mL dung dịch

TAE 0,5X, lắc đều và đun hòa tan trong lò vi sóng, dé nguội đến khoảng 60 °C rồi đồvào khuôn va gắn lược dé tạo các giếng nap mau Sau khi bản gel đã đông cứng, đặt ban

gel vào buồng điện di, đồ dung dịch đệm TAE 0,5X ngập ban gel khoảng 1 — 2 mm

Bảng 3.1 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

Bước Nhiệt độ (°C) Thời gian Số chu kỳ

Tiên biến tính 95 5 phút 1

Bién tinh 95 30 giây

Bắt cặp

52 1 phút 35 (NL1/NL4)

Kéo dải 72 1 phút

Hậu kéo dai 72 10 phút |

Tiến hành: Hút sản phẩm PCR trộn đều với dung dịch nap mẫu (loading dye) vànạp vào giếng Đồng thời nạp thang chuân DNA vào giếng để kiểm tra kích thước cácđoạn DNA Chạy điện di ở hiệu điện thế 100V trong thời gian 30 phút

Sản pham PCR sẽ được gửi giải trình tự tại công ty Nam Khoa Biotek

3.4 Xử lý số liệu

Tổng hợp và xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel 2019 và phân tíchANOVA 1 yếu tố bằng phần mềm minitab 16

lŠ

CHUONG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN

4.1 Phan lập và định danh nam Colletotrichum gloeosporioides dựa vào đặc diém

hình thái

4.1.1 Phần lập Colletotrichum gloeosporioides gầy bệnh trên trái xoài sau thu hoạch

Chọn trái xoài Cát Hòa Lộc có những đốm nâu đen nhỏ hay các đóm đen to, trònhoặc bất định có quang màu xanh vàng dé tiến hành phân lập Xoài được đem di xử lý

vô trùng, sau đó đem cấy trên môi trường WA, ủ trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng, sau đó

Hình 4.1 Mau xoài bệnh thu thập được

4.1.2 Định danh nắm Collletotrichum gloeosporioides dựa vào đặc điểm hình thai

Nắm được cấy thuần trên môi trường PGA, ủ ở nhiệt độ phòng từ 10 — 14 ngày,làm tiêu bản quan sát dưới vật kính 40X dé quan sát hình thái và kích thước bao tử Kết

quả xác định được loài nam Colletotrichum gây bệnh than thư trên xoài là nam

Collletotrichum gloeosporioides, nam có bào tử không màu, hình trụ, hai đầu tròn hoặcmột đầu tròn một đầu nhọn, giác bám nảy mam sau 24 giờ ủ, giác bám có hình trứng

ngược, hình chùy hay hơi tròn hay hình dạng không xác định, có màu nâu đen Các đặcđiểm về tản nam, bảo tử và giác bám của nam Collefotrichum được thê hiện qua Hình

4.2 và Bảng 4.1 Các kết quả này đều phù hợp với khóa phân loại của Sutton (1980) và

Swart (1999).

16